我们介绍了直接培养、直接暴露培养和暴露培养三种方法，用于评估 体外 可降解植入材料的细胞相容性。这些 体外 方法模拟不同 在体 细胞-植入物相互作用，并可用于研究多种可生物降解材料。
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本文内容
摘要
摘要
在过去的几十年中，可生物降解材料已被广泛研究用于骨科、牙科和颅颌面植入物等生物医学应用。为了筛选适用于生物医学领域的可生物降解材料，有必要从以下方面对这些材料进行评估： 体外 细胞反应、细胞相容性与细胞毒性。国际标准化组织（ISO）标准已广泛应用于生物材料的评价。然而，大多数ISO标准最初是为评估非降解材料的细胞毒性而建立的，因此在筛选可降解材料时具有局限性。
本文介绍并讨论了三种不同的培养方法，即直接培养法、直接暴露培养法和暴露培养法，用于评估 体外 可降解植入材料（包括可降解聚合物、陶瓷、金属及其复合材料）与不同类型细胞之间的细胞相容性。研究表明，培养方法会影响细胞对可降解材料的反应，因为材料的动态降解会在界面及局部微环境中引起时空差异。具体而言，直接培养法用于揭示直接接种在植入物表面的细胞的反应；直接接触培养法用于阐明已形成的宿主细胞与植入物发生接触时的反应；而暴露培养法用于评估未与植入物直接接触、但受植入物降解所引起的局部环境变化影响的已形成宿主细胞的反应。
本文提供了这三种培养方法用于研究的示例 体外 可降解植入材料的细胞相容性及其与骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）的相互作用。同时描述了细胞的分离、传代、培养、接种、固定、染色、表征，以及培养后培养基和材料的分析方法。 体外 本文所述方法模拟了不同的情景 体内 环境，拓展了其适用性和相关性 体外 不同生物材料在多种生物医学应用中的细胞相容性测试
引言
几十年来，可生物降解材料已在骨科1,2、牙科3,4和颅颌面5等生物医学领域得到广泛研究和应用。与永久性植入物和材料不同，可生物降解的金属、陶瓷、聚合物及其复合材料可在生理环境中通过不同的化学反应随时间逐渐降解。例如，镁（Mg）合金1,6,7和锌（Zn）合金8,9等可生物降解金属是骨固定装置的有前景材料。其可生物降解性可避免骨骼愈合后二次手术取出植入物的需要。可生物降解陶瓷如磷酸钙骨水泥（CPCs）在经皮椎体后凸成形术治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折方面展现出令人期待的应用潜力10。CPCs可为骨折的椎体提供机械支撑，并在骨折愈合后逐渐降解。
可生物降解的聚合物，例如某些多糖和聚酯，也已被广泛探索用于生物医学应用。例如，壳聚糖水凝胶作为一种可生物降解的多糖....
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方案
本方案已获得加州大学河滨分校（UCR）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，用于细胞和组织的采集。视频中以一只12周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠为例进行展示，但更推荐使用较年轻的雌性或雄性大鼠。
1. 细胞培养准备
注意：本文所述的三种培养方法通常适用于不同类型的贴壁细胞。此处以从断奶大鼠中分离的骨髓间充质干细胞（BMSCs）为例，介绍细胞培养的制备过程。根据特定医学应用的相关性，可选用不同类型的细胞，包括从动物或人类供体获取的原代细胞，以及来自细胞/组织库的细胞系。
- 从断奶大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）
注意：图1中的示意图展示了从断奶大鼠中分离BMSCs的步骤。- 通过吸入CO2处死Sprague Dawley（SD）大鼠。
- 去除皮肤、肌肉和结缔组织，解剖出已处死大鼠的股骨。将股骨放入含有细胞培养基的15 mL锥形管（聚丙烯）中，并将锥形管置于冰上，直至进行细胞提取。
注意：胫骨也可用于分离BMSCs。细胞培养基为添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。 - 将骨骼转移至生物安全柜中的....
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结果
图4展示了使用不同培养方法时，在直接接触和间接接触条件下BMSCs的代表性荧光图像。图4A、B显示了BMSCs在与ZC21镁合金直接共培养24小时后，在直接接触和间接接触条件下的细胞状态1。ZC21合金由97.5 wt% 镁、2 wt% 锌和0.5 wt% 钙组成。未与ZC21合金样品直接接触的细胞比与样品直接接触的细胞铺展更好。如图4C、D所示，在经Fe3+离子交联的透明质酸（HyA）水凝胶直接暴露培养24小时后，直接接触和间接接触条件下的细胞均表现出正常形态。然而，间接接触条件下的细胞数量低于直接接触条件下的细胞数量33。另一项研究报道了ZSr41合金（ф = 1.1 mm）降解产物在24小时暴露培养后对BMSCs的影响19。.......
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讨论
可采用不同的细胞培养方法来评估 体外 生物材料在不同应用方面的细胞相容性 在体. 本文展示了三种 体外 培养方法，即直接培养、直接暴露培养和暴露培养，以模拟不同的 体内 可降解植入材料在人体内应用的各种场景。直接培养法主要用于评估新接种细胞在植入材料表面及其周围直接黏附和生长的行为。直接暴露培养法可模拟 体内 植入材料与已形成的细胞和组织直接接触的情况。暴露培养法可用于展示植入材料的降解产物以及局部微环境的变化如何影响那些未与植入材料直接接触的已形成细胞和组织。
在直接培养中，评估在直接和间接接触条件下新接种的细胞。在直接暴露培养中，可在直接和间接接触条件下评估已建立的细胞。在暴露培养中，仅能评估在间接接触条件下的已建立细胞。直接培养中，在直接接触条件下的新接种细胞会受到材料特性以及材料引起的培养基变化的影响，例如离子浓度和pH值的变化。
上述材料特性可能包括表面形貌、亲水性、表面自由能、刚度和成分。在直接培养法中处于间接接触条件下的新接.......
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致谢
作者感谢美国国家科学基金会（NSF CBET 项目 1512764 和 NSF PIRE 1545852）、美国国立卫生研究院（NIH NIDCR 1R03DE028631）、加州大学（UC）校长教职发展奖学金、研究委员会种子基金（Huinan Liu）以及加州大学河滨分校博士论文研究基金（Jiajia Lin）提供的经费支持。作者感谢加州大学河滨分校先进显微镜与微分析中心（CFAMM）提供扫描电子显微镜/能谱仪（SEM/EDS）的使用机会，并感谢Perry Cheung博士提供X射线衍射仪（XRD）的使用支持。作者还感谢Thanh Vy Nguyen和Queenie Xu在部分编辑工作中的协助。作者同时感谢Cindy Lee为视频录制了解说旁白。本文所表达的观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定代表美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的立场。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 血清移液管 | VWR | 490019-704 | |
| 12 孔组织培养处理板 | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL 圆锥形管（聚丙烯） | VWR | 89039-666 | |
| 18 G 针头 | BD | 305196 | |
| 25½ G 针头 | BD | 305122 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI） | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL 圆锥形管（聚丙烯） | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm 尼龙滤网 | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Fluor 488-鬼笔环肽 | Life technologies | A12379 | |
| 生物安全柜 | LABCONCO | II 级，A2 型 | |
| 离心机 | Eppendorf | 转子 F-35-6-30，Centrifuge5430 | |
| 透明熔融石英圆形培养皿 | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 培养箱 | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell 冷冻容器 | Corning | 432000 | 设计用于调节降温速率的泡沫容器 |
| 冻存管 | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM） | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX 分析软件 | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| 能量色散X射线光谱（EDX） | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | Eclipse Ti | |
| 甲醛 | VWR | 100496-496 | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院和威斯康星大学光学与计算仪器实验室（LOCI） | ||
| 电感耦合等离子体 光发射光谱法（ICP-OES） | PerkinElmer | Optima 8000 | |
| 光学显微镜 | VWR | VistaVision | |
| 青霉素/链霉素（P/S） | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH 计 | VWR | 型号 SB70P | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | VWR | 97062-730 | |
| 扫描电子显微镜（SEM） | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| 手术刀片 | VWR | 76353-728 | |
| 组织培养瓶 | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell 小室 | Corning | 3460 | |
| 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（胰蛋白酶-EDTA） | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X射线衍射仪（XRD） | PANalytical | Empyrean Series 2 |
参考文献
- Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
- Xu, C., et al.
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重印与许可
