通过蔗糖密度梯度离心法提取肝糖原时，确定了最佳的蔗糖浓度。加入10分钟煮沸步骤以抑制糖原降解酶，证明具有显著益处。
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摘要
摘要
肝糖原是一种高度分支的葡萄糖聚合物，在动物体内参与维持血糖水平的稳定。糖原的性质受其结构的影响，因此，采用一种能够分离出具有代表性的糖原样品的合适提取方法，对于研究这种大分子至关重要。与其他提取方法相比，采用蔗糖密度梯度离心步骤的方法可最大限度地减少分子损伤。基于该方法，近期一项研究报道了在离心过程中通过调整蔗糖溶液的密度（30%、50%、72.5%），以确定最适合提取多种尺寸糖原颗粒的浓度，从而减少小颗粒的损失。该研究还引入了10分钟煮沸步骤，以检验其使糖原降解酶变性的能力，从而实现糖原的保存。结果表明，最低的蔗糖浓度（30%）结合煮沸步骤，能够提取出最具代表性的糖原样品。
引言
糖原是一种复杂的高度分支葡萄糖聚合物，存在于动物、真菌和细菌中1。在哺乳动物中，肝糖原作为血糖的缓冲剂，维持体内血糖稳态，而肌糖原则作为短期葡萄糖储存库，直接提供能量2。糖原的结构通常分为三个层次（见图1）：1. 葡萄糖单体通过(1→4)-α糖苷键形成线性链，分支点则通过(1→6)-α糖苷键连接；2. 高度分支的β颗粒（直径约20 nm），在骨骼肌等组织中作为独立的糖原分子发挥作用3,4；3. 更大的α糖原颗粒（直径可达300 nm），由较小的β糖原单元组成，主要存在于肝脏5、心脏6以及某些非哺乳动物物种中7。来自糖尿病小鼠的肝α颗粒在分子结构上较为脆弱，在二甲基亚砜（DMSO）中溶解时容易降解为β颗粒，而非糖尿病对照组的α颗粒通常保持稳定。一种假说认为，这种结构脆弱性可能加剧糖尿病中观察到的血糖调节障碍，脆弱的α颗粒可能导致更多比例的、更易快速降解的β颗粒产生8,9,
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方案
用于优化本实验方案的小鼠肝脏21 来自12只雄性BKS-DB/Nju品系小鼠（7.2周龄，见下文） 材料表动物使用已获得武汉大学人民医院动物护理与伦理委员会批准，IACUC 批准号：WDRM 20181113。
1 动物组织
- 称取小鼠肝脏（每只小鼠的完整肝脏为 1-1.8 g）。
- 将小鼠肝脏在液氮中迅速冷冻，并于 -80 °C 保存。
2. 缓冲液和试剂的制备
- 使用去离子水配制糖原分离缓冲液，其中含 5 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF 和 5 mM 焦磷酸钠，并将 pH 调至 8。
- 配制 30% (w/w) 蔗糖溶液（已被证明是肝脏糖原分离最优化的条件21）。
- 配制醋酸钠缓冲液（1 M，pH 4.5）、醋酸缓冲液（0.1 M，pH 3.5）、氢氧化钠溶液（0.1 M）和氰基硼氢化钠溶液（1 M）。
- 将 5 mg 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸（APTS）加入 50 µL 15% 冰醋酸中，配制 APTS 溶液。
- 配制含 50 mM 硝酸铵和 0.02% 叠氮化钠的硝酸铵溶液。 ....
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结果
尽管上述描述的步骤是最优方法（使用30%蔗糖并添加10分钟煮沸步骤），但此处仍提供通过三种不同蔗糖浓度（30%、50%、72.5%）提取糖原的数据，每种浓度均分别在有无煮沸步骤的条件下进行，方法如前所述21。根据该实验方案，不同条件下提取的干燥糖原的纯度、粗提得率及糖原得率见表1，数据转载自21。各组在粗提得率和糖原得率方面均无显著差异。相比之下，糖原纯度受到蔗糖浓度（表1，P < 0.001）以及是否添加煮沸步骤（表1，P < 0.0001）的显著影响。使用30%蔗糖浓度并结合10分钟煮沸步骤所提取的糖原纯度最高，因此该条件被确定为所测试条件中最优方案。
分子大小分布用于评估不同条件对最终提取物中分子大小的影响。采用先前所述的水相SEC系统获得这些数据。25将每种分布归一化至相同的最大值，可比较各方法中α与β粒子的相对比例，如.......
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讨论
先前的研究表明，糖原的结构对其性质具有重要影响；例如，分子大小会影响糖原的降解速率10，而链长分布则会影响其溶解度26。为了充分理解这些关系，至关重要的是采用一种尽可能分离出具有代表性且未受损样品的方法来提取糖原。传统的提取方法使用高温碱性条件或低温酸性条件。尽管这些方法在分离糖原与其他组织成分方面有效，但其化学条件较为剧烈，已被证明会破坏糖原的分子结构27。
此后开发出一种相对温和的方法，采用蔗糖密度梯度离心17,18，使糖原形成沉淀，而大部分细胞物质则保留在上清液中。该方法特别适用于肝组织，因为糖原α颗粒对酸水解敏感28。然而，这种较温和的方法在分离糖原时，至少存在两种可能导致所获得的糖原结构与体内（in vivo）结构不同的机制：1）较小且密度较低的糖原.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢吴高升先生和朱云文女士在 FACE 实验中的技术支持，以及胡振霞先生和邓斌先生在 SEC 实验中的技术支持。MAS 获得了昆士兰先进研究奖学金（Advance Queensland Industry Research Fellowship）、Mater 基金会、Equity Trustees 以及 L G McCallam 遗产基金和 George Weaber 信托基金的资助。本研究得到了江苏省高校优势学科建设工程、国家自然科学基金项目（编号：C1304013151101138）以及 2017 年江苏省创新创业人才计划的资助。图 1-5 使用 BioRender 软件绘制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸钠（APTS） | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M 溶液 |
| 乙酸 | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M，pH 3.5 溶液 |
| Agilent 1260 Infinity SEC 系统 | Agilent, Santa Clara, CA, USA | 尺寸排阻色谱（SEC） | |
| BKS-DB/Nju 背景小鼠 | 南京大学南京生物医药研究院 | ||
| D-葡萄糖检测试剂盒（GOPOD 法） | Megazyme | K-GLUC | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| 匀浆器 | IKA | T 25 | |
| 盐酸 | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M 溶液 |
| 盐酸 | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M 溶液 |
| P/ACE MDQ plus 系统 | Ab Sciex, US | 荧光标记辅助碳水化合物电泳（FACE） | |
| 示差折光检测器 | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA | 尺寸排阻色谱（SEC） | |
| 乙酸钠 | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M，pH 4.5 溶液 |
| 叠氮化钠 | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| 氯化钠 | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| 氰基硼氢化钠 | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M 溶液 |
| 氟化钠 | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| 氢氧化钠 | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M 溶液 |
| 硝酸钠 | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| 焦磷酸钠 | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| 蔗糖 | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA 预柱、1,000 和 10,000 柱 | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | 尺寸排阻色谱（SEC） | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| 超速离心管 | Beckman | 4 mL，开口薄壁超透明管，11 x 60 mm |
参考文献
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K.
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