间期荧光 原位 多发性骨髓瘤骨髓涂片杂交

摘要

本文介绍了一种改进多发性骨髓瘤患者骨髓涂片间期荧光原位杂交检测成功率的实验方案。

摘要

荧光原位杂交（FISH）检测是多发性骨髓瘤（MM）遗传学风险分层中不可或缺的方法，而MM是最常见的血液系统恶性肿瘤之一。MM的特征性表现为骨髓中恶性浆细胞的积聚。针对MM的FISH检测报告主要聚焦于经纯化或鉴定的克隆性浆细胞，而非所有有核细胞，通常通过抗CD138磁珠分选或胞质免疫球蛋白轻链κ或λ标记来实现。骨髓间期细胞核通常来源于新鲜骨髓细胞。然而，要获得满意的浆细胞富集样本，需要大量新鲜肝素抗凝骨髓，而在骨髓穿刺困难或干抽的情况下难以获取足够样本。本文中，我们建立了一种新方法，以提高对染色或未染色骨髓涂片进行FISH检测的成功率。相比抗凝骨髓标本，骨髓涂片更易于获取。

引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种具有高度生物学异质性的恶性浆细胞（PC）疾病，其临床疗效存在显著的个体差异，生存期从数月到数十年不等。细胞遗传学特征是多发性骨髓瘤的重要预后指标。基于遗传学特征的风险分层体系及个体化治疗已成为多发性骨髓瘤临床研究中的热点话题。¹. 在荧光检测中测试的PCs的异常情况 原位 骨髓（BM）的荧光原位杂交（FISH）检测组合包括 del 13q14（RB1)，17p13 缺失（del 17p13）TP53)，t(4;14)（IGH/FGFR3)，t(11;14) (IGH/MYEOV)，t(14;16)(IGH/MAF)，t(14;20)(IGH/MAFB)，1q21（CKS1B) 增益/扩增，以及1p（CDKN2C缺失

标准的中期细胞遗传学分析应纳入多发性骨髓瘤（MM）患者的初始评估。尽管传统的G显带核型分析具有全染色体分析的优势，但该方法检出率较低，导致许多假阴性结果²。传统上，浆细胞（PCs）被认为基本不具备分裂能力，因为它们是B淋巴细胞分化的终末产物，这使得获取分裂相图像十分困难。通过长期培养（6天）并使用细胞因子刺激培养物，可能是一种在新诊断MM患者中识别细胞遗传学异常的有前景的方法³。然而，即使将培养时间延长至6天，细胞遗传学异常也仅能在30%–50%的MM患者中被准确检出⁴。此外，MM的特征是存在复杂的细胞遗传学畸变，反映了其预后异质性。然而，传统染色体显带技术的分辨率较低，可能导致MM中染色体异常的漏检。

间期荧光原位杂交（FISH）分析在多发性骨髓瘤（MM）研究中不可或缺，建议优先在CD138阳性浆细胞经磁珠分选或通过胞质免疫球蛋白轻链κ/λ标记后进行^5,6。强烈推荐使用CD138阳性富集样本，以获得最佳的肿瘤细胞得率。然而，准确量化细胞遗传学异常至少需要4 mL抗凝骨髓样本用于浆细胞分选。此外，CD138免疫磁珠分选联合FISH，或胞质κ/λ轻链免疫球蛋白联合FISH检测（cIg-FISH），均显著增加实验成本且耗时较长。

通常，首先通过染色的骨髓涂片或骨髓活检切片的形态学检查来评估浆细胞比例^7,8。形态学检测使用质量最高的骨髓标本（即首次骨髓穿刺抽吸样本），而用于FISH或其他检测的标本通常是继发性抽吸样本，其与外周血混合程度较高，稀释比例较大。

早在20世纪90年代，多项研究就已表明，骨髓涂片可直接用于间期FISH检测，该方法已被证实具有可靠性和可重复性⁹。一项基于细胞形态学和酯酶细胞化学，并结合外周血与骨髓涂片FISH的精巧研究，证实了该技术在阐明粒细胞和淋巴细胞白血病患者染色体异常方面的重大临床意义¹⁰。

本文提供了一种提高多发性骨髓瘤（MM）患者间期FISH检测成功率的新方法。

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言的原则，并经武汉大学中南医院（编号：2019065）伦理委员会批准。样本采集自武汉大学中南医院（中国）血液科的一名多发性骨髓瘤患者。

1. 骨髓涂片的制备

1. 取0.2 mL骨髓液置于洁净的一次性玻璃载玻片上。
2. 快速推片，使骨髓涂片分布均匀并形成清晰尾部，随后自然干燥。
3. 在骨髓膜上加入1 mL瑞氏-吉姆萨染液，室温染色约10秒。
4. 向载玻片上加入1 mL磷酸盐缓冲液。
   注意：需防止染液在载玻片上干燥或流失。
5. 轻轻混匀染液，室温静置15分钟。
6. 用洁净水冲洗载玻片，并在室温下空气中干燥。
7. 采用透射光显微镜检测恶性浆细胞，浆细胞应分布均匀、分散良好。

2. 骨髓涂片的FISH预处理

1. 用固定液覆盖杂交区域，孵育10分钟，以褪色并固定PCs。
   1. 新鲜固定液的配制：按3:1的体积比将甲醇与冰醋酸混合。
2. 用去离子水（dH₂O）冲洗载玻片₂O）并在室温下空气中干燥。
3. 将含有2x SSC缓冲液的瓶子置于水浴中，预热至56 °C。使用前将缓冲液新鲜稀释至20x SSC。
   1. 配制 20x SSC：将 176 g 氯化钠和 88 g 柠檬酸钠加入 800 mL 去离子水中，充分混匀。₂O. 测定pH值，并调节至pH 5.3 ± 0.2。然后加入dH₂O₂O，定容至 1 L。
4. 将制备好的骨髓涂片在预热的2x SSC缓冲液中洗涤10分钟，随后浸入室温去离子水中。
5. 在乙醇梯度（70%、85% 和 100% 乙醇，每种浓度各 1 分钟）中脱水。室温下晾干涂片 10 分钟。

3. 骨髓涂片FISH及洗涤

注意：所有步骤均在暗室中进行，以防止荧光淬灭。

1. 将 TP53/17号染色体着丝粒（CEP17）探针混合物加入杂交区域，并盖上盖玻片。用尖头镊子轻轻按压，以去除盖玻片下的气泡。
2. 用橡胶胶水密封盖玻片的所有边缘，确保密封良好。
3. 待橡胶胶水凝固后，将玻片放入自动FISH仪中。在78 °C下变性5分钟，随后在37 °C下杂交过夜。
4. 从FISH仪中取出玻片，用尖头镊子轻轻去除橡胶胶水。
5. 将玻片浸入室温的2x SSC溶液中约1至2分钟，以洗去盖玻片。
6. 将玻片置于68 °C预热的0.4x SSC/0.3% NP-40缓冲液中，在水浴中洗涤2分钟。
   1. 通过将20 mL 20x SSC（pH 5.3）与950 mL dH₂O充分混合来配制0.4x SSC/0.3% NP-40溶液。然后加入3 mL NP-40，并彻底混匀至完全溶解。测定pH值，并用NaOH调节至7.0–7.5。最后加dH₂O定容至1 L。
7. 将玻片在37 °C的2x SSC水浴中洗涤1分钟，随后竖直放置于避光处，彻底干燥10分钟。
8. 在杂交区域滴加10 µL DAPI，然后盖上盖玻片。

4. FISH 分析与成像

1. 使用荧光显微镜上合适的滤光片组合观察杂交后的玻片。
2. 使用单色蓝色荧光滤光片观察细胞核的荧光强度。在DAPI滤光片组合下拍摄细胞核图像。
3. 使用染色体着丝粒探针显示一个细胞包含多少条染色体。用绿色荧光标记CEP17，使用光谱绿荧光滤光片观察CEP17的位置。在绿色滤光片组合下拍摄CEP17信号图像。
4. 用橙色荧光标记TP53基因，使用光谱橙荧光滤光片观察TP53，在此滤光片组合下拍摄TP53信号图像。
5. 将这三幅图像合并，检查是否存在数目异常。
   注意：在正常的间期细胞中，蓝色荧光标记的细胞核内可观察到两个橙色信号和两个绿色信号，表明存在一对正常的17号染色体（图1）。

结果

在对一名新确诊的多发性骨髓瘤（MM）患者进行初始形态学评估时，发现骨髓（BM）涂片中15%的浆细胞（PC）的细胞核比正常浆细胞更大、着色更深，且胞质含量更多（图2A）。通过免疫表型技术检测首管肝素抗凝骨髓样本，仅发现2.3%的单克隆异常浆细胞。结合CD138免疫磁珠分选与FISH或cIg-FISH技术，对于获得准确的FISH结果至关重要。然而，当骨髓穿刺出现干抽时，骨髓抽吸物的获取受限。因此，采用骨髓涂片进行间期FISH检测。通过荧光显微镜载物台游标卡尺定位骨髓膜上的一个代表性双核浆细胞（图2B）。对骨髓涂片应用FISH检测TP53和CEP17。FISH结果显示一个间期浆细胞核内有四个橙色信号和四个绿色信号（图2C），提示在中期浆细胞核中存在四份17号染色体拷贝。通过将培养时间延长至3天获得核型分析结果，并进一步使用FISH分析软件进行分析（图2D）。骨髓涂片间期FISH结果的准确性...

讨论

FISH在多发性骨髓瘤（MM）遗传学风险分层中的应用至关重要。FISH检测报告中的关键部分并非所有有核细胞，而是通过抗CD138磁珠分选或胞浆免疫球蛋白轻链κ或λ标记特异性富集或识别出的克隆性浆细胞（PCs）。由于骨髓（BM）中浆细胞所占比例相对较低，经浆细胞分选后的间期FISH或胞浆免疫球蛋白FISH（cIg-FISH）在MM诊断中具有重要意义。然而，这些方法存在一些不足之处，包括操作流程复杂、标本需求量大以及实验成本较高等问题。通过显微镜载物台游标卡尺可快速定位约50个浆细胞。与抗凝骨髓标本相比，骨髓涂片更容易获取，因为获取抗凝骨髓标本需要复杂操作以获得完整细胞核。因此，我们建立了一种可靠的骨髓涂片FISH方法，用于检测多发性骨髓瘤细胞。

首先，骨髓涂片应由经验丰富的形态学分析人员制备。制备涂片时，将推片以30°–45°的角度置于骨髓穿刺液前方，向后拉动使其与液体接触¹¹。然后以均匀、稳定的速度向前推动。骨髓涂片的密度需适当调整，使其长度约为载玻片长度的四分之三¹²。骨髓膜必须窄于载...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动FISH仪	Leica  Corporation	S500-24	FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPI	Abbott Molecular Inc.	06J49-001	DAPI复染剂
FISH分析软件	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	FISH分析软件
FISH探针	Abbott Molecular Inc.	05N56-020	Vysis 位点特异性识别TP53 / CEP 17 FISH探针试剂盒
固定体积移液器	艾本德（中国）有限公司	M33768H	10 微升
荧光显微镜	奥林巴斯公司	BX53	正置荧光显微镜
核型分析软件	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	核型分析软件
光学显微镜	Olympus  Corporation	BX41	正置光学显微镜
NP-40	Abbott Molecular Inc.	07J05-001	NP-40
塑料染色架	广州凯秀贸易有限公司	RSJ-501	24张载玻片
塑料染色缸	广州凯秀贸易有限公司	RSJ-516	24张载玻片
橡胶胶水	Marabu GmbH & Co. KG	FixoGum	橡胶胶水
SSC	Abbott Molecular Inc.	02J10-032	20×SSC
水浴锅	上海博迅医疗生物仪器股份有限公司	DK-8D	多温区水浴锅