通过蔗糖密度梯度离心法提取肝糖原时，确定了最佳的蔗糖浓度。加入10分钟煮沸步骤以抑制糖原降解酶，证明具有显著益处。
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摘要
摘要
肝糖原是一种高度分支的葡萄糖聚合物，在动物体内参与维持血糖水平的稳定。糖原的性质受其结构的影响，因此，采用一种能够分离出具有代表性的糖原样品的合适提取方法，对于研究这种大分子至关重要。与其他提取方法相比，采用蔗糖密度梯度离心步骤的方法可最大限度地减少分子损伤。基于该方法，近期一项研究报道了在离心过程中通过调整蔗糖溶液的密度（30%、50%、72.5%），以确定最适合提取多种尺寸糖原颗粒的浓度，从而减少小颗粒的损失。该研究还引入了10分钟煮沸步骤，以检验其使糖原降解酶变性的能力，从而实现糖原的保存。结果表明，最低的蔗糖浓度（30%）结合煮沸步骤，能够提取出最具代表性的糖原样品。
引言
糖原是一种复杂的高度分支葡萄糖聚合物，存在于动物、真菌和细菌中1。在哺乳动物中，肝糖原作为血糖的缓冲剂，维持体内血糖稳态，而肌糖原则作为短期葡萄糖储存库，直接提供能量2。糖原的结构通常分为三个层次（见图1）：1. 葡萄糖单体通过(1→4)-α糖苷键形成线性链，分支点则通过(1→6)-α糖苷键连接；2. 高度分支的β颗粒（直径约20 nm），在骨骼肌等组织中作为独立的糖原分子发挥作用3,4；3. 更大的α糖原颗粒（直径可达300 nm），由较小的β糖原单元组成，主要存在于肝脏5、心脏6以及某些非哺乳动物物种中7。来自糖尿病小鼠的肝α颗粒在分子结构上较为脆弱，在二甲基亚砜（DMSO）中溶解时容易降解为β颗粒，而非糖尿病对照组的α颗粒通常保持稳定。一种假说认为，这种结构脆弱性可能加剧糖尿病中观察到的血糖调节障碍，脆弱的α颗粒可能导致更多比例的、更易快速降解的β颗粒产生8,9,10,11。
传统的糖原提取方法通常采用相对剧烈的条件，例如将肝组织暴露于热碱性溶液12或酸性溶液（如三氯乙酸（TCA）13或高氯酸（PCA）14）中。尽管这些方法在分离肝组织中糖原与其他成分方面效果显著15,16，但不可避免地会在一定程度上破坏糖原的结构。虽然这些方法适用于糖原含量的定量测定，但由于会造成结构损伤，因此并不适合需要获取糖原结构信息的研究。自这些方法问世以来，已开发出一种更为温和的提取方法，该方法采用冷Tris缓冲液（已被证明可抑制葡萄糖苷酶降解）结合蔗糖密度梯度超速离心17,18,19。通过将pH值控制在约8，该方法避免了糖原在先前方法中所经历的酸性或碱性水解过程。
通过蔗糖密度梯度超速离心法可将匀浆化肝组织中的糖原颗粒与大部分细胞成分分离。如有必要，还可通过制备型凝胶过滤色谱进行进一步纯化，从而获得带有糖原结合蛋白的纯化糖原20。尽管该方法条件较为温和，更有利于保持糖原的结构完整性，但难以完全避免部分糖原在上清液中丢失，尤其是密度较低的小型糖原颗粒15。另一种可能导致糖原损失的原因是，温和条件可能允许一定程度的酶解反应发生，导致糖原得率低于更剧烈的提取方法。近期研究报道了对肝糖原提取方法的优化，以更好地保持糖原结构21。本研究中测试了不同浓度的蔗糖溶液（30%、50%、72.5%），以确定较低的蔗糖浓度是否能够减少小型糖原颗粒的损失。其原理在于，较低的密度环境有助于较小且密度较低的颗粒穿透蔗糖层，并与其余糖原一起聚集于沉淀中。
本研究比较了是否包含10分钟煮沸步骤的提取方法，以检验糖原降解酶是否可被变性，从而提取出更多且未发生部分降解的糖原。通过全分子尺寸分布和糖原链长分布来确定提取糖原的结构，该方法类似于先前发表的淀粉提取优化研究22。采用带有差示折光（DRI）检测器的尺寸排阻色谱法（SEC）获取糖原的尺寸分布，该分布描述了分子大小对应的总分子量。采用荧光标记辅助碳水化合物电泳法（FACE）分析链长分布，该分布描述了每种特定长度（或聚合度）的葡萄糖苷链的相对数量。本文描述了基于先前优化研究21的从肝脏组织中提取糖原的方法。实验结果表明，最有利于保持糖原结构完整性的方法是使用30%蔗糖浓度并包含10分钟煮沸步骤。
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方案
用于优化本实验方案的小鼠肝脏21 来自12只雄性BKS-DB/Nju品系小鼠（7.2周龄，见下文） 材料表动物使用已获得武汉大学人民医院动物护理与伦理委员会批准，IACUC 批准号：WDRM 20181113。
1 动物组织
- 称取小鼠肝脏（每只小鼠的完整肝脏为 1-1.8 g）。
- 将小鼠肝脏在液氮中迅速冷冻，并于 -80 °C 保存。
2. 缓冲液和试剂的制备
- 使用去离子水配制糖原分离缓冲液，其中含 5 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF 和 5 mM 焦磷酸钠，并将 pH 调至 8。
- 配制 30% (w/w) 蔗糖溶液（已被证明是肝脏糖原分离最优化的条件21）。
- 配制醋酸钠缓冲液（1 M，pH 4.5）、醋酸缓冲液（0.1 M，pH 3.5）、氢氧化钠溶液（0.1 M）和氰基硼氢化钠溶液（1 M）。
- 将 5 mg 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸（APTS）加入 50 µL 15% 冰醋酸中，配制 APTS 溶液。
- 配制含 50 mM 硝酸铵和 0.02% 叠氮化钠的硝酸铵溶液。
3. 糖原提取（图2）
- 将冷冻的肝组织（约1 g）转移至含有6 mL糖原分离缓冲液的15 mL离心管中。
- 保持冰上操作，使用组织匀浆器对肝组织进行匀浆。
- 取一半匀浆液（3 mL）转移至新离心管中，煮沸10分钟（已证明此条件最适合糖原结构研究21）。将另一半匀浆液（3 mL）继续置于冰上，用于提取仍保持天然状态的糖原及其结合蛋白。
注意：在糖原提取过程中，未煮沸的样品必须始终置于冰上。若研究中无需关注糖原结合蛋白，可将全部样品均进行10分钟煮沸处理。 - 从每管中取出8 µL等分试样，保持冰上放置，用于后续糖原含量测定（见第4节）。
- 将剩余匀浆液在4 °C条件下以6,000 × g离心10分钟。
- 将上清液转移至超速离心管中，在4 °C条件下以3.6 × 105 g离心90分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于1.5 mL糖原分离缓冲液中。
- 在4 mL超速离心管中，将样品叠加于1.5 mL 30%蔗糖溶液之上，在4 °C条件下以3.6 × 105 g离心2小时。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于200 µL去离子水中。
- 向悬液中加入800 µL无水乙醇，充分混匀以沉淀糖原23,24。将混合物于-20 °C保存至少1小时，以确保充分沉淀。
- 在4 °C条件下以6,000 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于200 µL去离子水中。
- 重复该乙醇沉淀步骤3次，最终将糖原沉淀重悬于200 µL去离子水中。
- 从每管中取出8 µL等分试样，用于糖原含量测定（见第4节）。
- 将剩余上清液用液氮速冻，并冷冻干燥（冻干）过夜。将干燥的糖原样品于-20 °C冰箱中保存。
注意：干燥糖原样品在-20 °C下应可保持稳定；然而目前尚无数据表明其在不发生结构变化的前提下可保存多久。
4. 糖原含量测定（图3）
- 取8 µL糖原上清液（见第3.13和3.4节）、5 µL淀粉葡萄糖苷酶（3269 U/mL）和100 µL醋酸钠缓冲液（1 M，pH 4.5），加入微量离心管中，再用去离子水定容至500 µL。
- 制备对照组，以去离子水替代淀粉葡萄糖苷酶。
- 将样品在50 °C下孵育30分钟，同时将对照组样品置于冰上。
- 在4 °C下以6,000 × g离心10分钟，取各上清液300 µL与1 mL葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）试剂混合。
- 通过将含0、10、20、30、40和50 µg D-葡萄糖的去离子水各300 µL分别与1 mL GOPOD试剂混合，绘制标准曲线。
- 将混合物在50 °C下继续孵育30分钟。
- 使用紫外-可见分光光度计，在96孔板中（每孔150 µL）测定各样品在510 nm处的吸光度。
- 从实验样品的吸光度中减去对照样品（不含淀粉葡萄糖苷酶）的吸光度，然后根据D-葡萄糖标准曲线计算糖原含量。
5. 粗提物得率、糖原得率及纯度测定
- 对于粗提得率，称量冻干的糖原样品，并以湿肝组织质量的百分比形式计算得率。
注意：该得率应根据每步糖原含量测定中所取的等分试样进行校正。 - 对于糖原纯度，按照第4节所述方法测定最终沉淀中的糖原含量。将纯度计算为最终沉淀中测定的糖原含量占粗提得率的百分比（见步骤5.1）。
- 对于糖原回收率，按照第4节所述方法测定未煮沸且未进行任何离心处理的匀浆样品中的糖原含量。将糖原回收率计算为最终沉淀中糖原含量（见步骤5.2）与初始匀浆中测定的糖原含量的百分比。
6. 链长分布分析（图4）
- 在1.5 mL离心管中称取0.5 mg冻干糖原。
- 向管中加入90 µL去离子水和1.5 µL叠氮化钠溶液（0.04 g/mL）。
- 向管中加入5 µL乙酸缓冲液（0.1 M，pH 3.5）和2 µL异淀粉酶溶液（180 U/mg），以去除糖原的支链。
- 将样品在37 °C孵育3小时。
- 向样品中加入5 µL氢氧化钠溶液（0.1 M），将pH调至7.0。
- 用液氮速冻样品，并冷冻干燥（冻干）过夜。
- 向冻干的去支链糖原中加入2 µL APTS溶液（5 mg APTS溶于50 µL 15%冰乙酸中）和2 µL氰基硼氢化钠溶液（1 M）。
- 将样品在4,000 × g离心2分钟。
- 将样品在60 °C避光孵育3小时。
NOTE: 可用铝箔包裹离心管以避光。 - 向样品中加入200 µL去离子水，并涡旋振荡至所有沉淀完全溶解。
- 将样品在4,000 × g离心2分钟。
- 取50 µL等分试样转移至荧光标记碳水化合物电泳（FACE）微量样品瓶中进行分析。
NOTE: 数据以每个聚合度（DP，符号 X）对应的（去支链）链的相对丰度（Nde(X)）表示。
7. 分子大小分布的分析（图5）
- 将0.5 mg冻干糖原溶解于50 mM硝酸铵和0.02%叠氮化钠溶液中，浓度为1 mg/mL。
- 在80 °C、300 rpm条件下，于恒温混匀仪中孵育样品3 h。
- 使用预柱及1000 Å和10,000 Å色谱柱，在80 °C、流速0.3 mL/min的条件下，将样品注入SEC系统（参见材料表）。采用折射率检测器测定每个洗脱体积下分子的相对分子量。
- 利用摩尔质量范围为342至1.22 × 106的聚半乳糖醛酸（PSS）标准品， 绘制SEC普适校准曲线，将洗脱时间转换为Rh （流体力学半径）。将差示折射率（DRI）检测器的数据表示为SEC质量分布w (log Rh)，作为Rh的函数。
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结果
尽管上述描述的步骤是最优方法（使用30%蔗糖并添加10分钟煮沸步骤），但此处仍提供通过三种不同蔗糖浓度（30%、50%、72.5%）提取糖原的数据，每种浓度均分别在有无煮沸步骤的条件下进行，方法如前所述21。根据该实验方案，不同条件下提取的干燥糖原的纯度、粗提得率及糖原得率见表1，数据转载自21。各组在粗提得率和糖原得率方面均无显著差异。相比之下，糖原纯度受到蔗糖浓度（表1，P < 0.001）以及是否添加煮沸步骤（表1，P < 0.0001）的显著影响。使用30%蔗糖浓度并结合10分钟煮沸步骤所提取的糖原纯度最高，因此该条件被确定为所测试条件中最优方案。
分子大小分布用于评估不同条件对最终提取物中分子大小的影响。采用先前所述的水相SEC系统获得这些数据。25将每种分布归一化至相同的最大值，可比较各方法中α与β粒子的相对比例，如...
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讨论
先前的研究表明，糖原的结构对其性质具有重要影响；例如，分子大小会影响糖原的降解速率10，而链长分布则会影响其溶解度26。为了充分理解这些关系，至关重要的是采用一种尽可能分离出具有代表性且未受损样品的方法来提取糖原。传统的提取方法使用高温碱性条件或低温酸性条件。尽管这些方法在分离糖原与其他组织成分方面有效，但其化学条件较为剧烈，已被证明会破坏糖原的分子结构27。
此后开发出一种相对温和的方法，采用蔗糖密度梯度离心17,18，使糖原形成沉淀，而大部分细胞物质则保留在上清液中。该方法特别适用于肝组织，因为糖原α颗粒对酸水解敏感28。然而，这种较温和的方法在分离糖原时，至少存在两种可能导致所获得的糖原结构与体内（in vivo）结构不同的机制：1）较小且密度较低的糖原...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢吴高升先生和朱云文女士在 FACE 实验中的技术支持，以及胡振霞先生和邓斌先生在 SEC 实验中的技术支持。MAS 获得了昆士兰先进研究奖学金（Advance Queensland Industry Research Fellowship）、Mater 基金会、Equity Trustees 以及 L G McCallam 遗产基金和 George Weaber 信托基金的资助。本研究得到了江苏省高校优势学科建设工程、国家自然科学基金项目（编号：C1304013151101138）以及 2017 年江苏省创新创业人才计划的资助。图 1-5 使用 BioRender 软件绘制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸钠（APTS） | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M 溶液 |
| 乙酸 | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M，pH 3.5 溶液 |
| Agilent 1260 Infinity SEC 系统 | Agilent, Santa Clara, CA, USA | 尺寸排阻色谱（SEC） | |
| BKS-DB/Nju 背景小鼠 | 南京大学南京生物医药研究院 | ||
| D-葡萄糖检测试剂盒（GOPOD 法） | Megazyme | K-GLUC | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| 匀浆器 | IKA | T 25 | |
| 盐酸 | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M 溶液 |
| 盐酸 | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M 溶液 |
| P/ACE MDQ plus 系统 | Ab Sciex, US | 荧光标记辅助碳水化合物电泳（FACE） | |
| 示差折光检测器 | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA | 尺寸排阻色谱（SEC） | |
| 乙酸钠 | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M，pH 4.5 溶液 |
| 叠氮化钠 | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| 氯化钠 | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| 氰基硼氢化钠 | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M 溶液 |
| 氟化钠 | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| 氢氧化钠 | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M 溶液 |
| 硝酸钠 | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| 焦磷酸钠 | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| 蔗糖 | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA 预柱、1,000 和 10,000 柱 | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | 尺寸排阻色谱（SEC） | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| 超速离心管 | Beckman | 4 mL，开口薄壁超透明管，11 x 60 mm |
参考文献
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