本方案描述了鼻上皮细胞的采集、扩增和分化为类器官型气道上皮细胞模型的过程，并通过活细胞成像和自定义脚本对纤毛摆动频率进行定量分析。
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摘要
摘要
纤毛功能（搏动频率、模式）的测量已被确立为诊断原发性纤毛运动障碍等呼吸系统疾病的工具。然而，这些技术的广泛应用受到纤毛功能对环境因素（如温度、湿度和pH值）变化极度敏感的限制。在囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）患者呼吸道中，黏液积聚会阻碍纤毛搏动。在原代气道细胞模型中，纤毛功能已被用作评估CF跨膜传导调节因子（CFTR）通道活性的指标。然而，即使在具有相同基因型的患者中，针对CFTR调节药物的纤毛搏动频率仍表现出显著的个体间差异 CFTR 突变。此外，功能异常的CFTR调控的氯离子分泌对纤毛功能的影响尚不明确。目前尚无全面的方案展示样本制备的 体外 气道模型、图像采集及纤毛搏动频率（CBF）分析。在受控环境条件下进行标准化培养和图像采集，可实现个体间以及对CFTR调节药物反应的CBF定量结果的一致性和可重复性。本方案描述了在三种不同气道上皮细胞模型系统中进行CBF定量的方法：1）原代上皮组织片；2）在可渗透支持插件上培养并成像的气液界面模型；3）包埋于细胞外基质中的三维类器官。后两种模型可模拟 体内 肺生理学，具有纤毛搏动和黏液分泌功能。在环境可控的培养舱中，使用高速摄像机记录纤毛运动。通过定制的脚本对纤毛搏动频率（CBF）进行分析。将CBF测量结果转化为临床应用，有望成为一种重要的临床工具，用于个体化预测患者对CFTR调节类药物的治疗反应。
引言
纤毛摆动频率（CBF）和摆动模式的测量已被确立为原发性纤毛运动障碍（PCD）等呼吸系统疾病的诊断工具1在囊性纤维化（CF）中，CF跨膜传导调节因子（CFTR）氯离子通道功能障碍导致气道表面液体脱水以及黏液纤毛清除能力受损2纤毛功能已被研究 体外 在原代气道细胞模型中作为CFTR通道活性的指标3然而，即使对于具有相同基因型的患者，其脑血流量（CBF）对CFTR调节药物的反应也存在显著的个体间差异。 CFTR 突变3此外，囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）调控的氯离子分泌功能障碍对纤毛功能的影响尚不明确。目前尚无完整的方案展示样本制备的 体外 气道模型、图像采集和纤毛搏动频率分析
从鼻黏膜刷取物中分离的鼻上皮细胞片可直接用于测量纤毛功能，以诊断原发性纤毛运动障碍（PCD）4然而，尽管无法控制所获取的鼻腔上皮细胞片的大小或质量，纤毛搏动频率（CBF）的测量值会因测量对象是单个细胞还是细胞片，以及上皮细胞片中纤毛边缘是否完整而有所不同5因此，在采集鼻黏膜刷取样本过程中因细胞损伤所导致的继发性纤毛运动障碍可能影响纤毛搏动频率（CBF）。通过鼻上皮....
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方案
本研究获得了悉尼儿童医院网络伦理审查委员会（HREC/16/SCHN/120）的批准。在采集生物样本前，已从所有参与者（或参与者的监护人）处获得书面知情同意。
1. 建立气道上皮细胞模型的准备工作
- 通过混合80%的Dulbecco改良Eagle培养基和20%胎牛血清制备鼻腔细胞收集培养基。每毫升添加1 µL青霉素/链霉素。4 °C保存，最长可保存3个月。
- 根据需要按照步骤1.2.1–1.2.4对培养瓶或可渗透支持性小室进行胶原蛋白包被。切勿长期储存胶原包被的容器。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）将I型胶原溶液（3 mg/mL储备液）按1:100稀释，终浓度为0.03 mg/mL。充分混匀。
- 使用制备好的胶原溶液，按160 µL/cm2（即每T25培养瓶4 mL）包被细胞培养瓶（第4节），按455 µL/cm2（即每6.5 mm小室150 µL）包被可渗透支持性小室（第5节）。
- 在37 °C孵育2–24小时。
- 接种细胞前用移液器或真空抽吸装置去除胶原溶液。接种细胞前切勿清洗容器。
- 通过混合表1中列出的组分32制备条件重编程细胞（CRC）培养基。使用....
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结果
为了验证该方案在量化纤毛搏动频率（CBF）方面的效率，本文展示了来自3名囊性纤维化（CF）患者和3名健康对照个体的气道上皮细胞气液界面（ALI）模型中测得的CBF结果。在培养分化的第14天，可见纤毛发生规律摆动（图6）。从培养分化的第14天至第21天，两组受试者的CBF均呈现统计学显著上升（P < 0.0345）。在培养分化的第21天，健康对照组个体的平均CBF（7.61 ± 0.11 Hz）显著高于CF患者组（6.75 ± 0.17 Hz）。为了探究黏液积聚与清除对CBF的影响程度，在相同细胞模型中去除了黏液后再次成像CBF。在健康个体和CF患者的ALI模型中，去除黏液后CBF均出现统计学显著升高（P < 0.0001）（图6）。
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讨论
在鼻上皮片中对纤毛摆动频率（CBF）进行定量时，存在多种可能影响结果准确性的因素。上皮片应在样本采集后3-9小时内进行成像，因为在此时间段内纤毛功能最为稳定37。成像时，红细胞和碎片越少越有利于图像获取，因为这些物质会干扰数据采集。在选择成像感兴趣区域（ROI）时，应选取在样本采集过程中边缘未受损伤或破坏的上皮片，避免选择单个游离的上皮细胞，因为这些变量已被证明会影响CBF5。此外，上皮片必须保持静止，因为移动可能干扰数据采集。处于培养基中的上皮片常朝不同方向排列27。由于已有研究证实样本质量的差异（如上皮边缘破损）会影响CBF5，因此上皮片的排列方向也可能对CBF产生影响。本实验方案的一个局限性在于尚未评估上皮片排列方向的影响，这预计将是一个推动进一步标准化研究的重要方向。
成熟的气液界面（ALI）模型具有假复层上皮，并含有可产生黏液的杯状细胞34
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披露
作者声明无任何利益冲突披露。
致谢
我们感谢研究参与者及其家人的贡献。感谢悉尼儿童医院（SCH）兰德威克院区呼吸科在组织和收集患者生物样本方面提供的协助——特别感谢 John Widger 博士、Yvonne Belessis 博士、Leanne Plush、Amanda Thompson 和 Rhonda Bell。我们感谢新南威尔士大学悉尼分校马克·韦恩赖特分析中心内凯瑟琳娜·高斯光学显微镜中心的 Iveta Slapetova 和 Renee Whan 提供的技术支持。本研究得到澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）（项目编号 GNT1188987）、澳大利亚囊性纤维化基金会以及悉尼儿童医院基金会的资助。作者谨此感谢“光明联盟——儿童健康创新”（Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health）所做出的贡献与支持。“光明联盟——儿童健康创新”是悉尼儿童医院网络、儿童医学研究所和儿童癌症研究所之间成立的非营利性合作联合体。该联盟在新南威尔士州政府的支持下建立，旨在协调和整合儿科研究工作。光明联盟同时与悉尼大学和新南威尔士大学悉尼分校保持合作关系。KMA 获得澳大利亚政府研究培训计划奖学金资助。LKF 获得悉尼港扶轮社/悉尼儿童医院基金会和新南威尔士大学研究生奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| 高级DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| 丙氨酰-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | 高帧率（>100 Hz）科研相机 | |
| 瓶顶式真空过滤系统 | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| 头孢他啶水合物 | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| 细胞培养显微镜 | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | 长工作距离物镜，数值孔径NA0.45，工作距离WD 8.2-6.9 |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | 孔径40 μm |
| Corning Matrigel基质（无酚红） | Corning | 356231 | 细胞外基质（ECM） |
| Corning瓶顶式真空过滤系统 | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX细胞冻存容器 | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell聚酯膜细胞培养小室 | Sigma-Aldrich | CLS3470 | 可渗透支持插入物，6.5 mm Transwell，带0.4 μm孔径聚酯膜插入物 |
| Countess细胞计数板载玻片 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II全自动细胞计数仪 | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | 全自动细胞计数仪 |
| 细胞学刷 | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-高葡萄糖 | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | 活细胞成像显微镜 | |
| 胎牛血清，经认证，热灭活，美国来源 | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| 两性霉素B（Fungizone） | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| 庆大霉素溶液 | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | 科学分析软件 | |
| Greiner Cryo.s冻存管 | Sigma-Aldrich | V3135 | 低温冻存管 |
| HEPES溶液 | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | 显微镜环境培养室，支持热空气培养及局部CO2和O2供气 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 无水珠浴6L | John Morris Group | 74220 706 | 珠浴装置 |
| Lab Armor珠粒 | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | 热传导珠粒 |
| MATLAB | MathWorks | 计算软件 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 电子表格软件 | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | 经辐照的NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞 |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | 图像采集软件 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | 每毫升含10,000单位青霉素和10 mg链霉素 |
| Dulbecco′s磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult气道类器官试剂盒 | StemCell Technologies | 5060 | 气道类器官试剂盒 |
| PneumaCult-ALI培养基 | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus培养基 | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | I型胶原蛋白溶液 |
| ReagentPack传代试剂 | Lonza | CC-5034 | |
| 重组人EGF（表皮生长因子，人源） | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl（ROCK抑制剂） | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| 妥布霉素 | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO载物台培养箱 | Okolab | 显微镜培养箱，支持温度、湿度和CO2调控 |
参考文献
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Cutting, G. R. Cystic....
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