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利用PCR板深孔微孔板装置生成更多的细菌生物膜生物量

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DOI：

10.3791/63069

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2022年4月22日

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1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases, University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada

本文内容

摘要

本方案介绍了利用自组装深孔PCR板装置进行生物膜生长及生物量测定的方法，适用于高通量96孔带钉盖静态生物膜筛选。

摘要

细菌生物膜难以通过常规抗菌手段从表面彻底清除。高通量96孔微孔板方法常用于培养细菌生物膜，以快速进行抗菌药物敏感性测试，并计算最小生物膜清除浓度（MBEC）值。标准生物膜检测装置由带聚苯乙烯 peg 的盖子与96孔微孔板配合组成，适用于测定生物膜生物量和MBEC值，但此类装置受限于peg表面可用于生物量积累的面积以及成本。本文介绍一种利用自组装聚丙烯96孔深孔PCR板带peg盖装置培养生物膜的实验方案 大肠杆菌 BW25113 和 铜绿假单胞菌 PAO1 生物膜。本文描述了利用结晶紫生物量染色法和最低生物膜清除浓度（MBEC）测定法，对各菌种在标准孔板和深孔板装置上形成的24小时生物膜进行比较。深孔板装置较大的表面积使两种菌种的总体生物膜形成量预期增加了2至4倍。 P. aeruginosa 显著形成更多的生物量/毫米2 与标准装置相比，位于深孔钉上。 E. coli 生物量更大/mm2 与深孔装置相比，在标准聚苯乙烯装置上. 使用次氯酸钠（漂白剂）或苯扎氯铵（BZK）等消毒剂进行的生物膜清除实验表明，这两种化合物均可消除 E. coli 和 P. aeruginosa 两种装置中的生物膜均被清除，但最低生物膜清除浓度（MBEC）不同。苯扎氯铵（BZK）对生物膜的清除效果表现出可变性 E. coli 然而，不同装置间的MBEC值存在差异，但漂白剂对两种物种和装置均表现出可重复的MBEC值。本研究提供了一种高通量深孔法，可在聚丙烯装置上培养更大量生物膜，适用于需要较多静态生物膜的后续研究。

引言

Pseudomonas aeruginosa 和 Escherichia coli 是革兰氏阴性变形菌，因其能够形成称为生物膜的固着、表面附着的细胞群落而被广泛研究1。当以生物膜形式生长时，这两个物种均可分泌主要由不同多糖和蛋白质组成的胞外聚合物基质（EPS），其中还可能包含胞外DNA和/或脂类，从而在恶劣、营养受限的环境中提供额外的细胞保护并增强存活能力2,3。这两种细菌的生物膜生理特性及形成机制具有重要的临床意义，因为在加拿大，它们是医院患者血液、尿路和肺部感染中最常分离出的耐药病原体中的前五位4,5。还需注意的是，据估计，由这些细菌物种引起的慢性和反复性感染中，近80%与生物膜相关6。由于分泌的EPS物质以及代谢活性降低7,8，一旦在植入式医疗设备表面、瘢痕组织或囊性纤维化患者的肺部等部位形成生物膜，便更难根除9,10，进一步加剧其对抗菌药物的耐受性。

细菌生物膜的顽固生长特性常使其对抑菌和/或杀菌作用更具抗性2,9因此，建立 体外 研究细菌生物膜抗微生物清除的方法对于选择有效化合物以根除细菌在医用塑料（如留置导管）和医疗器械植入物上形成感染时的生物膜至关重要。大多数快速 体外 生物膜抗微生物清除培养方法检测生物膜生长作为一种 "静态" 生物膜培养而非 "连续的" 培养物，在相同培养基中于较短时间（24–96 小时）内监测细菌从早期到晚期生物膜形成的静态生长过程。连续生物膜方法因需在允许培养基持续流动和更换的装置中进行更长时间的培养，且重复次数较少，故不适用于快速分析。11由于维持和建立连续生物膜所需的时间和精力较多，静态 体外 生物膜是最常用的形式，因其可轻松适配于塑料96孔微孔板中进行高通量抗菌药物敏感性测试实验，而无需使用复杂的流动腔系统，后者会限制实验通量 同时检测的培养物数量 12,13. 最简单的静态 "在孔内" 生物膜微孔板检测使用标准的聚苯乙烯或乙烯基材料（300 µL容量）微孔板来测量每个孔的侧壁和底部的生物膜形成情况，通常也在气液界面处形成环状生物膜。在去除培养基液体并清洗生物膜后，通过染色附着在孔壁上的沉积生物量来测定孔内细菌生物膜的形成。12,13这些检测方法因成本较低而广受欢迎，但由于其固有的设计缺陷，常存在重复性问题，因为沉积的生物膜在细胞回收和生物膜染色所需的冲洗过程中容易受到损伤或损失。11,14.

为了减少生物膜的损失，标准商用生物膜装置在传统的孔内生物膜微孔板设计基础上进行了改进，通过在标准96孔板上加装可插入的96孔聚苯乙烯带钉盖板，本文中称之为“标准生物膜装置”。带钉盖板的引入扩展了每个微孔板孔内的可用表面积，从而增强了表面附着能力及生物膜生物量的形成15,16。当将带钉盖板插入含有药物或不同生长条件挑战的新微孔板中时，标准生物膜带钉盖板装置可实现更高的生物膜回收率，并便于移除和冲洗，进而用于后续的抗菌生物膜敏感性及清除能力检测。与孔内生物膜微孔板技术类似，移除并清洗后的带钉盖板所获得的材料可用于细胞存活率检测和生物膜生物量染色，通常使用结晶紫（CV）染料溶液进行染色17,18,19。标准生物膜装置也适用于生物膜抗菌敏感性的高通量筛选。这类检测通过两种方式监测生物膜生长抑制情况：1）在细胞生长初期加入抗菌剂，可测定最小生物膜抑制浓度（MBIC）值；2）在钉状结构上培养24小时形成成熟生物膜后，再暴露于抗菌剂中，可测定最小生物膜清除浓度（MBEC）值17,20。与孔内生物膜微孔板装置类似，标准生物膜装置也存在一些明显局限性，例如单个装置成本较高、不可高压灭菌，且由于采用聚苯乙烯材料，对化学溶剂的耐受性较差。此外，标准生物膜装置的单位钉状结构表面积较低，限制了每孔的最大工作体积为200 µL。这些因素使得标准生物膜装置在需要大量生物膜样本的高通量研究中应用更具挑战性。

本文介绍了我们实验室开发的一种静态生物膜 pegged-lid 96 孔方法，该方法使用市售的聚丙烯半裙边 0.5 mL 96 孔 PCR 板，配合深孔 96 孔微孔板（其孔深超过标准板）使用材料表）。这些组装后的装置最大工作体积为750 µL 当用于培养生物膜时（以下简称 "深孔生物膜装置"使用这些深孔生物膜装置的优势在于，与标准生物膜装置相比成本更低，可通过高压灭菌进行消毒，并且由于较大的外部PCR板增加了生物膜形成的表面积 "管/柱"通过该方法，我们展示了这些装置在培养和表征生物膜生物量方面的应用 大肠杆菌 BW25113 和 P. aeruginosa PAO1。描述了使用生物膜清除实验测定MBEC值的方法 季铵盐类消毒剂苯扎氯铵（BZK）和次氯酸钠（漂白剂）抗菌剂。选择消毒剂/杀菌剂BZK 因为该化合物常用于抑制污染表面的生物膜，但据报道其对已充分形成的生物膜清除效果较差21次氯酸钠（漂白剂） 是一种高效清除成熟生物膜的化学试剂，是化学消毒的主要手段 22两种消毒剂为每种生物膜装置的最小生物膜清除浓度（MBEC）值提供了有效的比较。21本文总结了使用结晶紫染色法和生物膜清除实验进行该生物膜装置评估以测定最小生物膜清除浓度（MBEC）的实验方案。文中包含一个协议流程图，以简要概述这些方法的操作流程。图1).

方案

1. 生物膜生长的无菌培养物制备（第0-1天）

  1. 在第0天，将所需测试的细菌菌株（来自甘油或二甲基亚砜（DMSO）保存的冷冻菌种）直接划线接种至含有相应抗菌剂筛选的营养琼脂平板上。将平板置于菌株生长的最佳温度（37 °C）下培养18–22小时。
  2. 次日（第1天），从琼脂平板上挑取单菌落，接种于5 mL适宜生长条件的液体培养基中。该培养物将作为第2天生物膜实验装置的起始接种物（见步骤2.2；图1）。
    注意：本研究中，E. coli K-12 BW21153 和 P. aeruginosa PAO1 在Luria-Bertani（LB）培养基中于37 °C、180转/分钟（rpm）振荡条件下培养18小时。
    1. 由于 pegged lid 装置上生物膜生物量形成存在统计学变异性，需制备至少3个独立培养的菌株，以获得用于生物膜定量的生物学重复样本。

2. 平板的制备与接种（第2天）

  1. 在已灭菌的96孔聚丙烯板（每孔1.1 mL）的外周孔中，每孔加入750 µL无菌水图 2A）。向阴性对照孔（未接种的培养基孔；B列）加入750 µL培养基，其余各孔加入675 µL培养基。
    注意：上述步骤 2.1 及以下步骤列出 深孔生物膜装置所需的适当体积。若使用标准生物膜装置，则体积应作如下调整：接种培养物由75 µL调整为20 µL；生长培养基由675 µL调整为180 µL；无菌水/生长培养基由750 µL调整为200 µL；结晶紫染色液/乙酸/洗涤液由800 µL调整为210 µL。此外，对于下文步骤3.6，应在500 nm处测定吸光度（A550 nm) 使用标准生物膜装置微孔板时，混匀后可直接在聚苯乙烯微孔板中读数。
  2. 使用第1天的过夜培养物，将培养物在600 nm处的光密度（OD600 nm=1.0 或 0.5-1 麦氏单位
  3. 在试管或96孔深孔微孔板中对每种标准化培养物进行10倍系列稀释，直至10-3 稀释度达到。
  4. 接种含有培养基的孔，如图所示 图2B 使用75 µL的1 x 10-3 稀释培养物，使孔内细菌最终稀释度为10-4.
  5. 将一个已灭菌的PCR板（带插脚的盖子）小心插入已接种的深孔板中。将板置于最佳菌株培养条件下（37 °C），在湿度为50–60%的摇床培养箱中以最大160 rpm振荡培养24 h。

3. 使用结晶紫染色法测定装置中生物膜生物量（第3天）

  1. 无菌操作下将每个装置的带钉盖取出，并将其插入已准备好的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）深孔板中（每孔含800 µL PBS），浸泡30秒以去除浮游细胞。
  2. 进行生物膜结晶紫（CV）染色时，将带钉的PCR板盖转移至另一新板中（每孔含800 µL 0.1% (w/v) CV水溶液），染色5分钟。
  3. 将带钉盖放入含800 µL/孔无菌PBS的深孔板中漂洗，以去除多余染料。随后将板置于生物安全柜中，钉面向上，静置干燥10分钟。
  4. 将干燥后的PCR板盖转移至另一含有800 µL/孔30% (v/v) 乙酸的板中，脱色5分钟。
  5. 取下脱色后的PCR带钉盖，用移液器充分混匀脱色液。取200 µL溶液转移至标准96孔微孔板中，在紫外（UV）/可见光（Vis）微孔板读数仪中测定550 nm波长处的吸光度（A550nm）。
  6. 根据测得的A550nm值，从每个生物膜样品的A550nm值中减去空白对照（阴性对照）的平均A550nm值。对每组扣除空白后的生物膜样品A550nm值进行平均，代表样本的生物学重复。

4. 使用抗菌剂处理生物膜以计算其24小时抗菌MBEC值（第3天）

  1. 用水配制抗菌剂储备液，其浓度为拟测试最高抗菌剂浓度的两倍（2x）。
  2. 将抗菌剂储备液在2倍浓度的培养基中进行两倍系列稀释，共制备8个不同浓度的抗菌剂溶液。
  3. 如图2B所示，向灭菌深孔板的外周孔中每孔加入750 µL无菌水；向板的B列（阴性对照；无细菌）和C列（阳性对照；无抗菌剂暴露）每孔加入750 µL培养基；其余各孔按图2B所示加入750 µL/孔的抗菌剂稀释系列溶液。
  4. 按照步骤3.1所述方法取出并冲洗带针盖，随后将其转移至抗菌处理板中。
  5. 将板置于适宜菌株生长条件下，于目标暴露时间段内进行振荡培养（最高160 rpm）。

5. 从带插销盖子中回收生物膜生物量（第4天）

  1. 移除经抗菌剂处理的带钉盖子，并按照步骤 3.1 所述进行冲洗。将带钉盖子转移至深孔板中，内孔每孔加入 750 µL 恢复培养基，外孔每孔加入 750 µL 无菌 dH2O。
    1. 配制 70 mL 恢复培养基：在无菌瓶中混合 35 mL 2 倍浓缩 LB 培养基、0.7 mL 100% 吐温-20、3.5 mL 20 倍浓缩通用中和液以及 30.8 mL 无菌 dH2O。
    2. 配制 20 倍浓缩通用中和液：将 1.0 g L-组氨酸、1.0 g L-半胱氨酸和 2.0 g 还原型谷胱甘肽溶于 dH2O 中，定容至 20 mL。经 0.2 µm 滤膜过滤除菌后，于 4 °C 保存。
  2. 将步骤 5.1 中的装置放入置于超声水浴中的次级容器内。超声处理装置 30 分钟，使生物膜从钉上脱落并进入恢复培养基中。
  3. 超声处理后，取出带钉盖子，并用无菌平板盖盖住深孔恢复培养基板。带钉盖子可丢弃。
  4. 将步骤 5.3 中含恢复培养基的平板置于菌株最适生长条件下，过夜培养（16–18 h）。

6. 装置 MBEC 值的测定（第 5 天）

  1. 第二天，从5.4步骤中孵育的深孔板的每个孔中转移200 µL至新的96孔微孔板。测定OD600 nm 使用紫外/可见光微孔板读板仪检测每孔的吸光度。
  2. 减去阴性对照（未接种空白样）的OD值600 nm 每个含生物膜的样本孔中的数值。
  3. 使用 OD 计算各样本的 MBEC 值600 nm 值，其中 MBEC 值是指产生最低光密度（OD）的最低抗菌浓度600 nm 特定抗菌处理的物种/菌株样本的数值（与未接种的对照组无法区分）。

结果

本研究旨在提供一种利用深孔生物膜装置进行大体积、高通量（96孔）、静态生物膜检测的方法。本文中，我们将一种自制的半裙边PCR板插入深孔微孔板所构成的装置（称为深孔装置）与常用的标准化生物膜 pegged lid 装置进行比较，以评估两者形成静态生物膜的能力。采用结晶紫（CV）染色法测定生物量，并通过生物膜根除浓度测定（MBEC）评估两种装置的生物膜形成能力。

为比较不同物种在各装置上形成的生物膜，我们评估了所形成的生物膜生物量 E. coli BW25113 和 P. aeruginosa 采用结晶紫染色法检测PAO1生物膜17尽管CV染色通常被报道为A550 nm 由于各装置的生长体积及其可用表面积存在差异，我们将CV染色A的数值进行了转换550 nm 将数值转换为溶液中的摩尔CV浓度。摩尔CV浓度考虑了每种装置的体积差异，从而能够比较代表从各装置回收的生物量的CV浓度。结果表明，两种物种在深孔生物膜装置上产生的生物量均显著更多（2.1倍） E. coli；4.1 倍 P. aeruginosa）与标准生物膜装置相比（图3A- B). 这一结果在意料之中，因为深孔PCR插针具有更大的表面积（320.4 mm²）2) 与标准装置钉表面面积（108.9 mm2）。这一发现也与体积的增加相一致750 µL）与标准装置孔相比，在深孔生物膜装置中使用200 µL因此，与标准生物膜装置中较小的 peg 相比，深孔装置增加了 PCR 管 peg 上的生物膜生物量积累。

两种生物膜装置在比较生物学重复形成的生物膜时，均能形成可重复的生物膜。 E. coli 和 P. aeruginosa (图 3A- B）。尽管在技术重复的CV染色M A中观察到更大的变异性550 nm 在深孔装置上培养的任一菌株的数值进行比较时，通过成对双因素方差分析（ANOVA）或学生t检验对每种物种在深孔装置与标准装置上的生物学重复样本的中位CV M值进行统计分析，均未发现具有统计学显著性差异（两者） p > 0.05）。该结果表明，深孔装置与标准装置形成的生物膜具有可重复性。然而，结晶紫染色结果还显示，当考虑各装置上 peg 表面面积差异时，生物膜生物量的形成存在差异。 E. coli 和 P. aeruginosa 在生物量积累方面显示出统计学上的显著差异（表1). 每平方毫米 peg 表面面积的平均 CV 染色生物量（M）的计算2 (CV M/mm2）用于 E. coli 表明，与标准生物膜装置相比，聚丙烯深孔装置上的生物膜形成减少了1.5倍（表1）。然而，对于后者却得到了相反的结果 P. aeruginosa 表现出高1.4倍的CV M/mm2 与标准生物膜装置相比，在聚丙烯深孔装置上表1）。尽管每种设备中观察到不同物种在生物膜生物量积累上的特异性差异，深孔装置仍显示出各物种总体生物膜生物量形成更高（增加2-4倍）。图3).

为确定深孔生物膜装置在抗菌药物敏感性测试中的应用，我们比较了两种常用消毒剂——苯扎氯铵（BZK）和次氯酸钠（漂白剂）——对生物膜的清除能力。这两种化学物质在临床和工业应用中常用于预防（BZK）和/或清除（漂白剂）细菌生物膜。21,22,23每种化合物以2倍递增的浓度加入到由生物膜形成菌形成的生物膜中 E. coli 和 P. aeruginosa 标准与深孔生物膜装置上22,23(图1，2B). 苄索氯铵（BZK）或漂白剂产生OD的最低浓度600 nm 与阴性对照孔无法区分的数值被定义为 MBEC 值。使用漂白剂处理在标准生物膜装置上形成的生物膜，得到的漂白剂 MBEC 值均为 0.625% E. coli 和 P. aeruginosa (表1， 图4A-B）。测定的漂白剂MBEC值为 E. coli 和 P. aeruginosa 深孔装置上形成的生物膜中，两种物种的MBEC值均降低了2-4倍E. coli; 0.156%; P. aeruginosa 0.313%）与标准设备相比（表1）。对于深孔装置，不同物种间的漂白MBEC值存在2倍差异，其中 P. aeruginosa 需要高出两倍浓度的次氯酸钠才能清除生物膜，相较于 E. coli (图 4A-B，表1). 两倍稀释漂白剂 MBEC 之间的差异 P. aeruginosa 和 E. coli 在深孔装置中，似乎与CV染色生物量形成增加1.5倍呈负相关 P. aeruginosa 与……相比 E. coli (图3A- B）。由较大生物量形成 P. aeruginosa 深孔装置插针上的残留物可能也解释了为何需要更高浓度的漂白剂才能彻底清除 P. aeruginosa 与生物膜相比 E. coli 深孔板图3A-乙，表1因此，深孔装置生物膜清除实验表明，与标准装置相比，两种物种对漂白剂的敏感性更高，但所需漂白剂浓度更低（低2-4倍）。这与深孔装置PCR板挂钩的表面积和体积大3倍呈负相关。这表明，在漂白剂暴露条件下，较大的生物膜表面积可能降低实现生物膜清除所需的漂白剂浓度。

与次氯酸钠处理结果相比，BZK 对生物膜的清除效果在不同菌种中表现出更高的生长恢复（OD600nm 值）和 MBEC 值变异性（图 4C-D）。这种变异性并不意外，已有先前研究显示，BZK 在抑制生物膜形成方面比清除已成熟生物膜更为有效24,25,26。使用标准生物膜装置时，仅P. aeruginosa生物膜经 BZK 处理后表现出一致的 MBEC 值（2560 µg/mL），该值比深孔装置中该菌株测得的 MBEC 值（20480 µg/mL）低 8 倍（表 1，图 4C）。此结果可能反映了P. aeruginosa在深孔板带钉表面与标准装置钉子上形成的生物量以及塑料材质差异所导致的不同。在深孔装置和标准装置上形成的E. coli生物膜经 BZK 处理后的清除效果均较差，深孔装置测得的 BZK MBEC 值范围为 2560–40960 µg/mL，而标准装置上的范围为 320–10240 µg/mL（图 4D）。对于E. coli，这种变异性源于偶尔出现的 1–2 个重复孔在恢复培养基中表现出较低但具有统计学意义的生长，从而增加了误差，并降低了任一装置对 BZK MBEC 值测定的准确性（图 4D，表 1）。该变异性进一步说明了 BZK 在清除E. coli生物膜方面的无效性，这与先前研究结果一致24,25,26。相比之下，两种装置均可在特定浓度下可靠地清除P. aeruginosa生物膜，但所需 BZK 浓度相差 8 倍（图 4C）。综上所述，P. aeruginosa生物膜在不同装置中测得的 BZK 清除 MBEC 值存在明显差异，而两种装置在区分E. coli精确的 BZK 清除表型方面均表现不佳。

因此，与标准生物膜装置相比，本文所述的深孔生物膜装置方法在形成可重复的生物膜方面同样有效。

微生物生物膜检测；流程图；显示菌落分离、生物膜接种、染色、MBEC分析。
图1。实验流程示意图。 第0天：从冻存菌种中分离单菌落；第1天：用单菌落接种生长培养基；第2天：接种生物膜板；第3天：结晶紫（CV）染色或进行抗菌处理；第4天：将生物膜超声重悬至恢复培养基中；第5天：测定恢复板的OD600nm以确定MBEC值。图中部分图片由Servier Medical Art提供（smart.servier.com）。请点击此处查看该图的放大版本。

生物膜生长与抗菌处理的孔板布局；实验示意图；微生物分析。
图2．本方案各步骤的示例孔板布局。A） 使用两种细菌菌株（E. coli 和 P. aeruginosa）的第1天细菌培养物进行初始24小时生物膜生长的最终孔板设置，每种菌株设三个生物学重复。阴性对照孔（灰色）作为无菌对照（未添加细菌）。B） 生物膜抗菌处理的孔板设置。颜色加深表示抗菌剂浓度递增。阴性对照为未接种细菌的孔（灰色），阳性对照为未暴露于抗菌剂的生物膜（橙色）。来自A图的带生物膜的盖子被转移至该深孔板中进行抗菌处理。请点击此处查看该图的放大版本。

标准孔与深孔中CV摩尔浓度的生物学重复比较；图表分析
图3CV染色的摩尔浓度（M） E. coli BW25113 (A）和 P. aeruginosa PAO1 (B) 从标准（圆形）和深孔（三角形）装置中回收的生物膜生物量。通过测定550 nm波长下结晶紫的吸光度（A550 nm，以及深孔A550 nm 读数通过乘以 3.809 进行校正（800 µL/ 210 µL）以校正不同设备间的体积差异。CV 的摩尔浓度（M）通过比尔-朗伯定律确定（CV 浓度 = A550 nm/εl)；其中光程（l）为 210 µL 在96孔平底微孔板中，测定的光程为0.56 cm，CV在水中的摩尔吸光系数（ε）在A处550 nm 251500 cm-1M-1 39结果代表每种菌株以生物膜形式培养时，三个生物学重复中每个重复的技术重复9次的数据，每个图中的水平线表示每个生物学重复的中位数值。使用双尾配对t检验，基于生物学重复的中位数值比较不同装置间生物量的统计学显著差异（E. coli p = 0.008–0.018（*）； P. aeruginosa p = 0.002–0.009（**），以带星号的柱状图表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

细菌生长抑制柱状图；次氯酸钠、苯扎氯铵浓度效应；OD600；PAO1、BW25113菌株。
图4. 抗微生物剂最低生物被膜清除浓度（MBEC）的测定 漂白剂（A，B）和苯扎氯铵（C，D）的抗菌MBEC浓度测定 P. aeruginosa PAO1（A，C）和 E. coli BW25113 (B,D) 在标准（白色柱）和深孔（灰色柱）生物膜微柱装置上生长的结果。数据通过测定OD值获得600 nm 经超声处理后回收至恢复培养基中并经过过夜培养的生物膜。深孔OD600 nm 通过3.75的因子进行调整（750 µL /210 µL以校正不同设备间的体积差异。结果代表三次生物学重复实验，误差线表示每个抗菌剂浓度下各重复间的标准偏差39每个柱状图上方的星号（*）表示OD值差异具有统计学显著性600 nm 空白对照组的 p 值结果 < 0.05，采用双尾 Student's T 检验计算。每个柱状图上方的圆形符号（o）表示仅有 1 或 2 个重复样本的 OD 值具有统计学显著性600 nm 空白对照组的数值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

BZK 最小生物膜有效浓度 (µg/mL)次氯酸钠溶液最小生物膜有效浓度 (% v/v)
测试菌株深孔装置标准装置深孔装置标准装置
E. coli BW251132560-40960320-102400.1560.625
P. aeruginosa PAO12048025600.3130.625
深孔装置标准装置p-值**倍数变化（深孔/标准）
测试菌株平均 CV M*/ mm2 ± SD平均 CV M*/ mm2 ± SD
E. coli BW251131.99 x 10-8 ± 3.25 x10-93.03 x 10-8 ± 3.31 x 10-90.0176-1.52
P. aeruginosa PAO18.01 x 10-8 ± 9.42 x 10-95.72 x 10-8 ± 9.42 x 10-90.0341.4

表1. 概要 E. coli BW25113 和 P. aeruginosa PAO1 平均 CV 染色生物量 M/mm2 BZK 和漂白剂对不同器械的生物膜清除 MBEC 值及相应数值
*使用中位数生物学重复CV M值计算的平均CV M/mm²值（图3).
**使用双尾学生t检验确定的p值。**

讨论

本研究描述了一种使用较大体积的96孔高通量静态生物膜生长装置的方法，该装置由一个聚丙烯深孔微孔板和一个半裙边PCR板盖组成，用于生物膜的形成（深孔生物膜装置； 材料清单）。我们将使用该装置生成的生物膜与一种市售的聚苯乙烯标准生物膜装置进行了比较（材料表）。深孔装置法采用与标准装置相同的方法步骤和溶液17 在调整了深孔装置的体积后，该设备非常适合大规模生物膜形成及实验分析。生物膜的生长 E. coli BW25113 和 P. aeruginosa PAO1，两种已知可形成生物膜的革兰氏阴性菌，使用两种装置检测其生物量形成及消毒剂（BZK/次氯酸钠）的最低生物膜清除浓度（MBEC）值。通过比较两种装置中各 peg 上结晶紫染色的生物量，结果显示两者均形成生物膜 E. coli 和 P. aeruginosa 在深孔生物膜装置上形成的生物膜生物量高于标准装置图3A- B）。与普通孔相比，深孔板的柱钉具有更大的表面积，导致生物膜生物量增加 与标准装置的柱状表面面积相比。当我们考虑柱状表面面积（mm2使用两种设备时，观察到生物量形成存在差异，其中 E. coli 每毫米形成显著更多的CV生物量2 在聚苯乙烯标准装置的插针上，相较于深孔装置的PCR管插针（表1). P. aeruginosa 形成的CV染色生物量/微柱毫米更高2 与标准设备相比（表1这些发现可能揭示了不同装置上生物膜生物量形成方面的物种特异性差异。

需要注意的是，漂白剂清除深孔装置上 E. coli 和 P. aeruginosa 生物膜的浓度比标准装置低 2-4 倍（图 4A-B，表 1）。不同装置测得的漂白剂最低生物膜清除浓度（MBEC）差异可能受到装置 peg 结构形状差异的影响（深孔装置的 "peg" 为锥形管，而标准 peg 为圆柱形）、塑料材质差异（聚丙烯与聚苯乙烯）以及体积差异（750 µL 与 200 µL）的影响。例如，与标准装置相比，P. aeruginosa 在深孔装置 peg 上形成的 CV M 生物量/mm2 更高，而 E. coli 在深孔 peg 上的生物量则较低（图 3）。这表明，清除生物膜所需的消毒剂浓度可能受各菌种形成的生物量以及可用表面积的影响。此外，装置 peg 的形状差异可能影响特定菌种的生长条件。在本研究中，P. aeruginosa 可能在深孔 peg 上形成更多的生物量，原因在于其具有更大的表面积和更好的通气条件，因为该菌种为专性需氧菌，而 E. coli 为兼性厌氧菌。迄今为止，尚未发现任何已发表的研究直接比较 E. coli 和 P. aeruginosa 在聚丙烯27,28,29 和聚苯乙烯30,31 材料上共同形成的生物膜。然而，已有独立研究报道了 E. coli 和 P. aeruginosa 在聚丙烯或聚苯乙烯材料上均能形成强健的生物膜。关于假单胞菌属，许多 Pseudomonas spp. 能够利用聚丙烯等塑料作为潜在的碳源32。因此，这种聚丙烯深孔生物膜装置的出现是静态生物膜研究中的一项有益进展。聚丙烯在化学性质上比聚苯乙烯更耐用，且具有临床相关性，因其常用于医疗植入物、缝合线以及疝气或盆腔手术用网片33,34。

尽管两种装置均形成了生物膜生物量，但根据结晶紫染色法以及漂白剂和苯扎氯铵（BZK）的OD600nm生物膜清除MBEC值，深孔装置的生物量变异性略高。这可能由以下三个主要因素解释：1）与标准装置的倾斜 peg 相比，深孔装置的 peg 表面积更大；2）所测试的两种微生物可能对每种装置所用的聚丙烯和聚苯乙烯材料具有不同的黏附能力；3）每种装置中使用的培养基体积（深孔装置为750 µL，标准装置为200 µL）以及插入 peg 与孔壁之间的间距存在差异。如果所有生物膜实验均仅使用一种类型的装置，则这些问题不会造成影响；然而，若同时选用两种装置，则应进行本文所开展的比较 ，以识别其差异36,37。由于各装置所用塑料材料不同，不同装置之间的结晶紫染色生物膜生物量和MBEC值不应直接比较。然而，若在同一种装置（深孔或标准）上进行方法和实验，则所测试菌种和抗菌剂的结果具有可比性。

本方案表明，自组装深孔PCR板装置是一种可用于检测生物膜形成与清除的大容量生物膜装置，且具有成本效益。从成本角度来看，带有96孔插针盖的标准生物膜装置每件零售价格为29至36美元（USD）（材料表）。聚苯乙烯材质的标准生物膜装置不可高压灭菌，且由于其塑料的化学特性，对溶剂和酸的耐受性较差。本文所述的自组装聚丙烯深孔板，搭配独立的半裙边96孔PCR板（材料表），每件组装后的总成本为14美元，仅为标准生物膜装置成本的一半。需注意的是，价格可能因地区、经销商和供应情况而异，我们在机构折扣后的实际成本为每件深孔装置9美元。这些自组装聚丙烯深孔PCR板装置还具有可高压灭菌以实现消毒的优势，并且其产生的生物膜生物量可达标准装置的2至4倍。

总之，本实验方案及深孔与标准生物膜装置在生物膜生长比较中的代表性结果表明，两种装置均能培养细菌生物膜，但深孔装置形成的生物膜量为标准装置的2至4倍。深孔生物膜装置提供了一种可行的 一种经济高效的替代方案，适用于大体积、高通量的生物膜形成实验，例如药物敏感性筛选研究。该技术可生成适用于下游“组学”分析（蛋白质组学、代谢组学、转录组学）或实验检测（酶学、荧光检测）的生物膜，这些分析可能需要较大量的生物膜材料。对于希望采用低成本、大容量、化学稳定性好且具有临床相关性的塑料材料，在96孔高通量检测体系中研究生物膜的实验室，推荐使用深孔生物膜装置。

披露

作者无任何披露事项。

致谢

本研究的经费由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（RGPIN-2016-05891）向DCB提供的运营拨款，以及加拿大政府基因组研究与发展计划（GRDI）项目（GRDI7 2254557）向MRM和GRG提供的运营拨款资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 血清移液管，独立纸/塑料包装（200/箱）Fisher Scientific13-678-11F用于无菌培养基/培养物转移的一次性血清移液管
2 mL 血清移液管，独立纸/塑料包装，500/箱Fisher Scientific13-678-11C用于无菌培养基/培养物转移的一次性血清移液管
Axygen 气溶胶过滤吸头，无菌，5 架/包，每架 1000 个吸头Fisher Scientific14-222-766用于培养基分装的无菌移液器吸头
Axygen 深孔储存微孔板，圆底孔，1.1 mL 盖，5/包，P-DW-11-CFisher ScientificP-DW-11-C用于 96 孔深孔装置生物膜培养的微孔板
Axygen 过滤吸头，350 µL 吸头，每架 96 个，共 10 架，低吸附屏障吸头Fisher ScientificTF-350-L-R-S用于培养基分装的无菌移液器吸头
天然聚苯乙烯培养皿/储液槽，50 mL，无菌，5/袋，40 袋，200/箱Avantor/ VWR89094-676用于微孔板制备的无菌培养皿/储液槽
BD Difco 脱水培养基：颗粒状琼脂，500 gFisher ScientificDF0145-17-0用于 LB 琼脂制备的材料
Biotek Synergy Neo2 多功能酶标仪BiotekNEO2MB微孔板紫外/可见光区酶标仪
Branson M3800 超声波清洗机，117 VAvantor/ VWRCPX-952-316R超声水浴装置
结晶紫（CV），ACS 级，100 gFisher ScientificC581-100生物膜生物量染色剂
二甲基亚砜（DMSO），1 L，ACS 级 99.9%，聚乙烯瓶，BDHAvantor/ VWRCABDH1115-1LP用于冷冻保存的培养基组分
Easypet 3 移液控制器Avantor/ VWRCA11027-980用于无菌培养基/培养物转移的血清移液器
Eppendorf Research Plus 8 通道多通道移液器，10–100 µLAvantor/ VWRCA89125-338用于无菌培养基/培养物转移的多通道移液器
Eppendorf Research Plus 8 通道多通道移液器，30–300 µLAvantor/ VWRCA89125-340用于无菌培养基/培养物转移的多通道移液器
冰乙酸，CAS 64-19-7，2.5 L，ACS 级Fisher ScientificA38-212结晶紫脱色剂
玻璃试管，150 mm × 18 mm，72/包，PYREXFisher Scientific14957H/ 9820-18细胞培养用材料
甘油，4 L 玻璃瓶，ACS 级Fisher ScientificBP229-4用于冷冻保存的培养基组分
L-半胱氨酸，98%，250 gAvantor/ VWR97061-204通用中和溶液
还原型 L-谷胱甘肽，98%，25 gFisher ScientificAAJ6216614通用中和溶液
L-组氨酸，98%，100 gAvantor/ VWRCA97062-598通用中和溶液
MBEC 检测接种器，带 96 孔托盘，100/箱Innovotech19112用于 96 孔 MBEC 装置生物膜培养的材料
McFarland 标准品，0.5 个单位Fisher ScientificR20410细胞培养标准化
McFarland 标准品，1.0 个单位Fisher ScientificR20411细胞培养标准化
NUNC 96 孔微孔板，带盖，50/箱Fisher Scientific167008用于 96 孔 MBEC 装置生物膜培养及光密度测定的微孔板
PCR 板，半裙边 96 孔，快速 PCR，聚丙烯，25 个/包Sarstedt72.1981.202用于 96 孔深孔装置生物膜培养的带销盖
培养皿，100 mm × 15 mm，半透明，500/箱Fisher ScientificFB0875712用于 LB 琼脂制备的材料
磷酸氢二钾，ACS 级，500 gFisher ScientificP288-500PBS 组分/缓冲液
氯化钠，ACS 级，3 kgFisher ScientificS2713用于 LB 肉汤和 PBS 的培养基组分
磷酸二氢钠，1 kgFisher ScientificS369-1PBS 组分/缓冲液
注射器滤器，无菌，PES 0.45 µm，25 mm，50/包Avantor/ VWR28145-505不可高压灭菌溶液的过滤除菌
锡箔纸，重型，50 英尺杂货店---用于深孔装置灭菌的材料
胰蛋白胨（酪蛋白胨），2.2 kg/个Fisher ScientificB11922用于 LB 肉汤的培养基组分
吐温-20，100 mLFisher ScientificBP337-100复苏培养基溶液
超深孔板，2.5 mL 深孔板（方孔），带盖，聚丙烯，10/箱Avantor/ VWR37001-520用于生物膜稀释液制备的材料
酵母提取物，Fisher Bioreagents，500 gFisher ScientificBP1422-500用于 LB 肉汤的培养基组分

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