用于外周神经接口的无线无电池系统的植入与控制

摘要

本方案介绍了一种用于外周神经的无线供电接口的外科植入及操作方法。我们通过将神经刺激器分别植入大鼠坐骨神经或膈神经的实例，展示了该方法的应用价值。

摘要

外周神经接口在实验神经科学和再生医学中被广泛应用于多种用途。这类接口可以是传感器、执行器，或兼具两者功能。传统的外周神经接口方法必须连接到外部系统，或依赖电池供电，从而限制了其运行时间。随着无线、无电池且完全可植入的外周神经接口的最新发展，新一代设备能够提供等于甚至超越有线或电池供电设备的功能。本文介绍了在成年大鼠中（i）外科植入以及（ii）无线供电和控制该系统的方法。以坐骨神经和膈神经模型为例，展示了该方法的通用性。本文展示了外周神经接口如何诱发复合肌肉动作电位（CMAPs）、递送治疗性电刺激方案，并整合用于外周神经损伤修复的导管结构。此类设备为单次或重复剂量的治疗性刺激提供了更广泛的治疗选择，并可适配于多种神经位置。

引言

创伤性周围神经损伤（PNI）在美国的年发病率约为每年20万例¹。大多数遭受PNI的患者会遗留永久性功能障碍。在最严重的情况下，可能导致肌肉瘫痪，并引发治疗抵抗性的神经病理性疼痛，其严重程度甚至使患者愿意接受截肢作为治疗手段²。改善PNI预后的最大障碍在于轴突再生速度相对于其需要再生的距离而言过于缓慢。例如，成年个体的轴突生长速度为1 mm/天，但在肢体近端损伤的情况下，可能需要再生超过>1000 mm的距离。

在目前的临床实践中，约50%的周围神经损伤（PNI）需要手术修复³。为了实现成功的神经再生，轴突必须（i）跨越损伤部位（即实现缺损跨越），然后（ii）沿神经通路再生并到达终末靶器官（即远端再生）（图1）。目前尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准、被证实可加速神经再生的药物。在过去几十年中，PNI的临床管理现状仅取得渐进性改进，局限于对手术技术的优化，例如采用远端运动神经转接术以缩短再生轴突所需行进的距离⁴，或在近端神经回缩、无法直接缝合的情况下使用"即取即用"的人工神经导管⁵。然而，已有四项由加拿大阿尔伯塔大学K. Ming Chan博士团队主导的单中心随机临床试验，评估了术后对神经施加治疗性电刺激的效果，结果显示肌肉^6,7,8或皮肤⁹的再神经支配显著改善。该电刺激方案的基础研究工作最初在啮齿类动物中完成^10,11，研究表明电刺激的作用机制特异性地体现在促进缺损跨越（图1），而对远端再生并无促进作用^12,13,14,15。

在全部四项电刺激随机临床试验中，经皮导线电极的手术植入是必要的，因为其效果依赖于持续1小时以20 Hz频率向神经元胞体输送足够电流以实现去极化¹¹。在临床实践中，由于疼痛问题，大多数患者无法耐受通过皮肤表面刺激电极达到所需强度的这种电刺激方案。术后使用经皮电极存在不容忽视的风险，例如深部伤口感染，或在患者从手术室（OR）转运过程中电极导线意外脱离神经。此外，手术室本身高昂的使用成本也使得在手术期间实施该操作缺乏可行性，相比之下，在急性术后恢复阶段进行更具优势。目前正出现一类新型的无线、无电池且完全可植入的外周神经接口，旨在克服现有外周神经接口的这一缺陷。

这一新型无线植入式电子系统有望提高电刺激剂量调节的便捷性和灵活性，并打破阻碍其更广泛临床应用的障碍。本文介绍了在成年大鼠坐骨神经和膈神经模型中（i）外科植入以及（ii）无线供电与控制该系统的方法。文中展示了外周神经接口如何诱发复合肌肉动作电位（CMAPs）、递送治疗性电刺激方案，甚至可作为外周神经修复的通路。本文所述方案可适用于该技术的其他变体，例如可用于光遗传学介导的神经调控¹⁶、可控药物释放¹⁷，或随时间重复进行电刺激^18,19的系统。

方案

本方案中描述的所有操作均遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》的规定，并已获得西北大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。本方案遵循西北大学比较医学中心及IACUC的实验动物护理指南。在调整本方案时，必须咨询IACUC。

1. 无线电子刺激器的制备（图2）

1. 使用铜/聚酰亚胺/铜（顶部和底部铜层厚度为18 µm，聚酰亚胺层厚度为75 µm）作为射频能量收集线圈（即无线接收天线）的基底。
2. 使用直接激光烧蚀在顶层和底层铜层上加工电极孔洞并成型器件，通过孔洞使用银浆将顶层和底层导电连接。
3. 通过焊接将带有商业封装的电子元件（如二极管和电容器）连接。
4. 使用可生物吸收的动态共价聚氨酯（b-DCPU；厚度200 µm）封装的钼（Mo；厚度15 µm；蛇形结构）作为可拉伸引线电极¹⁹.
5. 使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）薄膜（300 µm 厚）制备用于器件与神经之间接口的袖状电极。
6. 连接无线接收器天线和可拉伸扩展电极后，使用商用防水环氧树脂或聚二甲基硅氧烷（PDMS）对无线接收器天线及其连接部位进行封装。参见 图2 （右侧）为完全组装好的装置。
7. 使用波形发生器通过初级线圈（即发射线圈）产生单相电脉冲，以确认设备的无线操作功能。
   ​注意：先前的研究报道，由于单相和双相刺激在波形特征上的差异，其对周围轴突募集及轴突再生诱导的作用可忽略不计。²⁰，并且该研究团队已能够在小鼠中使用相同的单相电流参数实现治疗性电刺激增强²¹ 和大鼠¹⁸此外，先前的研究已探讨了生物相容性 体内 和 体外 并且未发现由热效应或材料本身引起的组织损伤证据。基于这些发现以及本研究中治疗性电刺激的持续时间较短，本方案采用了单相而非双相刺激。
8. 使用连接到袖带电极的示波器测量产生的直流输出电压。

2. 植入前装置的准备

1. 将植入装置放入无菌培养皿中，并用封口膜密封。
2. 用紫外光对装置每侧照射 30 分钟。

3. 大鼠右侧坐骨神经无线无电池外周神经接口植入手术步骤（用于电刺激）（图3）

注意：保持无菌条件。手术应在动物实验室内指定的手术区域进行。术者在手术过程中需佩戴口罩、手术服、帽子和无菌手套。若进行多台手术，需在每只动物之间更换无菌手套，并为每台手术使用清洁且无菌的手术器械。手术间应通过热力灭菌法（高压蒸汽灭菌器或玻璃珠灭菌器）对器械进行灭菌。使用体重为200–250 g的成年Sprague-Dawley大鼠。

1. 使用异氟烷气体麻醉（诱导浓度3%，维持浓度1-3%） 维持 在氧气中 （2 L/min），并皮下注射美洛昔康（1–2 mg/kg）。使用指定的眼科软膏覆盖大鼠眼睛，以防干燥。
2. 将大鼠置于消毒的手术台上，呈俯卧位以进行后续操作。在剩余的手术过程中，每15分钟至少评估一次呼吸频率（应约为2次/秒）、组织颜色和麻醉深度，并据此维持异氟烷浓度。通过检查足底反射（对用力捏足趾无反应）确认麻醉深度适当。监测黏膜状态，应保持粉红色且湿润。
3. 剃除手术区域的毛发，包括右后肢和背部下半部分。先用碘伏棉片擦拭已剃毛的手术区域，再用70%医用乙醇棉片擦拭，重复此擦拭过程三次以进行皮肤消毒。
4. 使用组织剪在右侧股骨平行方向的皮肤上做一个1.5–2 cm的切口，随后钝性分离背部皮下结缔组织（位于切口正内侧），以创建一个用于放置接收线圈的皮下囊 pocket图 4A在右侧臀肌上做一个与皮肤切口平行的后续切口（1.2–1.5 cm）。
5. 使用钝端金属解剖探针轻柔分离坐骨神经（图4B).
   注意：坐骨神经位于股二头肌深部，与股骨平行。建议使用解剖显微镜。
6. 将无线无电池设备植入坐骨神经图4C通过将套管环绕在分离的右侧坐骨神经上，且不使神经受到张力或改变其走行路径^18,19,20在皮肤上标记出放置接收线圈的位置，以便进行后续的电刺激。
7. 缝合 使用可吸收缝线缝合臀肌切口（图 4D).
   注意：接收线圈的上半部分位于臀肌上方，袖带接口位于其下方。
8. 使用伤口夹（或皮下缝线）关闭皮肤切口； 图4E对齐皮肤边缘。
9. 在麻醉状态下，给予持续1小时的术后20 Hz电刺激，脉宽为200 µs（图4F动物完全从麻醉中恢复后，将其放回原笼具中。
   注意：详细方案如下所述。接收线圈显示在皮肤上方 图4F.
10. 术后治疗
    1. 将大鼠置于无垫料的恢复笼中，笼底铺有纸巾，笼子一半置于经批准的温控加热垫上。
    2. 仔细监测大鼠，直至其能够自主行走。一旦大鼠恢复自主行走能力并被评估为状态稳定，将其放回原饲养笼，并观察其社会行为的重新融入情况。
    3. 急性恢复后，观察大鼠切口部位是否感染以及是否存在神经性疼痛症状，包括但不限于保护性姿态、扭体、搔抓和自残行为。术后5天恢复期内每日观察大鼠，若大鼠未在第5天处死，则此后至少每三天观察一次。
    4. 术后根据动物表现出的疼痛/不适程度，皮下注射美洛昔康（1-2 mg/kg），每日一次，持续两至三天。若怀疑存在持续性疼痛，可在此之后继续使用美洛昔康；如疼痛仍难以控制，应与兽医团队协商，对大鼠实施安乐死。
    5. 术后10-12天拆除皮肤缝线或伤口夹。

4. 大鼠左侧膈神经无线刺激器植入手术步骤（图5A）

注意：保持无菌条件，如同第3节所述。使用体重为200-250 g的成年Sprague-Dawley大鼠。所有手术器械在使用前均需灭菌。

1. 使用异氟烷气体麻醉（3%诱导，1-3% 维持浓度） 与氧气 （2 L/min）联合给药，并皮下注射美洛昔康（1-2 mg/kg）。使用指定的眼科软膏覆盖大鼠眼睛，防止角膜干燥。
2. 将大鼠仰卧置于已消毒的手术台上以进行后续操作。在整个手术过程中，至少每15分钟评估一次呼吸频率、组织颜色和麻醉深度，并相应调整异氟烷浓度。通过检查足底反射（对用力捏足趾无反应）确认适当的麻醉深度。监测黏膜状态，应保持粉红色且湿润。
3. 剃除颈部腹侧手术区域的毛发。先用碘伏棉片擦拭剃毛区域，再用70%医用乙醇棉片擦拭，重复此清洁过程三次以完成皮肤消毒。
4. 在颈部中线处皮下注射布比卡因（2 mg/kg，用生理盐水稀释，总体积不超过0.5 mL），作用于最表层组织。沿中线做一长约3 cm的切口，切开皮肤和浅层颈筋膜，暴露胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌（图5B）。
   注意：建议使用解剖显微镜。
5. 用探针轻柔钝性分离并抬起胸锁乳突肌，使用血管环将其向侧方牵开（图5C）。轻柔游离并牵开肩胛舌骨肌。随后，轻柔游离并将其下方的迷走神经及颈动脉束向内侧牵开。
   注意：此处关键区别在于膈神经与迷走神经。若需暴露深层结构，可切断肩胛舌骨肌。
6. 分离并暴露膈神经（图5D）。
   注意：膈神经沿前斜角肌表面走行，是一条明显细小的纵向神经，垂直跨越臂丛神经。与坐骨神经不同，颈部膈神经周围的解剖结构更为复杂。为获得最佳效果，建议在植入前进行电生理确认（步骤4.7）。
7. 将记录电极皮下植入，位置位于肋笼稍尾侧，与已分离的膈神经同侧（图5E）。将刺激器放置于膈神经上，并通过同步信号确认其功能（图6）。
   注意：通常以约3-6 mA的刺激强度和0.02 ms的刺激持续时间诱发最大反应。
8. 通过在横断部位近端的神经末端施加电刺激，若诱发反应完全消失，则可验证膈神经已完全横断（图6）。
9. 将一无线、无电池的装置植入膈神经上（图5F），方法是将可植入设备的接收线圈置于胸骨舌骨肌上，位于双侧胸锁乳突肌深部，神经套管环绕膈神经，接触电极与神经垂直放置。
10. 用连续可吸收缝线缝合浅层颈筋膜（图5G）。在真皮深层使用间断倒置可吸收缝线缝合皮肤。仅当动物完全从麻醉中恢复后，方可将其送回原饲养笼。
11. 术后处理请参照步骤3.10。

5. 治疗性电刺激的无线递送

1. 对处于全身麻醉状态的大鼠施加 1 小时的电刺激。进行无线刺激时，将波形/函数发生器（电压：1-15 Vpp）及可选的放大器置于动物上方，以向外部感应线圈（即发射线圈）（二维螺旋线圈，5 圈；直径：2 cm）提供电能，确保其与植入的接收线圈之间具有良好的感应耦合。以 20 Hz 的频率输送单相、200 µs 的脉冲，持续 1 小时。
2. 为验证并量化电刺激的递送效果，从胫骨前肌记录复合肌肉动作电位（CMAPs），并调节刺激电压以实现坐骨神经的超最大激活。所有记录均使用同心针电极。
   注意：若函数发生器的最大电压不足以引发最大反应，应使用放大器。

6. 安乐死

1. 主要方法
   1. 将笼子置于设定流速为 8-12 LPM（或根据舱体大小设定适当流速）的 CO₂ 递送舱下。观察大鼠是否失去意识，随后至少监测其呼吸停止持续 1 分钟。
2. 次要方法
   1. 实施颈椎脱位或双侧开胸术。

结果

在坐骨神经损伤模型中，于胫神经分支的端对端修复之前，将植入物放置在右侧坐骨神经周围（图3、图4A 和 图7A）。将一根30 G同心针电极插入右侧胫骨前肌，以确定达到最大强度电刺激所需的刺激参数。这些实验包括逐步提高刺激强度，直至反应幅度达到最大平台期。由于胫骨前肌由坐骨神经的腓肠支支配，在胫神经横断损伤中得以保留。因此，记录胫骨前肌的反应可实现对电刺激治疗的持续监测。

通过导线电极向右侧坐骨神经施加单次刺激脉冲（5 mA，0.02 ms）时，在同侧胫骨前肌记录到最大复合肌肉动作电位（CMAP）反应，其负向波峰值振幅为5.4 mV（图7B；黑色迹线）。采用无线无电池植入式刺激器施加相似刺激脉冲时，同样诱发出可比的CMAP反应，负向波峰值振幅为4.6 mV（图7B；橙色迹线）。该结果与近期一项报道一致：无线神经刺激所产生的CMAP平均可达有线神经刺激的88%²¹，显著高于临床研究中治疗效应所需的阈值^6,7,8,9。在本示例中，无线刺激器相较于有线刺激器更长的潜伏期，是由于其与记录肌肉之间的距离更大所致。

在膈神经模型中，于横断之前将植入物放置在右侧膈神经周围（图5）。为了确定达到最大强度电刺激所需的刺激参数，将一根30 G同心针电极皮下插入右侧（同侧）前肋缘，以记录右侧半膈肌的反应。实验过程中逐步提高刺激电压，直至反应幅度达到最大并趋于平稳。由于膈神经难以与周围神经血管结构分离，可通过诱发抽搐反应来确认其身份（图6；橙色轨迹）。进一步可通过在神经电极套管远端横断膈神经，观察抽搐反应是否消失，从而验证刺激的特异性（图6；黑色轨迹）。

采用既定方案，可通过无线植入装置对坐骨神经进行1小时的重复性低频电刺激治疗，以促进轴突再生（^{6,7,8,9,10,11}；图8）。将无线植入装置的套管接口置于右侧坐骨神经上，同时将30 G同心针电极置于右侧胫骨前肌，以监测治疗过程。图8A显示了在1小时20 Hz电刺激开始时（0分钟）记录到的肌电图中连续出现的四个峰形信号。图8B显示了在电刺激进行至40分钟时记录到的另外四个峰形信号，其峰值幅度略有下降，这与基于导线的电刺激治疗中观察到的疲劳模式一致^15,21。

可通过在神经损伤部位远端施用逆行示踪剂来评估周围神经再生的程度。由于周围轴突会发出多个侧支芽，因此通过逆行示踪并计数脊髓中的运动神经元胞体，能够比直接计数神经内再生轴突更准确地评估再生神经元的数量³¹。为证明这一点，采用压榨损伤法横断坐骨神经主干。经过3周恢复后，在坐骨神经的两个分支上分别施用两种不同的荧光逆行染料：腓神经（绿色）和胫神经（红色）（图9A）。图9B-D 显示了腰段脊髓前角中被点亮的下运动神经元亚群，这些神经元分别构成胫神经（图9B）或腓神经（图9C）。叠加图像显示脊髓前角中两个独立的标记神经元柱状结构，可据此对损伤部位远端再生轴突的运动神经元数量及其空间分布进行定量分析（图9D）。

图1：神经再生模型。（A）神经修复后，轴突从近端向远端神经末端生长，实现早期的缺损跨越。（B）远端再生的持续时间与到达靶器官（如皮肤、肌肉）的距离以及轴突再生速率相关。大多数旨在改善神经修复的疗法均针对上述一个或两个过程。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：无线电子刺激器制备示意图。 左侧为器件结构的详细分层，包括圆形射频能量收集线圈、可拉伸延伸电极以及包裹目标神经的神经袖带。右侧为器件三个部分的简化示意图。缩写：PLGA = 聚（乳酸-共-乙醇酸）；b-DCPU = 可生物吸收动态共价聚氨酯。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：无线无电池神经接口在大鼠坐骨神经模型中的植入。（A）示意图显示了植入大鼠右侧坐骨神经的完整可植入系统。（B）上图显示电极接口位于右侧胫神经端对端修复部位近端的坐骨神经上。下图显示带有延长神经套管的电极接口，桥接近端与远端神经残端之间的缺损修复。缩写：PLGA = 聚（乳酸-共-乙醇酸）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：坐骨神经植入手术过程。（A）切开皮肤、皮下结缔组织和臀肌以暴露腘绳肌。（B）分离出的坐骨神经（黑色箭头）。（C）植入设备术后状态，可见神经套管、导线（白色星号）和植入物（星形标记）。（D）通过缝合闭合结缔组织。（E）使用伤口夹闭合切口。（F）通过皮肤上方的线圈产生无线电刺激。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：膈神经植入手术过程。（A）仰卧位下颈部腹侧视图。（B）切开皮肤及皮下结缔组织，暴露胸骨舌骨肌。（C）分离肩胛舌骨肌与胸锁乳突肌之间的潜在间隙。（D）膈神经（箭头所示），已从臂丛神经中分离出来。（E）膈肌肌电图验证膈神经功能。黑色箭头：记录电极；红色箭头：刺激电极。（F）植入操作。（G）使用深层真皮缝线关闭皮肤。请点击此处查看该图的高清版本。

图 6：通过膈肌诱发的复合肌肉动作电位确认膈神经完全横断损伤。 在膈神经横断前（橙色），对膈神经进行电刺激可在同侧膈肌上诱发复合肌肉动作电位，而膈神经横断后该电位消失（黑色）。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：无线与有线电刺激的代表性神经传导研究对比。（A）坐骨神经上无线（黑色）和有线（橙色）装置放置位置示意图。记录电极置于胫骨前肌。（B）由有线植入装置（橙色）与无线植入装置（黑色）诱发的复合肌肉动作电位。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：通过植入电极对胫骨前肌（TA）进行1小时20 Hz重复电刺激期间记录的肌电图（EMG）。 （A）电刺激第1分钟时的EMG轨迹。（B）电刺激第40分钟时的EMG轨迹。缩写：EMG = 肌电图；TA = 胫骨前肌；e-stim = 电刺激；min = 分钟。请点击此处查看该图的高清版本。

图9：坐骨神经再生的代表性图像。（A）坐骨神经损伤及荧光逆行标记示意图。坐骨神经轴突通过挤压损伤被切断。经过3周恢复后，其远端分支——腓神经（绿色）和胫神经（红色）——实现了逆行标记。（B-D）显示腰髓同侧损伤侧前角内神经元胞体的图像。比例尺 = 30 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文描述了在大鼠坐骨神经和膈神经模型中进行无线、无电池且完全可植入的外周神经接口手术植入及操作的步骤。我们展示了这类新型生物医学植入物如何用于递送一种治疗性电刺激范式，该范式已在临床前和临床研究中被证明可促进轴突再生（综述见²²）。本方案操作简便，可推广应用于更小的动物模型（如小鼠²¹），也可适用于其他具备光电和微流控外周神经接口功能的无线、无电池且完全可植入设备^{18,23,24,25,26,27,28,29,30}。文中还展示了使用啮齿类动物坐骨神经的方法，这是最常见的实验模型³¹。

当该方法被改进用于膈神经时，其多功能性得到了体现。膈神经很少被用作周围神经损伤的模型³²，这可能是因为其在临床上的重要性长期被低估^33,34,35。在新冠大流行期间，膈神经损伤的诊断与康复已成为一个重要问题^36,37,38。目前尚不清楚这种短暂、低频的电刺激范式是否能够促进膈神经轴突的再生以及改善膈肌麻痹的恢复。然而，通过电刺激膈神经以驱动膈肌起搏，已被确立为高位颈髓损伤导致四肢瘫痪患者发生呼吸衰竭时的一种有效治疗手段^{39,40,41,42,43}。其他适应证也正在探索中，包括重症疾病后脱离呼吸机的支持⁴⁴。

为确保植入系统的良好运行，应强调几个关键步骤。首先，在操作设备时，必须避免对器件的薄型电子元件施加过大的力，以防止导线绝缘层损坏、弯曲或断裂。其次，准确标记射频能量采集线圈在覆盖皮肤上的位置至关重要。第三，使用鹅颈夹将外部射频电源的发射线圈与植入设备的能量采集线圈仔细对齐，可实现系统的稳定运行。最后，除了通过肉眼观察肌肉抽动来确认电刺激外，还建议进行定期的神经生理学监测。在颈部膈神经解剖结构较为复杂的情况下，电生理学确认有助于证明已正确分离出目标神经（图6）。

除了本文所示的无线无电池电刺激器^18,19,21之外，许多其他设备也可能采用相同的手术步骤。例如，由于用于植入舌咽神经和迷走神经以长期记录交感神经和副交感神经系统信号的电极^30,45,46与膈神经的手术区域相似，本方案可稍作调整后用于此类电极的植入。用于外周神经的无线长期生物相容性刺激器（如ReStore）是可长期留置并按需刺激神经的理想工具^{25,47,48,49,50}。已有研究报道了相关的多通道无线记录植入装置⁵¹。总体而言，我们认为这些外科手术和电刺激方案可作为所有与电刺激或信号记录相关的无线外周神经接口技术的标准操作流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	Electronics & Innovation	201L
任意波形发生器	RIGOL	DG1032Z	30 MHz，2通道，200 MS/s，14位分辨率，8 Mpts
布比卡因	Pfizer	655317	Marcaine，0.5%
铜/聚酰亚胺/铜	Pyralux	AP8535R	顶部和底部铜层各厚18 µm，聚酰亚胺层厚75 µm
肌电图记录设备	Natus	Nicolet VikingQuest
EPOXY MARINE	Loctite
异氟烷，USP	Butler Schein Animal Health	1040603	ISOTHESIA
美洛昔康	covetrus		5 mg/ml
针电极	Technomed USA Inc.	TE/B50600- 001
PDMS（硅弹性体试剂盒）	DOW	SYLGARD™ 184
ProtoLaser U4	LPKF	U4
Puralube Vet Ointment 无菌眼用润滑软膏	Puralube	83592
波形发生器	Agilent Technologies	Agilent 33250A