开发了一种非标记、非放射性同位素的检测方法，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）直接分析含有无嘌呤/无嘧啶位点的产物，以测定尿嘧啶-DNA糖基化酶活性。该方法被证明在DNA糖基化酶活性检测中具有操作简便、特异性强、快速且易于使用的特点。
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方法文章
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是碱基切除修复通路中的关键组分，负责修复由胞嘧啶水解性脱氨形成的尿嘧啶，因此对维持基因组完整性至关重要。本研究建立了一种高特异性、无标记、非放射性同位素的方法用于检测UDG活性。该方法使用含有位点特异性尿嘧啶的合成DNA双链，经UDG切割后，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析。我们建立了一套可保持DNA中脱嘌呤/脱嘧啶位点（AP位点）产物完整而不发生链断裂的实验方案。通过底物与产物之间质荷比（m/z）的变化，评估UDG催化的尿嘧啶水解反应。采用G:U底物进行UDG动力学分析，获得动力学参数：Km = 50 nM，Vmax = 0.98 nM/s，Kcat = 9.31 s-1。将该方法应用于尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）的检测，测得IC50值为7.6 pM。利用该方法分析UDG在单链和双链DNA底物中不同位置尿嘧啶的识别特异性，结果显示其切割效率存在差异。因此，这种简单、快速且通用的MALDI-TOF MS方法可作为多种单功能DNA糖基化酶研究的优良参考方法，同时也具备用于DNA糖基化酶抑制剂筛选的潜力。
引言
尽管尿嘧啶是RNA中的正常碱基，但它在基因组DNA中是一种常见且具有高度致突变性的损伤。DNA中的尿嘧啶可由脱氧胞苷发生自发性或酶促水解脱氨反应而产生。在每个活细胞中，在生理条件下，这种脱氨反应每天发生100至500次1,2。如果这些改变未被修复，就可能导致DNA序列组成的改变，从而引发突变。由于DNA中的尿嘧啶在复制过程中倾向于与dATP配对，因此当胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶后，经过两轮复制，在一半的子代DNA中将出现新的G:C到A:T的转换突变3。
在维持基因组稳定性的细胞机制中，碱基切除修复（base excision repair, BER）是一种关键机制，可修复DNA中的受损碱基，例如尿嘧啶4。BER是一种在进化上高度保守的过程。该修复途径主要包括两种类型：短片段修复途径，产生单个核苷酸的修复片段；以及长片段修复途径，产生至少两个核苷酸长度的修复片段5。BER是一个协调有序的多步骤过程。其第一步由特定的DNA糖基化酶催化，水解受损核苷酸碱基，形成无嘌呤/无嘧啶（apurinic/apyrimidinic, AP）位点中间体6。随后，内切核酸酶在AP位点切割糖-磷酸骨架....
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方案
1. 底物/模板制备
- 设计尿嘧啶底物/模板双链，使其G+C含量平衡在约50 ± 10%，双链区域的最低熔解温度为50 °C。
注意：18 nt底物与19 nt模板之间存在一个核苷酸的差异（表1和图1），有助于更好地解释质谱信号并实现适当的退火。模板链作为互补DNA用于产生A-U或G-U错配（表1），也可在质谱检测中用作参考信号。本研究中使用HPLC纯化的合成寡核苷酸即可满足要求。 - 将DNA溶解于含1 mM EDTA和10 mM Tris-HCl（25 °C时pH 8.0）的TE缓冲液中，配制成100 µmol/L的储存液，并于-20 °C保存。取20 µL该储存液用TE缓冲液稀释至终体积800 µL（25倍稀释至4 µmol/L）。使用紫外-可见分光光度计在λ = 260 nm处测定DNA溶液的吸光度，以确认其浓度与厂家标示值一致。例如：4 µmol/L的U+9溶液A260 = 0.204，4 µmol/L的T1溶液A260 = 0.192（表1）。
- 通过MALDI-TOF质谱分析（第4–6节）对寡核苷酸进行质量控制，检查其在指定m/z值处是否存在唯一的峰信号，并确认信噪比>100（图1B和
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结果
模板与底物
以中心位置含有尿嘧啶（U+9）并与鸟嘌呤（G）模板配对的合成寡核苷酸为例（图 1A），可使用等摩尔量的模板与含尿嘧啶底物的空白对照，用于评估合成寡核苷酸纯度的质量控制（图 1B；信号与指定的 m/z 值一致，且背景噪声较低）。在质谱数据分析中，测量了峰高（图 2）。19 nt 的模板 DNA 在糖基化酶水解后预期保持不变；因此，该信号可作为 AP 产物定量的参考（图 1C）。
反应条件与质谱
该DNA糖基化酶检测方法简便易行，使用未标记的寡核苷酸进行标准反应，即可获得清晰且可靠的结果 (图1)质谱图的范围应覆盖由底物、模板.......
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讨论
本文提供了一种使用UDG MALDI-TOF MS检测方法直接检测含脱氨基碱基（AP）位点DNA产物的详细实验流程。该方法的主要优势在于，含尿嘧啶的底物无需标记、可扩展性强、操作简便，并且在底物设计上具有更高的灵活性。
根据UDG供应商的建议，采用苯酚/氯仿抽提法可使酶失活，从而防止产物DNA降解。然而，苯酚抽提步骤涉及繁琐的危险化学品相分离操作。另一种替代方法是使用HCl进行酸性终止，将反应体系pH降至2 ± 0.5，同样可有效使UDG失活。随后用Tris碱中和可避免DNA损伤。当AP产物在30小时内进行质谱分析时，质谱图中未见碱基丢失或修饰的迹象（图1E）。反应中所用Tris缓冲液来自商业UDG试剂盒。然而，包括Tris在内的多种胺类物质在较高浓度下可通过β-消除反应切割AP位点44。为避免AP位点发生β-消除断裂，可考虑使用其他替代缓冲体系，如HEPES或磷酸盐缓冲液。
作为一种潜在的UDG参考方法，建议采用中心位.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢中国台湾台北市国家实验动物中心功能基因组学整合核心设施和中国台湾台北市国家研究资源与生物数据库药理基因组学实验室提供的技术支持。本研究由中华民国科技部资助 [项目编号：MOST109-2314-B-002 -186（K.-Y.S.），MOST 107-2320-B-002-016-MY3（S.-Y.C.），MOST 110-2320-B-002-043（W.-h.F.）]。H.-L. C. 获得了中国台湾大学博士生奖学金。开放获取费用资助单位：中华民国科技部。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇（Tris 碱） | J.T baker | 方案 1,2 | |
| 经高压灭菌的去离子水 | MILLIPORE | 方案 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | 方案 1,2 | |
| 手套 | AQUAGLOVE | 方案 1,2,3 | |
| 盐酸（HCl） | SIGMA | 方案 1,2 | |
| 冰桶 | Taiwan.Inc | 方案 2 | |
| 低吸附移液器吸头（0.5–10 µL） | extra gene | 方案 1,2 | |
| 低吸附移液器吸头（1,250 µL） | national scientific supply co, Inc. | 方案 1,2 | |
| 低吸附移液器吸头（200 µL） | national scientific supply co, Inc. | 方案 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | 方案 4, 5 质谱控制程序包括 Typer Chip Linker、SpectroACQUIRE 和 Start RT Process。 | |
| MassARRAY 纳米点样仪 | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | 方案 3 |
| 微量离心机 | Kubota | 方案 2 | |
| 微量离心机 | Clubio | 方案 2 | |
| 微量离心管（1.5 mL） | National scientific supply co, Inc. | 方案 2 | |
| 微量离心管架 | Taiwan.Inc | 方案 1,2 | |
| 微量移液器 （P1000） | Gilson | 方案 1,2 | |
| 微量移液器 （P2） | Gilson | 方案 1,2 | |
| 微量移液器（P10） | Gilson | 方案 1,2 | |
| 微量移液器（P100） | Gilson | 方案 1,2 | |
| 微量移液器（P200） | Gilson | 方案 1,2 | |
| 微量移液器（SL2） | Rainin | 方案 1,2 | |
| 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies (新加坡) | 方案 1,2 | |
| Quest Graph IC50 计算器（v.1） | AAT Bioquest, Inc. | 图 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | WAKO | 方案 2 | |
| SpectroCHIP 芯片阵列 | Agena Bioscience, CA | #01509 | 方案 3, 5 |
| 计时器 | Taiwan.Inc | 方案 2 | |
| Typer 4.0 软件 | Agena Bioscience, CA | #10145 | 方案 6 Typer 4.0 包含四个程序：Assay Designer、Assay Editor、Plate Editor 和 Typer Analyzer。 |
| UDG 反应缓冲液（10×） | New England Biolabs, MA | B0280S | 方案 2 |
| 尿嘧啶糖基化酶抑制剂 | New England Biolabs, MA | M0281S | 方案 2 |
| 尿嘧啶-DNA 糖基化酶 | New England Biolabs, MA | M0280L | 方案 2 |
| 紫外-可见分光光度计 UV-1601 | SHIMADZU | 方案 1 | |
| 水浴锅 | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | 方案 2 |
参考文献
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E.
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重印与许可
