需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

基于显微镜的检测方法用于通过SNARE运输研究和分析循环内体

3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63087

⸱

2022年2月12日

 , 
1Department of Microbiology and Cell Biology, Indian Institute of Science, Bangalore KA 560012, India

本文内容

摘要

回收内体是内体管状网络的一部分。本文介绍一种利用GFP-STX13作为细胞器标记物来定量分析回收内体动态变化的方法。

摘要

回收内体（REs）是所有细胞类型中由早期内体/分选内体产生的管泡状细胞器。这些细胞器在黑素细胞生成黑素体（一种与溶酶体相关的细胞器）的过程中发挥关键作用。在黑素体形成过程中，回收内体将黑素细胞特异性货物递送至未成熟黑素体。在多种Hermansky-Pudlak综合征突变体中观察到回收内体生成受阻，导致皮肤、毛发和眼睛色素减退。因此，研究回收内体的动力学特征（指其数量和长度）有助于理解这些细胞器在正常及疾病状态下的功能。在本研究中，我们旨在利用定位于回收内体的SNARE蛋白STX13来测量回收内体的动力学特性。

引言

黑色素的生物合成发生在黑素体中，黑素体是一种黑色素细胞特异性的溶酶体相关细胞器（LRO），与传统溶酶体共存。内吞系统在黑素体的生物发生过程中起关键作用，该过程对皮肤颜色形成以及抵御电离辐射的光保护至关重要1,2,3。在此过程中，黑色素合成酶在早期内体/分选内体上被分选，随后通过称为回收内体（REs）的管状或囊泡状内体转运至未成熟黑素体4,5,6,7,8,9,10。这些细胞器的靶向与融合调控着功能完整色素化黑素体的成熟7,11,12,13,14。这些细胞器的形成缺陷或其货物分选异常可导致眼皮肤白化病及其他临床表型，如在Hermansky-Pudlak综合征中所观察到的情况15,16。

在此，我们描述了一种基于显微镜的简单技术，用于研究和分析再循环内体（REs）。该方法利用了一种定位于再循环内体上的跨膜蛋白——Qa-SNARE Syntaxin（STX）1317 在黑色素细胞中，在分选内体与黑色素体之间循环12,18此外，删除N端无序调控结构域（即SynN或STX13）Δ129）使SNARE滞留在黑素体中，从而检测向黑素体运输的正向转运途径12我们已在研究中使用了一种已知的循环内体标志物Rab GTP酶（Rab）1114,19GFP-STX13 蛋白的荧光成像WTGFP-STX13Δ129，野生型黑素细胞中mCherry-Rab11与TYRP1的共定位分析及其相对定位关系的定量，可揭示回收内体的性质与动态行为，以及其向黑素体的靶向运输过程。因此，该方法是一种可用于可视化并定量分析黑素细胞中回收内体动态的简便技术。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

该方案包括黑素细胞的接种，随后进行质粒转染。后续步骤包括细胞固定、免疫染色、成像以及对逆行性囊泡（REs）长度和数量的分析。以下为该方案的详细描述。

1. 在预处理的盖玻片上接种小鼠黑素细胞

  1. 在培养皿（例如，35 mm 培养皿中放置 4 - 5 个）中用基底膜基质培养基（按 1:20 稀释于完全 RPMI 培养基中：RPMI + 10% 热灭活 FBS + 1× 谷氨酰胺 + 1× 抗生素混合液）包被玻璃盖玻片，并在组织培养超净台中干燥 15 分钟。使用前用 1× PBS 洗涤盖玻片一次。
  2. 将野生型小鼠黑素细胞（来自 C57BL/6J 小鼠的 melan-Ink4a-Arf-1 细胞，a/a，Ink4a-Arf-/-，如文献20所述，可从 The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank 获得）在培养皿（例如 35 或 60 mm 培养皿）中，使用完全 RPMI 培养基进行培养。
    1. 用 1× PBS 洗涤细胞两次，加入 0.5 或 1 mL 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）溶液以消化细胞。于 37 °C 孵育 2 - 5 分钟，使细胞从培养皿上脱落。
    2. 加入 1 - 2 mL 完全 RPMI 培养基，重悬细胞后转移至离心管中。
  3. 将细胞悬液在 4 °C 下以 376 × g 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1× PBS 中。
  4. 重复一次离心步骤，并将细胞重悬于 1 mL 完全 RPMI 培养基中。
  5. 将细胞以 50–60% 汇合度接种至包被有基底膜基质培养基的盖玻片上（约 6 × 105 个细胞接种于含 4 - 5 个盖玻片的 35 mm 细胞培养皿中）。始终向含完全 RPMI 培养基的接种细胞悬液中添加 200 nM PMA（加入 5 µL 工作浓度为 40 µM 的佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯）。
  6. 接种后，将培养板于 37 °C 孵育 12 - 24 小时。

2. 使用 STX13 质粒转染细胞

  1. 使用以下试剂：pEGFP-C1-STX13WT 和 pEGFP-C1-STX13Δ129（见参考文献12）。mCherry-Rab11 由巴黎居里研究所 Graça Raposo 惠赠（见参考文献19）。抗 TYRP1 抗体来自 ATCC（TA99）。
  2. 接种细胞后 12–24 小时，使用基于脂质的转染试剂对细胞进行质粒转染。对于 35 mm 培养皿，取 5 µL 转染试剂加入 250 µL OPTI-MEM 培养基中于微量离心管内，另取每种质粒各约 200 ng 溶于 250 µL OPTI-MEM 中。
  3. 将含有 DNA 和转染试剂的离心管室温孵育 5 分钟。混合时避免反复吹打（总体积约为 500 µL）。室温下继续孵育 30 分钟，期间每 10 分钟用手轻弹管壁一次，共 3 次。
  4. 孵育期间，用 1× PBS 洗涤细胞两次，再用 OPTI-MEM 洗涤一次，随后向细胞中加入 1 mL OPTI-MEM 培养基。
  5. 孵育 30 分钟后，将转染试剂-DNA 混合物以滴加方式均匀覆盖于培养皿中，加入细胞。
  6. 将细胞在 37 °C 下孵育 6 小时。吸除含转染试剂的 OPTI-MEM 培养基，加入补充有 200 nM PMA 的完全 RPMI 培养基。
  7. 将细胞在 37 °C 下继续孵育 48 小时。

3. 细胞固定

注意：以下操作在组织培养罩外进行。

  1. 转染48小时后，用1×PBS洗涤细胞两次，然后用新配制的3%甲醛（溶于1×PBS中）固定细胞30分钟。
  2. 固定后，用1×PBS再次洗涤细胞两次，并将盖玻片保存在1×PBS中以备后续使用。或者，可将细胞直接封片于载玻片上（见下文），或于4 °C保存。

4. 细胞免疫染色

  1. 准备一个湿盒：将一块石蜡膜放在培养皿中湿润的滤纸上，并用铝箔覆盖。
  2. 配制25 µL一抗溶液（含0.2%皂苷、0.1% BSA和0.02%叠氮化钠的1x PBS溶液），按1:200稀释抗体。将该溶液以液滴形式加至湿盒中的石蜡膜上。
  3. 用镊子小心提起盖玻片，将其细胞面朝下倒置在湿盒中的一抗溶液液滴上，然后盖上湿盒盖子。室温孵育30分钟。
  4. 同样地，按1:500稀释二抗溶液，并将其滴加在湿盒中石蜡膜上靠近盖玻片的位置。若需对细胞核染色，可在溶液中加入DAPI（稀释比例为1:20,000至1:30,000）。
  5. 用镊子小心从一抗溶液中取出盖玻片，在玻璃烧杯中的1x PBS中浸洗三次。
  6. 将盖玻片轻压在纸巾上，吸去多余的PBS。随后将其细胞面朝下放置于湿盒中的二抗染色溶液液滴上，注意避免光照，因溶液中含有荧光标记抗体。
  7. 再次室温孵育30分钟。在整个操作过程中，请始终注意标记盖玻片上有细胞的一面。
  8. 孵育结束后，用镊子小心从二抗溶液中取出盖玻片，在1x PBS中浸洗三次。再将盖玻片轻压在纸巾上，吸去多余液体。
  9. 取12 µL Fluoromount-G封片试剂滴加于载玻片上，小心将染色后的盖玻片（细胞面朝向载玻片）置于封片试剂上。将载玻片倒扣在纸巾上，轻轻按压以排除气泡。

5. 细胞的荧光显微镜观察

  1. 使用配备CCD相机和60倍（油镜）复消色差物镜或具有类似配置的倒置荧光显微镜，在明场（BF）和荧光（IF）滤光片下对染色细胞进行成像。

6. RE 定位蛋白与黑色素体共定位的定量分析：

注意：以下步骤用于使用 Fiji 软件（可从链接 https://imagej.net/software/fiji/ 免费下载）对蛋白质之间的 Manders 重叠系数进行定量分析。请使用包含多个通道的 TIFF 图像。

  1. 打开原始图像。进入图像选项，选择颜色 | 拆分通道，并使用两个通道进行分析。
  2. 在插件选项中打开JACoP插件。
  3. 为两个通道设置阈值，使所有亮斑被选中，同时去除背景。
  4. 进入分析选项，选择M1和M2系数以获得Manders重叠系数。
  5. 点击JACoP插件中的分析选项，查看显示Manders重叠系数的结果。

7. 回收内体管状结构数量与长度的定量分析：

注意：以下步骤用于使用 Fiji 软件对管状结构的数量和长度进行定量分析。

  1. 打开原始图像，前往 图像选项，选择 颜色 | 拆分通道，并使用所需的通道进行分析。
  2. 再次前往 图像，选择 类型 | 转换为 8 位图像。
  3. 然后前往 插件，选择 分析 | 管状结构检测。将 sigma 值设置为 0.1075，点击 确定。
  4. 再次前往 图像，选择 类型 | 转换为 8 位图像。
  5. 前往 图像 | 调整 | 阈值（所有图像使用相同的阈值设置。图像的强度应大致相等）。
  6. 前往 处理 | 二值化 | 转换为蒙版。
  7. 前往 处理，选择 二值化，然后选择 骨架化。
  8. 前往 分析，选择 骨架，然后选择 分析骨架。在 结果与输出 | 中选择 (a) 计算最长最短路径 | (b) 显示 详细信息 | (c) 显示 标记的骨架。点击 确定。
    注意：结果将以表格形式打开。“平均分支长度”列显示所选细胞中所有不同小管的长度（设置比例尺后可获得以微米为单位的数值）。
  9. 为获得细胞中小管的数量，前往 分析，选择 分析颗粒 选项。点击 确定。
    注意：在获得的结果中，“计数”列显示该特定细胞中小管的数量。
  10. 保存数据并进行分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

STX13Δ129 突变体在黑素体中定位的定量分析
在小鼠野生型黑素细胞中对 STX13 进行免疫荧光显微镜观察显示，GFP-STX13WT 定位于囊泡状和管状结构，而 GFP-STX13Δ129 除定位于细胞表面外，还呈现环状结构（图 1A）。此外，细胞内环状的 GFP-STX13Δ129 与黑素体蛋白 TYRP1 共定位（图 1A），并在明场成像的黑素体中也观察到类似结果（未显示）12。如前所述，过表达的 GFP-STX13WT 有一部分可被观察到定位于黑素体中12。为了测量 GFP-STX13WT 和 GFP-STX13Δ129 相对于黑素体的定位程度，我们使...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

回收内体是一类内吞细胞器，可在所有细胞类型中介导货物向细胞表面的再循环21,22,23,24,25。在黑色素细胞等特化细胞类型中，这些细胞器会部分改变其运输路径，将物质转运至黑色素体以参与其生物发生过程3,16,26。此外，回收内体在早期内体或分选内体完成货物分选后形成，在形态上表现为管状-泡状结构。其动态特征（数量和长度）依赖于多种细胞因素，包括马达蛋白21,22,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由生物技术部（BT/PR32489/BRB/10/1786/2019，资助编号SRGS）；科学与工程研究委员会（CRG/2019/000281，资助编号SRGS）；DBT-国家生物科学中心（BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20，资助编号SRGS）以及印度科学理工学院与DBT合作项目（资助编号SRGS）提供资助。本部门的基础设施得到了DST-FIST、DBT和UGC的支持。AMB由DBT-博士研究员项目（DBT/2015/IISc/NJ-02）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗TYRP1抗体（TA99）ATCCHB-8704
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668-500
Matrigel基质BD Biosciences356231
OPTI-MEMThermoFisher Scientific022600-050
佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯Sigma-AldrichP8139
RPMI 1640培养基ThermoFisher Scientific31800-022

参考文献

  1. Dell'Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
  2. Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).
  3. Ohbayashi, N., Fukuda, M. Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).
  4. Theos, A. C., et al. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).
  5. Di Pietro, S. M., et al. BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes. Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).
  6. Setty, S. R., et al. BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles. Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).
  7. Delevoye, C., et al. AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis. Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).
  8. Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles. Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).
  9. Sitaram, A., et al. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).
  10. Nag, S., et al. Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles. Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).
  11. Dennis, M. K., et al. BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery. Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).
  12. Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis. Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).
  13. Shakya, S., et al. Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes. EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).
  14. Bowman, S. L., et al. A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers. Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173(2021).
  15. Wei, M. L. Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function. Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).
  16. Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases. Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).
  17. Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).
  18. Mahanty, S., et al. Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).
  19. Delevoye, C., et al. Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A. Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).
  20. Ha, L., et al. ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).
  21. Soldati, T., Schliwa, M. Powering membrane traffic in endocytosis and recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).
  22. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  23. Hsu, V. W., Prekeris, R. Transport at the recycling endosome. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).
  24. Taguchi, T. Emerging roles of recycling endosomes. Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).
  25. Goldenring, J. R. Recycling endosomes. Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).
  26. Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system. Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).
  27. Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. Getting active: protein sorting in endocytic recycling. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).
  28. Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. A modular tethering complex for endosomal recycling. Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).
  29. Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin. Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

黑色素体发生免疫荧光显微镜Syntaxin-13黑色素细胞货物递送内体动态Rab11标记管状结构定量ImageJ分析
基于显微镜的检测方法用于通过SNARE运输研究和分析循环内体
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。