基于显微镜的测定，用于使用SNARE运输研究和分析回收内体

Anshul Milap Bhatt; Subba Rao Gangi Setty

doi:10.3791/63087

方法文章

基于显微镜的测定，用于使用SNARE运输研究和分析回收内体

DOI：

10.3791/63087

⸱

2022年2月12日

Anshul Milap Bhatt¹ , Subba Rao Gangi Setty¹

¹Department of Microbiology and Cell Biology, Indian Institute of Science, Bangalore KA 560012, India

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

回收内体是内体管网络的一部分。在这里，我们提出了一种使用GFP-STX13作为细胞器标记来量化回收内体动力学的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

回收内体（REs）是由所有细胞类型中的早期/分选内体产生的管状囊泡细胞器。这些细胞器在黑素体的生物发生中起着关键作用，黑素体是由黑素细胞产生的溶酶体相关细胞器。RE在形成期间将黑素细胞特异性货物输送到过早的黑素体。在Hermansky-Pudlak综合征的几个突变体中观察到的REs的产生阻塞，导致皮肤，头发和眼睛色素减退。因此，研究REs的动力学（参见数量和长度）对于了解这些细胞器在正常和疾病条件下的功能是有用的。在这项研究中，我们的目标是使用常驻SNARE STX13测量RE动力学。

引言

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黑色素色素的生物合成发生在黑素体中，黑素体是一种与常规溶酶体共存的黑素细胞特异性溶酶体相关细胞器（LRO）。内吞系统在黑色素体的生物发生中起着关键作用，黑素体是肤色和防止电离辐射的光保护^{所必需的1}^，²^，³。在此过程中，黑色素合成酶在早期/分选内体上被分选，然后通过称为循环内体（REs）^的管状或囊泡内体运输到过早的黑素体4^，⁵^，⁶^，⁷^，⁸^，⁹^，¹⁰。这些细胞器的靶向和融合调节全功能色素沉着黑素体的成熟⁷^，¹¹^，¹²^，¹³^，

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方案

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该协议涉及黑素细胞的接种，然后转染质粒。进一步的步骤包括固定，免疫染色，成像和分析细胞，以测量RE的长度和数量。该协议的详细说明如下。

1. 在预处理的盖玻片上接种小鼠黑素细胞

用基底膜基质培养基（在完全RPMI培养基中为1:20:20:1:20）涂覆在培养皿（即35毫米培养皿中4- 5个培养皿）中的玻璃盖玻片，并在组织培养罩中干燥15分钟。使用前用 1x PBS 清洗盖玻片一次。
在补充完整的RPMI培养基的培养皿（即35或60毫米培养皿）中维持野生型小鼠黑素细胞（来自C57BL / 6J， a / a， Ink4a-Arf^{-/-小鼠的melan-Ink4a-Arf-1} ，在²⁰ 中描述并在欢迎信托功能基因组学细胞库中提供）。
1. 用1x PBS洗涤细胞两次，并加入0.5或1mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%）溶液用于胰蛋白酶消化细胞。将细胞在37°C孵育2-5分钟，以便从培养皿中分离。
2. 加入1 - 2mL完整的RPMI培养基，悬浮并将细胞转移到离心管中。
将细胞悬浮液在4°C，376× g 下离心5分钟，然后将沉淀重悬于1x PBS中。
重复离心步骤并将细胞重悬于1mL完整RPM....

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结果

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^STX13Δ129突变体定位到黑素体的定量分析
STX13在小鼠野生型黑素细胞中的免疫荧光显微镜显示，GFP-STX13WT定位为囊泡和管状结构，GFP-STX13Δ129定位为细胞表面外的环状结构（图1A）。此外，细胞内环状GFP-STX13Δ129显示出与黑素体蛋白TYRP1（图1A）和明场成像黑素体（数据未显示）的共定位¹²。如前所述，在黑素体¹²中观察到一组过度表达的GFP-STX13WT。为了测量GFP-STX13WT和GFP-STX13Δ129对黑素体的相对定位，我们使用斐济并使用JACoP插件进行分析。与使用 TYRP1 的 GFP-STX13WT 相比.......

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讨论

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回收内体是一组内吞细胞器，它们介导所有细胞类型中货物到细胞表面的回收²¹^，²²，²³^，²⁴^，²⁵。在黑色素细胞等特殊细胞类型中，这些细胞器部分地将其运输路线转移到黑素体以进行生物发生³^，¹⁶^，²⁶。此外，在早期/分拣内体上生成REE，并在形态学上表现为管状囊泡结构。它们的动力学（数量和长度）取决于几个细胞因子，包括运动蛋白²¹^，^22，23^，²⁴<.......

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披露

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作者声明他们没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了生物技术部的支持（BT / PR32489 / BRB / 10 / 1786 / 2019到SRGS）;科学与工程研究委员会（CRG/2019/000281给SRGS）;DBT-NBACD（BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 至 SRGS）和 IISc-DBT 合作计划（至 SRGS）。该部门的基础设施得到了DST-FIST，DBT和UGC的支持。AMB 由 DBT-JRF （DBT/2015/IISc/NJ-02）提供支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
抗 TYRP1 抗体（TA99）	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel 基质	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI 培养基 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022

酯

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dell'Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nat....

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