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方法文章

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性

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DOI：

10.3791/63089

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2022年4月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

开发了一种非标记、非放射性同位素的检测方法，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）直接分析含有无嘌呤/无嘧啶位点的产物，以测定尿嘧啶-DNA糖基化酶活性。该方法被证明在DNA糖基化酶活性检测中具有操作简便、特异性强、快速且易于使用的特点。

摘要

尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是碱基切除修复通路中的关键组分，负责修复由胞嘧啶水解性脱氨形成的尿嘧啶，因此对维持基因组完整性至关重要。本研究建立了一种高特异性、无标记、非放射性同位素的方法用于检测UDG活性。该方法使用含有位点特异性尿嘧啶的合成DNA双链，经UDG切割后，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析。我们建立了一套可保持DNA中脱嘌呤/脱嘧啶位点（AP位点）产物完整而不发生链断裂的实验方案。通过底物与产物之间质荷比（m/z）的变化，评估UDG催化的尿嘧啶水解反应。采用G:U底物进行UDG动力学分析，获得动力学参数：Km = 50 nM，Vmax = 0.98 nM/s，Kcat = 9.31 s-1。将该方法应用于尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）的检测，测得IC50值为7.6 pM。利用该方法分析UDG在单链和双链DNA底物中不同位置尿嘧啶的识别特异性，结果显示其切割效率存在差异。因此，这种简单、快速且通用的MALDI-TOF MS方法可作为多种单功能DNA糖基化酶研究的优良参考方法，同时也具备用于DNA糖基化酶抑制剂筛选的潜力。

引言

尽管尿嘧啶是RNA中的正常碱基，但它在基因组DNA中是一种常见且具有高度致突变性的损伤。DNA中的尿嘧啶可由脱氧胞苷发生自发性或酶促水解脱氨反应而产生。在每个活细胞中，在生理条件下，这种脱氨反应每天发生100至500次1,2。如果这些改变未被修复，就可能导致DNA序列组成的改变，从而引发突变。由于DNA中的尿嘧啶在复制过程中倾向于与dATP配对，因此当胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶后，经过两轮复制，在一半的子代DNA中将出现新的G:C到A:T的转换突变3。

在维持基因组稳定性的细胞机制中，碱基切除修复（base excision repair, BER）是一种关键机制，可修复DNA中的受损碱基，例如尿嘧啶4。BER是一种在进化上高度保守的过程。该修复途径主要包括两种类型：短片段修复途径，产生单个核苷酸的修复片段；以及长片段修复途径，产生至少两个核苷酸长度的修复片段5。BER是一个协调有序的多步骤过程。其第一步由特定的DNA糖基化酶催化，水解受损核苷酸碱基，形成无嘌呤/无嘧啶（apurinic/apyrimidinic, AP）位点中间体6。随后，内切核酸酶在AP位点切割糖-磷酸骨架，再由裂解酶清理DNA末端，DNA聚合酶填补缺口，最后由连接酶封闭最终的切口5。

尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）可水解含有尿嘧啶的 DNA 中的尿嘧啶，从而参与大肠杆菌（Escherichia coli）中的碱基切除修复（BER）。传统的 UDG 检测方法使用放射性标记的 DNA，并结合不同的分离技术6,7,8,9,10,11,12,13，通常耗时较长、劳动强度大，需要昂贵的标记试剂，操作步骤复杂，且需经过大量培训和实践以降低接触放射性物质的风险。目前已开发出基于荧光寡核苷酸的检测方法，以替代放射性同位素标记14，此外还包括分子信标和 Förster 共振能量转移技术15,16,17,18,19,20。然而，上述所有方法均需要特定的标记。近年来，已开发出无需标记的生物传感器检测方法21,22,23，以及基于 G-四链体形成的比色法检测方法24,25,26。然而，探针中多个 A:U 碱基对或特殊设计的序列会使酶活性单位的定义变得复杂。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种在DNA分析中具有广泛应用前景的技术。已开发的应用包括单核苷酸多态性分型27,28、修饰核苷酸分析29以及DNA修复中间产物的鉴定30,31,32,33,34。MALDI-TOF MS 应能被迅速应用于DNA糖基化酶分析，以检测含脱嘌呤/脱嘧啶位点（AP位点）的DNA产物。然而，在许多实验条件下，DNA中的AP位点容易导致链断裂33。本文介绍了一种利用MALDI-TOF MS直接测定AP位点生成情况的尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）检测方法，且几乎不受链断裂噪声干扰。该无标记方法操作简便，在DNA糖基化酶抑制剂的药物筛选方面具有很高的应用潜力。

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方案

1. 底物/模板制备

  1. 设计尿嘧啶底物/模板双链，使其G+C含量平衡在约50 ± 10%，双链区域的最低熔解温度为50 °C。
    注意：18 nt底物与19 nt模板之间存在一个核苷酸的差异（表1和图1），有助于更好地解释质谱信号并实现适当的退火。模板链作为互补DNA用于产生A-U或G-U错配（表1），也可在质谱检测中用作参考信号。本研究中使用HPLC纯化的合成寡核苷酸即可满足要求。
  2. 将DNA溶解于含1 mM EDTA和10 mM Tris-HCl（25 °C时pH 8.0）的TE缓冲液中，配制成100 µmol/L的储存液，并于-20 °C保存。取20 µL该储存液用TE缓冲液稀释至终体积800 µL（25倍稀释至4 µmol/L）。使用紫外-可见分光光度计在λ = 260 nm处测定DNA溶液的吸光度，以确认其浓度与厂家标示值一致。例如：4 µmol/L的U+9溶液A260 = 0.204，4 µmol/L的T1溶液A260 = 0.192（表1）。
  3. 通过MALDI-TOF质谱分析（第4–6节）对寡核苷酸进行质量控制，检查其在指定m/z值处是否存在唯一的峰信号，并确认信噪比>100（图1B和图1D）。

2. DNA糖基化酶活性检测

  1. 以 T1/U+9 双链体的 G:U 底物（表 1 和 图 1A）进行糖基化酶反应，例如，在一个 1.5 mL 无菌微量离心管中加入 70 µL H2O、10 µL 10x UDG 反应缓冲液、5 µL T1 储备液和 5 µL U+9 储备液（步骤 1.2）。
    注意：选择合适类型的微量移液器，并按照制造商说明操作所需体积。例如，使用 2 µL 移液器分配 0.1–2 µL 液体，使用 10 µL 移液器分配 2–10 µL 液体，使用 100 µL 移液器分配 20–100 µL 液体，以确保结果的准确性和精确性。所述试剂混合物体积适用于 10 次检测；根据所需反应次数调整体积。1x UDG 反应缓冲液含有 1 mM EDTA、1 mM 二硫苏糖醇和 20 mM Tris-HCl（25 °C 时 pH 8.0）。有关 10x UDG 反应缓冲液的来源，请参见材料表。
  2. 将管子牢固封闭，在 65 °C 水浴中孵育 30 分钟，随后在 37 °C 孵育 30 分钟，最后置于冰上 3 分钟，以确保底物/模板双链体正确退火。
  3. 在一个 1.5 mL 无菌微量离心管中加入 49 µL 冰冷的 1x UDG 反应缓冲液和 1 µL UDG（5,000 单位/mL；参见材料表），稀释至 0.1 单位/µL。使用 1x UDG 缓冲液进行系列稀释，得到所需酶浓度（0.05、0.02 或 0.01 单位/µL）。稀释后的 UDG 始终置于冰上保存。
    注意：在 10 µL 反应体系中，0.1 单位 UDG 可在 3 分钟内从 T1/U+9 双链体中切除超过 30 pmol 的尿嘧啶。
  4. 在一个 1.5 mL 无菌微量离心管中加入 9.0 µL 来自步骤 2.2 的底物混合物，并将管子预热至 37 °C。加入 1.0 µL 来自步骤 2.3 的稀释 UDG。使用计时器记录反应时间，并轻弹管壁以混匀内容物。
    注意：对于单位定义实验，孵育时间为 30 分钟。对于动力学实验，采用时间进程分析（0.5、1、2、3、5 分钟）以获得初始速率。对于 UGI 抑制实验，反应时间设定为 15 分钟。
  5. 将含有反应混合物的管子在室温下以 3,200 × g 离心 3–5 秒，然后立即将反应体系转移至 37 °C。
  6. 反应终止
    1. 配制 0.25 M HCl 和 0.23 M Tris 碱溶液。在一个 15 mL 试管中加入 10 mL 含 1 mM EDTA 和 20 mM Tris-HCl（25 °C 时 pH 8.0）的溶液，以模拟 1x UDG 反应缓冲液。加入 1 mL 0.25 M HCl 酸化，并用 pH 计检测，确保 pH 值约为 2 ± 0.5。再加入 1 mL 0.23 M Tris 碱中和，并用 pH 计检测最终 pH 值为 6.5 ± 0.5。
      注意： 使用 pH 试纸是快速简便地重新确认试剂混合物 pH 值的方法。
    2. 向 10 µL 反应混合物中加入 1 μL 0.25 M HCl 进行酸化，使酶失活，并将样品置于冰上 6 分钟。加入 1 µL 0.23 M Tris 碱以中和 DNA 产物，避免因长时间酸性暴露导致 AP 位点断裂。加入 13 µL TE 缓冲液以增加产物混合物体积，便于后续基质芯片转移，然后置于冰上保存。
      注意：AP 产物化学性质不稳定，应在 2 天内通过 MALDI-TOF 质谱分析完成检测。若长期储存超过一周，AP 产物会发生 β/δ 消除反应，导致大量链断裂产物积累（图 1D-G）。
  7. 将全部 25 µL UDG 反应产物从微量离心管转移至 384 孔微孔板中。
    ​注意：缓冲液中高浓度阳离子（如钠或钾离子）会在 MALDI-TOF 质谱分析中产生干扰，因此需要脱盐处理。由于大肠杆菌（E. coli）UDG 反应缓冲液中阳离子浓度极低，无需脱盐。然而，若用于检测其他含金属阳离子的 DNA 糖基化酶反应，则需根据先前描述的方法修改本方案进行脱盐处理35。

3. 将UDG反应产物转移至基质芯片

  1. 打开纳升级分液器（见材料表）的门，将步骤 2.7 中的 384 孔微孔板装载到仪器平台的板架上。
  2. 将基质芯片阵列插入对应的点样板位置。将装载好的点样板放置在纳升级分液器的处理平台上，然后关闭门。
  3. 在转移界面点击运行按钮，等待仪器开始将样品从 384 孔微孔板分液至基质芯片。
  4. 使用成像标签页功能显示芯片图像以及每个点样位点的分液体积。确保芯片上的点样体积在 5–10 nL 范围内。

4. 在质谱仪上设置检测参数

  1. 使用应用程序（参见 材料表) 准备一个包含预测信号m/z值的.xlsx文件用于导入。
    注意：以下设置中的参数在 文件 I.xlsx (表 2) 是第 2 节中 G:U 底物 UDG 检测的示例设置。
  2. 使用应用程序通过右键单击来创建并定义一个新的UDG检测 以设计者格式导入检测组 选项，并从下拉列表中选择 .xlsx 文件（例如, 文件 I.xlsx 来自步骤 4.1）。
  3. 右键单击 客户：项目：板 按钮并点击下拉菜单顶部 选项 树以建立一个新的检测板。在对话框中输入文件名（例如, CTT20210620 （用于实验室代码和检测日期），以及在 板型 下拉菜单，选择 384孔板 类型并按下 好的在屏幕右侧寻找一个空白的孔板。
  4. 点击 检测 选项；选择 检测 (例如, 文件 I.xlsx) 从下拉列表中选择。
  5. 以分配选定的检测方法（例如, 文件 I.xlsx) 至平板上每个样本点的位置，将光标移至空白平板的每个位置，单击以高亮孔位，右键单击以选择 添加 Plex.
  6. 使用台式机或笔记本电脑准备一个无标题行的 .xlsx 格式工作列表例如, 0620.xlsx 的 表3) 从步骤 2.7 开始对芯片上所有样品进行操作。点击 添加新样本项目 按钮；选择文件（例如, 0620.xlsx从下拉列表中选择）以导入工作列表。
  7. 在工作列表中查找所有测试样本编号（例如，来自 0620.xlsx屏幕左侧的）点击 示例代码 在工作列表中，右键单击平板的相应位置，以将检测项目链接到每个位置。

5. 质谱仪操作

  1. 使用应用程序将质谱仪（参见材料表）连接至待分析的样品芯片（来自第3节）。
  2. 点击默认设置。在弹出的对话框中，输入步骤4.3中的文件名（例如，CTT20210620）；在实验名称中，于芯片条形码处输入芯片ID，并保存设置。
  3. 启动质谱仪控制程序（参见材料表）。
  4. 按下质谱仪的进出按钮，使载台伸出。取出芯片架，将步骤3.4中的样品芯片插入芯片架中。将装载好的芯片架放回伸出的载台上，再按下进出按钮，使样品芯片进入仪器内部。
  5. 双击应用程序中的采集 图标。在采集 窗口中，点击自动运行 选项卡，以启动仪器并采集芯片上样品的质谱数据。

6. 查看质谱图并分析数据

  1. 运行数据分析程序（参见 材料表).
  2. 浏览数据库树，从步骤 5.2 中选择芯片 ID。单击以高亮芯片上的目标孔，并单击 光谱 显示质谱图的图标。
  3. 右键单击以选择 自定义对话框 在新窗口中裁剪特定范围的光谱。单击 X轴 输入 m/z 的上限和下限值，然后按 好的 以显示指定范围的光谱，包括目标信号。
    注意：DNA 的量与每个 m/z 值单位的峰强度成正比。
  4. 测量对应于U底物、AP产物和模板的信号m/z值的峰高。单击峰，在屏幕左上角查看峰高。
    注意：1,600 宽度/1,200 单位的谱图尺寸适合在计算机屏幕上观察，也便于存档记录。
  5. 为保存光谱以备记录，右键单击 导出 并选择 JPEG 文件 在下拉列表中输入类型。点击 目标 和 浏览光盘 选择 存储设备 在下拉列表中（例如，闪存盘 E:)。输入 文件名 (例如，0620_1-2.jpg）并单击 导出.
  6. 如有需要，可打印导出的 JPEG 文件，并使用直尺手动测量峰高。

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结果

模板与底物
以中心位置含有尿嘧啶（U+9）并与鸟嘌呤（G）模板配对的合成寡核苷酸为例（图 1A），可使用等摩尔量的模板与含尿嘧啶底物的空白对照，用于评估合成寡核苷酸纯度的质量控制（图 1B；信号与指定的 m/z 值一致，且背景噪声较低）。在质谱数据分析中，测量了峰高（图 2）。19 nt 的模板 DNA 在糖基化酶水解后预期保持不变；因此，该信号可作为 AP 产物定量的参考（图 1C）。

反应条件与质谱
该DNA糖基化酶检测方法简便易行，使用未标记的寡核苷酸进行标准反应，即可获得清晰且可靠的结果 (图1)质谱图的范围应覆盖由底物、模板...

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讨论

本文提供了一种使用UDG MALDI-TOF MS检测方法直接检测含脱氨基碱基（AP）位点DNA产物的详细实验流程。该方法的主要优势在于，含尿嘧啶的底物无需标记、可扩展性强、操作简便，并且在底物设计上具有更高的灵活性。

根据UDG供应商的建议，采用苯酚/氯仿抽提法可使酶失活，从而防止产物DNA降解。然而，苯酚抽提步骤涉及繁琐的危险化学品相分离操作。另一种替代方法是使用HCl进行酸性终止，将反应体系pH降至2 ± 0.5，同样可有效使UDG失活。随后用Tris碱中和可避免DNA损伤。当AP产物在30小时内进行质谱分析时，质谱图中未见碱基丢失或修饰的迹象（图1E）。反应中所用Tris缓冲液来自商业UDG试剂盒。然而，包括Tris在内的多种胺类物质在较高浓度下可通过β-消除反应切割AP位点44。为避免AP位点发生β-消除断裂，可考虑使用其他替代缓冲体系，如HEPES或磷酸盐缓冲液。

作为一种潜在的UDG参考方法，建议采用中心位...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢中国台湾台北市国家实验动物中心功能基因组学整合核心设施和中国台湾台北市国家研究资源与生物数据库药理基因组学实验室提供的技术支持。本研究由中华民国科技部资助 [项目编号：MOST109-2314-B-002 -186（K.-Y.S.），MOST 107-2320-B-002-016-MY3（S.-Y.C.），MOST 110-2320-B-002-043（W.-h.F.）]。H.-L. C. 获得了中国台湾大学博士生奖学金。开放获取费用资助单位：中华民国科技部。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇（Tris 碱）J.T baker方案 1,2
经高压灭菌的去离子水MILLIPORE方案 1,2
EDTAJ.T Baker方案 1,2
手套AQUAGLOVE方案 1,2,3
盐酸（HCl）SIGMA方案 1,2
冰桶Taiwan.Inc方案 2
低吸附移液器吸头（0.5–10 µL）extra gene方案 1,2
低吸附移液器吸头（1,250 µL）national scientific supply co, Inc.方案 1,2
低吸附移液器吸头（200 µL）national scientific supply co, Inc.方案 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CA方案 4, 5
质谱控制程序包括 Typer Chip Linker、SpectroACQUIRE 和 Start RT Process。
MassARRAY 纳米点样仪AAT Bioquest, Inc.RS1000方案 3
微量离心机Kubota方案 2
微量离心机Clubio方案 2
微量离心管（1.5 mL）National scientific supply co, Inc.方案 2
微量离心管架Taiwan.Inc方案 1,2
微量移液器 （P1000）Gilson方案 1,2
微量移液器 （P2）Gilson方案 1,2
微量移液器（P10）Gilson方案 1,2
微量移液器（P100）Gilson方案 1,2
微量移液器（P200）Gilson方案 1,2
微量移液器（SL2）Rainin方案 1,2
寡核苷酸Integrated DNA Technologies (新加坡)方案 1,2
Quest Graph IC50 计算器（v.1）AAT Bioquest, Inc.图 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
氢氧化钠（NaOH）WAKO方案 2
SpectroCHIP 芯片阵列 Agena Bioscience, CA#01509方案 3, 5
计时器Taiwan.Inc方案 2
Typer 4.0 软件 Agena Bioscience, CA#10145方案 6
Typer 4.0 包含四个程序：Assay Designer、Assay Editor、Plate Editor 和 Typer Analyzer。
UDG 反应缓冲液（10×）New England Biolabs, MAB0280S方案 2
尿嘧啶糖基化酶抑制剂New England Biolabs, MAM0281S方案 2
尿嘧啶-DNA 糖基化酶New England Biolabs, MAM0280L方案 2
紫外-可见分光光度计 UV-1601SHIMADZU方案 1
水浴锅ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)方案 2

参考文献

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