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原代人类鼻上皮细胞模型的采集、扩增与分化及其用于纤毛搏动频率的定量分析

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DOI：

10.3791/63090

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2021年11月10日

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1School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 2Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 3Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, 4Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 5Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

本文内容

摘要

本方案描述了鼻上皮细胞的采集、扩增和分化为类器官型气道上皮细胞模型的过程，并通过活细胞成像和自定义脚本对纤毛摆动频率进行定量分析。

摘要

纤毛功能（搏动频率、模式）的测量已被确立为诊断原发性纤毛运动障碍等呼吸系统疾病的工具。然而，这些技术的广泛应用受到纤毛功能对环境因素（如温度、湿度和pH值）变化极度敏感的限制。在囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）患者呼吸道中，黏液积聚会阻碍纤毛搏动。在原代气道细胞模型中，纤毛功能已被用作评估CF跨膜传导调节因子（CFTR）通道活性的指标。然而，即使在具有相同基因型的患者中，针对CFTR调节药物的纤毛搏动频率仍表现出显著的个体间差异 CFTR 突变。此外，功能异常的CFTR调控的氯离子分泌对纤毛功能的影响尚不明确。目前尚无全面的方案展示样本制备的 体外 气道模型、图像采集及纤毛搏动频率（CBF）分析。在受控环境条件下进行标准化培养和图像采集，可实现个体间以及对CFTR调节药物反应的CBF定量结果的一致性和可重复性。本方案描述了在三种不同气道上皮细胞模型系统中进行CBF定量的方法：1）原代上皮组织片；2）在可渗透支持插件上培养并成像的气液界面模型；3）包埋于细胞外基质中的三维类器官。后两种模型可模拟 体内 肺生理学，具有纤毛搏动和黏液分泌功能。在环境可控的培养舱中，使用高速摄像机记录纤毛运动。通过定制的脚本对纤毛搏动频率（CBF）进行分析。将CBF测量结果转化为临床应用，有望成为一种重要的临床工具，用于个体化预测患者对CFTR调节类药物的治疗反应。

引言

纤毛摆动频率（CBF）和摆动模式的测量已被确立为原发性纤毛运动障碍（PCD）等呼吸系统疾病的诊断工具1在囊性纤维化（CF）中，CF跨膜传导调节因子（CFTR）氯离子通道功能障碍导致气道表面液体脱水以及黏液纤毛清除能力受损2纤毛功能已被研究 体外 在原代气道细胞模型中作为CFTR通道活性的指标3然而，即使对于具有相同基因型的患者，其脑血流量（CBF）对CFTR调节药物的反应也存在显著的个体间差异。 CFTR 突变3此外，囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）调控的氯离子分泌功能障碍对纤毛功能的影响尚不明确。目前尚无完整的方案展示样本制备的 体外 气道模型、图像采集和纤毛搏动频率分析

从鼻黏膜刷取物中分离的鼻上皮细胞片可直接用于测量纤毛功能，以诊断原发性纤毛运动障碍（PCD）4然而，尽管无法控制所获取的鼻腔上皮细胞片的大小或质量，纤毛搏动频率（CBF）的测量值会因测量对象是单个细胞还是细胞片，以及上皮细胞片中纤毛边缘是否完整而有所不同5因此，在采集鼻黏膜刷取样本过程中因细胞损伤所导致的继发性纤毛运动障碍可能影响纤毛搏动频率（CBF）。通过鼻上皮细胞的原代培养，并在气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）或三维基底膜基质中分化形成带纤毛的气道上皮类器官，可获得不受继发性纤毛运动障碍影响的纤毛4,6,7,8. 在气液界面（ALI）分化培养的气道上皮细胞（下文简称ALI模型）被认为是一种重要的辅助诊断工具，可重现纤毛的摆动模式和频率 离体 鼻黏膜刷取样本6 并能够在保留患者特异性缺陷的同时，对纤毛超微结构、摆动模式和摆动频率进行分析9然而，在构建这些假复层黏液纤毛分化细胞模型的方法学上仍存在差异。不同的培养扩增或分化方案可能诱导出不同的上皮表型（纤毛细胞或分泌细胞）。10 并导致脑血流量（CBF）出现显著差异11鼻上皮刷取样本中的CBF已得到定量分析4,6,12,13,14,15,16气道上皮类器官14,17,18 以及 ALI 模型3,4,6,13,19,20,21然而，在这些方案中存在较大的变异性，且许多参数往往未得到控制。例如，在某些研究中，脑血流（CBF）被成像 原位 而ALI模型中的细胞仍保留在可渗透性支持膜插件上3,19,20,21，而其他方法则是将细胞从可渗透支撑小室上刮下，并在悬浮于培养基中时进行成像4,6,13.

此外，由于纤毛功能对环境因素的变化极为敏感，测量纤毛功能的技术在更广泛的应用中受到限制。温度22、湿度23,24和pH值25,26等环境因素均会影响纤毛功能，因此必须对这些因素进行调控，以准确量化纤毛摆动频率（CBF）。不同实验室所采用的各种生理参数及其对纤毛摆动频率的影响，已有文献进行了综述27。

文献中报道了多种用于测量纤毛搏动频率（CBF）的成像技术和方法。对于原发性纤毛运动障碍（PCD）的诊断，通常采用视频显微镜来测量纤毛功能28,29。最近，一种基于差分动态显微镜的视频分析算法被用于量化气道上皮细胞气液界面（ALI）模型中的CBF及纤毛协调性3,30。该方法能够快速、全自动地表征气道上皮细胞的纤毛搏动，无需进行区域分割或手动选区。多种成像与CBF定量方法的存在，可能导致文献中报道的CBF数值存在差异（补充文件1）。

从培养到定量的标准化实验方案，可简化现有方法，统一培养条件并规范图像采集过程，在严格控制的环境条件下进行，从而实现在个体内部及个体之间对纤毛搏动频率（CBF）进行一致且可重复的定量分析。

本方案详细描述了三种源自鼻腔的气道上皮细胞模型系统中上皮细胞的采集、扩增与分化培养条件，以及纤毛搏动频率（CBF）的定量分析方法：1）原代上皮细胞片层，2）在可渗透支持插件上培养并进行成像的气液界面（ALI）模型，以及3）包埋于细胞外基质（ECM）中的三维类器官（图1）。鼻下甲刷取获得的鼻上皮细胞被用作气道上皮的代表性样本，因其可有效替代支气管上皮细胞31，同时避免了获取支气管刷取样本所需的侵入性操作。条件重编程细胞（CRC）方法用于扩增原代气道上皮细胞，以构建ALI模型和三维类器官。通过与生长停滞的成纤维细胞饲养层体系共培养并添加Rho相关激酶（ROCK）抑制剂，可诱导气道上皮细胞重编程为类干细胞状态32。重要的是，CRC方法可在维持细胞组织特异性分化潜能的同时，显著提高气道上皮细胞的群体倍增能力33,34。在所有气道上皮细胞模型中，均使用高速摄像机在温度可控的环境中，以标准化的图像采集参数记录纤毛功能。CBF的定量分析则采用自主编写的脚本完成。

通过鼻刷取气道上皮细胞重编程过程；示意图包括纤毛成像装置及分析步骤
图1：实验流程示意图。 在刷取受试者鼻下甲组织后，气道上皮细胞可通过两种方式使用。一种是直接分离气道上皮细胞片层，并立即进行纤毛摆动频率的成像；另一种是通过条件性重编程细胞方法扩增气道上皮细胞。经条件性重编程（CRC）方法扩增的气道上皮细胞可进一步分化，以建立气液界面培养的气道上皮细胞模型或气道上皮类器官培养体系。纤毛摆动频率的成像采用配备加热与湿度控制环境舱以及高帧率（>100 Hz）科学相机的活细胞成像显微镜完成。数据分析通过自定义脚本进行。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

本研究获得了悉尼儿童医院网络伦理审查委员会（HREC/16/SCHN/120）的批准。在采集生物样本前，已从所有参与者（或参与者的监护人）处获得书面知情同意。

1. 建立气道上皮细胞模型的准备工作

  1. 通过混合80%的Dulbecco改良Eagle培养基和20%胎牛血清制备鼻腔细胞收集培养基。每毫升添加1 µL青霉素/链霉素。4 °C保存，最长可保存3个月。
  2. 根据需要按照步骤1.2.1–1.2.4对培养瓶或可渗透支持性小室进行胶原蛋白包被。切勿长期储存胶原包被的容器。
    1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将I型胶原溶液（3 mg/mL储备液）按1:100稀释，终浓度为0.03 mg/mL。充分混匀。
    2. 使用制备好的胶原溶液，按160 µL/cm2（即每T25培养瓶4 mL）包被细胞培养瓶（第4节），按455 µL/cm2（即每6.5 mm小室150 µL）包被可渗透支持性小室（第5节）。
    3. 在37 °C孵育2–24小时。
    4. 接种细胞前用移液器或真空抽吸装置去除胶原溶液。接种细胞前切勿清洗容器。
  3. 通过混合表1中列出的组分32制备条件重编程细胞（CRC）培养基。使用瓶顶式真空过滤系统过滤除菌。4 °C保存，最长可保存2个月。
  4. 使用当天，按照表1所示添加人表皮生长因子、ROCK抑制剂和抗生素。
组分体积
DMEM, 高糖156.7 mL
DMEM/F-12, HEPES313.3 mL
氢化可的松55.6 µL
胰岛素1.25 mL
霍乱毒素21 µL
腺嘌呤1.2 mL
HI-FBS25 mL
青霉素-链霉素5 mL
人表皮生长因子1 µL/mL
ROCK 抑制剂1 µL/mL
Fungizone2 µl/ml
妥布霉素2 µL/mL
头孢他啶水合物4 µL/mL
庆大霉素溶液1 µL/mL

表1：500 mL 条件重编程细胞培养基的组分

2. 鼻下甲刷取样本的采集

注意：本实验步骤需要配备含有鼻腔细胞收集液的收集管（50 mL）、细胞学刷、纸巾以及适当的个人防护装备。避免在上呼吸道感染期间进行刷取操作。存在少量出血风险，若存在炎症，出血风险会增加。如果刷取的目的是获取气道上皮细胞层，则 离体 脑血流（CBF）测量前的刷取操作应在任何上呼吸道感染后至少6周进行；理想情况下，应在感染后10周以上进行35.

  1. 准备鼻腔细胞采集介质（第1节），并将试管置于冰上。
  2. 向参与者描述该操作过程可能会引起不适。解释在刷取过程中鼻孔内会产生一种胀满感，类似于跳入海洋或泳池时水流冲入鼻腔的感觉。提醒参与者该操作会引发反射性流泪。
  3. 评估适合参与者的体位。如果具备检查床，建议让参与者仰卧，因为仰卧位可防止其头部在操作过程中移动而远离刷头。或者，可让参与者坐在墙边，使其能够将头部向后靠在墙上。
  4. 检查鼻腔通道。注意是否存在鼻中隔偏曲、息肉或其他可能影响刷头通过鼻腔通道并增加出血风险的解剖异常。
  5. 让参与者用纸巾擤鼻，以清除多余的黏液。
  6. 要求参与者用嘴呼吸。用优势手持取细胞学刷。将小指置于参与者的下巴上以固定手部，随后将细胞学刷插入参与者的鼻腔通道（图2）。将刷头以约45°角插入，以便通过鼻道。
  7. 将刷头旋转至直立位置，使其与参与者的面部垂直。轻柔但稳固地将刷头沿下鼻甲下方的鼻腔侧壁推进，直至到达下鼻甲中后部。
    注意：避免插入过深；若突然感到阻力下降，表明已进入鼻咽部，此时应将刷头回撤，直至操作者再次感受到阻力。
  8. 将刷头旋转360°，最多三次。以与插入动作相反的方式轻柔取出刷头，以防止细胞从刷头上脱落。
  9. 将刷头放入预先准备好的含有鼻腔细胞采集介质的收集管中。将收集管置于冰上。
  10. 若参与者同意或需要大量细胞（例如用于启动细胞培养），可在另一侧鼻孔重复刷取操作。
    注意：如果刷头上未见明显血细胞，可在同一鼻孔再次刷取，但需注意在同一鼻孔进行第二次刷取时出血风险略有增加。

鼻拭子采集技术示意图，显示在 COVID-19 检测中采样时拭子的行进路径。
图 2：鼻腔上皮细胞的采集。 细胞刷位于下鼻甲中后部位置的示意图。该位置的到达方法是：将细胞刷经鼻孔插入，将刷子旋转至与面部呈 90° 角，然后沿下鼻甲下方的鼻腔通道引导细胞刷前进。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 气道上皮细胞层的制备

注意：本实验步骤需要收集管（细胞学刷具 + 1 mL 鼻腔细胞收集液）（第2节）和96孔平底板。若采集鼻甲刷片用于成像呼吸道上皮细胞层，请仅使用1 mL不含抗生素的鼻腔细胞收集液；否则上皮细胞层将过于分散，无法成像。

  1. 轻轻涡旋含有细胞学刷的收集管，使气道上皮片从刷子上脱落。
  2. 用 P1000 移液器收集全部培养基和细胞。将 5–6 滴样品加入 96 孔平底板的一个孔中。重复操作至约七个孔。
  3. 将板转移至显微镜，按照步骤 7.1.4 操作，并继续执行第 7 节其余步骤以成像纤毛摆动频率。
  4. 应成像上皮片（图 1），而非单个游离细胞，因为已有研究表明，上皮片与单个游离细胞之间的纤毛功能存在差异5。

4. 气道上皮细胞的扩增与维持

  1. 气道上皮条件性重编程细胞扩增培养
    注意：胶原溶液包被的培养容器（第1节）、经辐照的小鼠胚胎滋养层细胞（NIH-3T3）、条件性重编程细胞（CRC）培养基（第1节）、细胞学刷（若干）置于鼻腔细胞采集液中（第2节）。
    1. 将经辐照的滋养层细胞以8,000个细胞/cm2的接种密度接种至预先用胶原溶液包被的培养容器中，于与气道上皮细胞共培养前至少2小时但不超过72小时进行接种（滋养层细胞的培养与辐照方法见36）。
    2. 将采集管中的刷取细胞（细胞学刷 + 鼻腔细胞采集液）转移至冰上涡旋振荡器。以低速涡旋10秒，暂停10秒（期间保持冰上放置），以使细胞从刷子上脱落。剧烈涡旋可能降低细胞活力。检查刷子是否仍有黏液附着，若有，则重复涡旋操作。
    3. 将冰上的采集管转移回生物安全柜。使用血清移液管将采集管中的液体转移至新管（B管），留下细胞学刷。将B管在4 °C下以300 × g离心7分钟。
    4. 从离心机中取出B管，弃去上清液。若可见黏液残留，用另5 mL鼻腔细胞采集液重悬沉淀并再次离心。
    5. 加入1 mL CRC培养基重悬B管中的细胞沉淀。使用5 mL血清移液管，将细胞悬液以环形方式通过置于50 mL管（C管）上方的细胞筛过滤。
    6. 重复多次以形成单细胞悬液。收集筛底部残留的液体并混入悬液中。弃去细胞筛。
    7. 使用5 mL血清移液管从C管中吸取1 mL液体转移至微量离心管中。
    8. 取10 µL该细胞悬液加入已预先加入10 µL台盼蓝的微量离心管中。充分混匀后立即使用自动细胞计数仪记录细胞数量和活力。
    9. 将气道上皮细胞接种至已预先接种经辐照滋养层细胞的T25培养瓶中。
  2. 气道上皮细胞的维持与解离
    注意：在将CRC培养基加入细胞前，必须将其置于温控水浴或珠浴设备中加热至37 °C。
    1. 定期在细胞培养显微镜下（使用4×物镜）观察细胞的贴壁情况、污染状况、形态及汇合度。
    2. 每两天更换一次CRC培养基。当观察到重编程细胞（图1）且无污染时，可减少或停止使用抗生素。
    3. 当细胞达到90%汇合度时，采用双胰酶法32解离细胞，并按照步骤4.1.8所述进行细胞计数（细胞解离与冻存操作详见补充文件2）。

5. 气道上皮细胞的接种与分化及分化后气液界面模型的维持

  1. 将气道上皮细胞接种至可渗透性支持膜插件中
    1. 将已包被胶原溶液的可渗透性支持膜插件（第1节）从CO2培养箱转移至生物安全柜中。吸除胶原溶液并弃去。向可渗透性支持膜插件的基底室加入750 µL扩增培养基（不含抗生素）。
    2. 将解离后的细胞或冰上保存的冻存细胞转移至生物安全柜中。向每个可渗透性支持膜插件的顶端室加入150 µL扩增培养基，以接种200,000–250,000个细胞。
    3. 小心操作避免产生气泡，充分混匀以确保细胞均匀悬浮。向每个可渗透性支持膜插件的顶端侧加入150 µL细胞悬液。
    4. 每接种三个可渗透性支持膜插件后，重新混悬细胞，以维持细胞悬液的均匀性。
    5. 每隔两天更换一次培养基，直至形成融合的单层细胞（通常在接种后第4天完成），弃去旧培养基，并加入已预温至室温（RT，15–25 °C）的新鲜扩增培养基。
  2. 在气液界面诱导气道上皮细胞分化
    1. 将气液界面培养基（ALI培养基，不含抗生素）预温至室温（RT，15–25 °C）。
    2. 吸除扩增培养基，并向顶端室和基底室均更换为分化培养基（ALI培养基）。
    3. 在完全浸没的ALI培养基中培养2天后，吸除并弃去培养基。
    4. 仅向基底室加入750 µL ALI培养基，以建立气液界面。
      注意：若培养1周后单层细胞仍未融合，仍可见孔洞，则细胞可能已失去向空缺区域扩展的能力，建议弃用该批气道上皮细胞。
  3. 分化后ALI模型的维持及黏液清除
    1. 每隔两天更换一次顶端室和基底室的培养基，直至完全分化（建立气液界面后第21–25天）。
    2. 每周一次，按照步骤5.3.3–5.3.4清洗顶端侧的黏液。
    3. 将PBS预温至室温（RT，15–25 °C）。
    4. 向顶端室加入200 µL PBS，在CO2培养箱中孵育10分钟。使用吸液装置或移液器吸除PBS。

6. 三维气道上皮类器官

  1. 气道上皮类器官培养的准备工作
    1. 将24孔板放入CO2培养箱中，于37 °C预热过夜。
    2. 按照生产商说明书，将一管10 mL的细胞外基质（ECM）（材料表）置于冰上解冻。分装成500 µL每份（一次性使用），以尽量减少冻融循环次数。
      注：建议使用蛋白浓度＞10.5 mg/mL的ECM以获得最佳培养效果。较低浓度会加速ECM凝胶圆顶的解体，并增加顶膜朝外型类器官的出现频率。
    3. 按照生产商说明书，使用气道类器官培养试剂盒（材料表）配制气道类器官接种培养基（AOSM）和分化培养基（AODM）。
    4. 根据表2配制气道类器官基础培养基。
组分体积
Advanced DMEM/F-12500 mL
HEPES5 mL
Alanyl-glutamine5 mL
Penicillin-Streptomycin5 mL

表2：气道类器官基础培养基的组分

  1. 根据第4.2节中解离得到的活体气道上皮细胞数量，计算在每孔接种密度为10,000个细胞时可接种的孔数（见表3）。
  2. 计算每孔形成1个50 µL、含90% ECM的凝胶圆顶（45 µL ECM和5 µL AOSM）所需的ECM和AOSM总体积。
    注意：推荐的每孔10,000个细胞的接种密度适用于第1代CRC扩增的鼻上皮细胞。后续代次的细胞可能需要更高的接种密度，才能形成相同数量的类器官。
孔数细胞数量类器官数量Matrigel ECM 体积AOSM 体积
110,000 个细胞145 µL x 1.15 µL x 1.1
220,000 个细胞290 µL x 1.110 µL x 1.1
550,000 个细胞5225 µL x 1.125 µL x 1.1
………………个细胞………………µL x 1.1………µL x 1.1

表3：气道上皮细胞在ECM凝胶滴中接种的计算

  1. 在ECM穹顶中接种气道上皮细胞
    注意：ECM 始终需置于冰上，并在冰上进行所有涉及 ECM 的操作步骤，因为 ECM 在较高温度下会开始凝固 >10°C.
    1. 按照第4.2节中计算的体积，用90% ECM重悬已解离的气道上皮细胞 表3.
    2. 以一定角度持握移液器 90° 角度（垂直）尽可能靠近孔底部，加入 50 µL 将ECM细胞悬液加至孔中央（移液至第一停点，避免产生气泡），切勿接触孔壁。
    3. 孵育平板于 37 °C 20分钟，直至ECM凝固。在ECM凝固期间，将AOSM升温至室温（15-25 °C以防止其在加入后引起细胞外基质（ECM）穹顶的再液化和解体。
    4. 添加 500 µL 将预热的 AOSM 沿孔壁缓慢加入各孔中。切勿将培养基直接吹加到 ECM 圆顶上。
    5. 每2天换液一次，持续4-7天。吸除培养基时，将培养板倾斜 45° 从远离ECM圆顶的孔板底部边缘以一定角度吸液。
    6. 4–7 天后，通过添加启动类器官分化 500 µL AODM（15-25 °C向每个孔中加入）并每2天更换一次培养基，持续7天。
  2. 第7天分化后气道上皮类器官的重新铺板
    注意：需要对气道上皮类器官进行重新铺板，因为在为期2周的培养过程中，细胞外基质（ECM）凝胶滴边缘会逐渐降解。位于凝胶滴边缘的气道上皮类器官可能丢失（脱落至培养基中）或在未完全包埋于ECM中时出现顶面朝外的取向。重新铺板步骤还可通过去除未能成功形成类器官的细胞或碎片，起到“净化”ECM凝胶滴的作用。
    1. 吸出每孔中的培养基。加入 500 µL 向每个孔中加入冷的气道类器官基础培养基（以下简称基础培养基）。
    2. 使用P1000移液器，因为该移液器吸头具有最大的孔径，可降低类器官在移液过程中破裂的可能性。调节移液器至 350 µL 为避免产生气泡，轻轻吹打混匀，以破坏每个孔中的细胞外基质（ECM）凝胶结构。将所有含细胞外基质/基础培养基的液体收集至一个15 mL离心管中。
    3. 用缓冲液冲洗每孔 500 µL 冷的基礎培養基。將含有殘留細胞外基質（ECM）和類器官的基礎培養基收集到與上述相同的15 mL離心管中。
    4. 300 x g 离心 g 5 分钟 4 °C离心后可见三层：(1) 上清液，(2) 含细胞碎片（絮状）的细胞外基质（ECM），以及 (3) 含类器官的沉淀；弃去上清液和细胞外基质层，保留类器官沉淀。
    5. 向类器官沉淀中加入1 mL冷的基础培养基，轻轻吹打以分离残留的细胞外基质。向离心管中再加入6 mL冷的基础培养基，轻轻混匀。
    6. 300 × g 离心 g 5 分钟 4 °C弃去上清液。
    7. 如果仍有过多细胞外基质可见，请重复步骤 6.3.5–6.3.6 进行另一次洗涤。
    8. 用适量的90% ECM重悬类器官沉淀（使用AODM代替AOSM），以每孔接种约30个类器官 50 µL 穹顶部分
    9. 在接种第一个半球形结构后，于细胞培养显微镜下（4倍物镜）检查类器官的密度。若密度过高，可额外添加90% ECM，以达到约30个类器官的适宜密度。
    10. 按照步骤 6.2.3–6.2.4 固定 ECM，并每隔一天更换培养基以喂养细胞 500 µL 向每个孔中加入预热的AODM，继续培养14天，直至类器官成熟（分化后21天），形成由朝向腔内的假复层上皮包围的管腔结构，上皮中含有基底细胞、纤毛细胞和杯状细胞。
      注意：此处所述的气道上皮类器官已终末分化，无法传代或冻存。

7. 纤毛摆动频率的成像

注意：本实验方案的这一部分需要配备加热和湿度环境控制舱的活细胞成像显微镜、高速帧率（>100 Hz）科学相机、20倍长工作距离物镜以及成像软件（有关本方案中推荐使用的设备，请参见材料表）。

  1. 显微镜设置
    1. 确保显微镜加热系统已开启并平衡至 37 °C。打开显微镜。通过 CO2/空气混合器将气体调节至 5% CO2。
    2. 用纯化水补充 CO2 流经的湿度模块瓶。通过载物台顶部控制器将相对湿度设定为 85%，使水被加热，从而为细胞提供加湿空气。使培养室平衡 30 分钟。
    3. 将显微镜用培养板插件放入显微镜支架中。
    4. 将气道上皮细胞模型从培养箱转移至已用预热至 37 °C 的加热块或热珠平衡过的显微镜上，以维持样本处于生理温度。
    5. 将含有气道上皮细胞模型的培养板放入显微镜板插件中。关闭显微镜环境培养室。
    6. 让样本在预热的 37 °C、含 5% CO2 的显微镜培养室中平衡 30 分钟。
      注意：更短的平衡时间可能已足够。可通过实验确定纤毛搏动频率（CBF）稳定所需的时间（参见 图 3）。

显示频率与时间关系的图表，说明统计显著性、数据点和误差线。
图3：在活细胞成像显微镜中纤毛摆动频率的稳定情况。 将气液界面（ALI模型）上的气道上皮细胞转移至配备环境控制舱的活细胞成像显微镜后，其平均纤毛摆动频率（CBF）的散点图。在打开舱门并将培养板放入显微镜载板前，环境舱已平衡并维持在37 °C、5% CO2 和85%相对湿度条件下30分钟。细胞模型在指定时间间隔内连续成像60分钟。ALI模型来源于两名囊性纤维化（CF）患者。每个ALI模型采集六个视野（FOV）图像。每个点（蓝色）代表12–36个FOV图像中的平均CBF。数据以均值±标准误（SEM）表示，均值之间用虚线连接。采用单因素方差分析（ANOVA）确定统计学差异。**** P < 0.0001，ns：无显著性差异。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在平衡期间，在计算机上打开采集软件，选择 20x 长工作距离物镜。
  2. 通过显微镜目镜，将焦距对准细胞模型（~Z = 8000 µm）。
  3. 确保显微镜已设置为科勒照明，使透射光源灯丝不会聚焦在样品平面上，以避免成像中出现伪影。请按照步骤 7.1.10–7.1.13 操作。
  4. 完全关闭聚光镜上方的视场光阑，然后缓慢打开视场光阑，并上下移动聚光镜，直到出现八边形形状。
  5. 如果视场光阑未对齐（即八边形不在视野（FOV）中心），请使用内六角扳手将其调整至视野中心。
  6. 视场光阑对齐后，调节聚光镜焦距，使八边形轮廓清晰对焦。
  7. 继续打开视场光阑，直到其在视野内完全不可见为止。
  8. 在采集软件中，点击 L100，将光路切换至相机安装的端口。点击绿色播放（运行）按钮，通过软件查看显微镜视野。检查纤毛是否对焦清晰，必要时进行调整。
  9. 使用采集软件，按以下参数设置显微镜：滤光片：空置；聚光镜：空置；格式：无像素合并；曝光时间：0.003 s；读出模式：卷帘快门；感兴趣区域（ROI）：512 × 512 像素。
    注意：曝光时间应根据需测量的最高频率设定，因为 1/曝光时间必须至少为该频率的两倍。例如，若纤毛摆动的最大生理频率为 30 Hz，则 1/曝光时间应为 60，曝光时间必须 ≤ 0.016 s。ROI 的选择取决于相机的帧率规格，应选择能够实现帧率 >100 Hz 的 ROI。
  1. 图像采集
    1. 要从菜单中获取延时图像，请点击 Acquire，然后点击 Fast Time Lapse。在弹出窗口中选择保存位置和文件名，采集 1000 帧图像。
    2. 点击 Apply，然后点击绿色播放（Run）按钮以预览显微镜视野（FOV）中的纤毛，并根据需要调整 Z 轴焦距。点击 Run Now 以开始快速延时成像。
    3. 完成快速延时成像后，点击绿色播放（Run）按钮以查看显微镜视野（FOV）。使用显微镜操纵杆沿 X/Y 轴移动至另一个视野（FOV）。
    4. 调整 Z 轴焦距，使纤毛清晰对焦。点击 Run Now 以采集下一个快速延时图像序列。
    5. 重复步骤 7.2.3–7.2.4。对于 ALI 模型和气道类器官，每份 3 次重复样本中采集 6 个视野（FOV）；对于气道上皮片，每位参与者至少采集 4 次重复图像。

8. 脑血流量数据分析与定量

  1. 数据分析的准备工作
    注意：本实验方案部分需要自定义分析脚本（补充文件 3）、原始图像文件（在第 7.2 节中获取）、计算软件和分析软件。
    1. 在分析用计算机上安装计算软件，建议使用最新版本。确保已安装标准计算软件工具箱（elmat、ops、datafun、uitools、datatypes、iofun、iotools、audiovideo）以及图像和信号处理工具箱。
    2. 将自定义分析脚本“BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m”和“LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m”以及“support scripts”文件夹复制到计算机的本地驱动器。
    3. 在计算软件中，点击 主页 选项卡，然后点击 设置路径（图 4A-B）。
    4. 在弹出窗口中，点击 添加并包含子文件夹（图 4C）。在“MATLAB 搜索路径”下选择 图 4D 所示的文件夹，然后点击 保存 和 关闭（图 4E-F）。
    5. 通过检查分析脚本是否出现在左侧面板中，确认其已正确链接至计算软件（图 4G）。
    6. 将第 7.2 节中获取的原始图像文件（开放显微镜环境（OME）格式）传输至计算机的本地驱动器。
      注意：示例原始图像文件可通过以下网址获取： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1。

用于路径管理的 MATLAB 界面设置，显示目录选择和保存选项。
图 4：为数据分析设置计算软件。（A）打开主页选项卡。（B）选择设置路径。（C）选择添加并包含子文件夹。（D）选择包含分析脚本的文件夹。（E）选择保存。（F）选择关闭。（G）分析脚本将显示在左侧面板中。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 通过单像素强度谱的峰值检测来量化脑血流量
    1. 打开计算机软件。点击“BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m”分析脚本文件图5A).
    2. 点击 编辑 标签，然后单击绿色播放（运行）按钮以运行脚本（图5B- C）。在弹出窗口中，选择要分析的原始图像文件（图 5D).
    3. 输入步骤 7.1.15 中的曝光时间至每帧采集时间的提示窗口，然后点击 好的 (图5E).
    4. 等待约 15 分钟/文件，直到脚本计算完成并在 'AveSpectrum' 文件中输出 CBF补充文件 4），该文件将自动保存到与原始图像文件相同的文件夹中。通过进度条查看处理进度（图 5F).

MATLAB 脚本执行；用于数据处理和视频导出步骤的代码编辑器界面。
图 5：使用计算软件运行分析脚本。（A）打开用于分析纤毛搏动频率的脚本（“BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m”）或用于生成纤毛搏动视频的脚本（“LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m”）。（B）打开编辑器选项卡。（C）选择绿色的播放（运行）按钮以执行分析脚本。（D）系统将弹出提示窗口，要求选择用于分析或视频生成的文件。（E）在运行“BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m”脚本时，将弹出提示，要求手动输入每帧的采集时间（s），以防文件读取脚本未能正确读取元数据。（F）进度条显示纤毛搏动频率正在计算中。（G）在运行“LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m”脚本时，将弹出提示，要求手动输入要输出的视频类型（mp4 或 avi）、视频帧率（fps）、是否从视频数据中去除静止成分（‘y’ 或 ‘n’）、帧时间（s）以及导出视频中数据的像素尺寸（微米）。建议在静止成分滤除选项中选择‘y’，以去除数据中的黏液或其他阻碍性静止层。（H）进度条显示视频正在导出中。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 使用步骤 8.2.1–8.2.2 中所述方法，在包含 'AveSpectrum' 文件的文件夹上运行 'GetFirstAmplitude.m' 脚本。等待脚本输出 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' 文件，该文件包含振幅最高的频率，且该频率处于气道上皮纤毛搏动的生理范围内，即 ≥3 且 <30 Hz。
  2. 从 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' 文件中复制频率值，并使用科学分析软件进行绘图。
    注意：自定义分析脚本量化纤毛搏动频率（CBF）的方法详见补充文件 5。示例分析数据集可通过以下网址获取：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815。
  1. 导出纤毛摆动的视频
    1. 打开计算软件，点击“LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m”脚本文件（图5A），以加载该脚本。
    2. 点击编辑器选项卡，然后点击绿色的播放（运行）按钮以运行脚本（图5C）。在弹出窗口中，选择要导出为视频文件的原始图像文件（图5D）。
    3. 在“生成视频”弹出窗口中输入表4中详述的设置参数（图5G）。
    4. 脚本生成视频文件期间，请等待约每文件8分钟，视频将输出至原始图像文件所在的位置。可通过进度条查看处理进度（图5H）。
视频输入描述
文件类型输入您希望导出的文件类型（mp4 或 avi）。
帧率输入视频导出时的帧率。如果每个时间序列采集了约 1000 帧，建议设置帧率约为 30 fps。
静态成分滤波选项为“y”或“n”。默认值为“y”，时间滤波脚本会通过傅里叶空间去除视频数据中的任何静态成分。通常，纤毛下方的细胞层或静止的黏液会在信号中引入零频偏移成分或时间不变成分，这些成分可被滤除。
每帧采集时间采集数据中每帧的采集时间。用于在视频中以秒为单位显示时间戳。
像素大小以微米为单位的像素大小，用于在视频中以微米为单位显示比例尺。

表4：电影制作的输入设置

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结果

为了验证该方案在量化纤毛搏动频率（CBF）方面的效率，本文展示了来自3名囊性纤维化（CF）患者和3名健康对照个体的气道上皮细胞气液界面（ALI）模型中测得的CBF结果。在培养分化的第14天，可见纤毛发生规律摆动（图6）。从培养分化的第14天至第21天，两组受试者的CBF均呈现统计学显著上升（P < 0.0345）。在培养分化的第21天，健康对照组个体的平均CBF（7.61 ± 0.11 Hz）显著高于CF患者组（6.75 ± 0.17 Hz）。为了探究黏液积聚与清除对CBF的影响程度，在相同细胞模型中去除了黏液后再次成像CBF。在健康个体和CF患者的ALI模型中，去除黏液后CBF均出现统计学显著升高（P < 0.0001）（图6）。

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讨论

在鼻上皮片中对纤毛摆动频率（CBF）进行定量时，存在多种可能影响结果准确性的因素。上皮片应在样本采集后3-9小时内进行成像，因为在此时间段内纤毛功能最为稳定37。成像时，红细胞和碎片越少越有利于图像获取，因为这些物质会干扰数据采集。在选择成像感兴趣区域（ROI）时，应选取在样本采集过程中边缘未受损伤或破坏的上皮片，避免选择单个游离的上皮细胞，因为这些变量已被证明会影响CBF5。此外，上皮片必须保持静止，因为移动可能干扰数据采集。处于培养基中的上皮片常朝不同方向排列27。由于已有研究证实样本质量的差异（如上皮边缘破损）会影响CBF5，因此上皮片的排列方向也可能对CBF产生影响。本实验方案的一个局限性在于尚未评估上皮片排列方向的影响，这预计将是一个推动进一步标准化研究的重要方向。

成熟的气液界面（ALI）模型具有假复层上皮，并含有可产生黏液的杯状细胞34

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披露

作者声明无任何利益冲突披露。

致谢

我们感谢研究参与者及其家人的贡献。感谢悉尼儿童医院（SCH）兰德威克院区呼吸科在组织和收集患者生物样本方面提供的协助——特别感谢 John Widger 博士、Yvonne Belessis 博士、Leanne Plush、Amanda Thompson 和 Rhonda Bell。我们感谢新南威尔士大学悉尼分校马克·韦恩赖特分析中心内凯瑟琳娜·高斯光学显微镜中心的 Iveta Slapetova 和 Renee Whan 提供的技术支持。本研究得到澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）（项目编号 GNT1188987）、澳大利亚囊性纤维化基金会以及悉尼儿童医院基金会的资助。作者谨此感谢“光明联盟——儿童健康创新”（Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health）所做出的贡献与支持。“光明联盟——儿童健康创新”是悉尼儿童医院网络、儿童医学研究所和儿童癌症研究所之间成立的非营利性合作联合体。该联盟在新南威尔士州政府的支持下建立，旨在协调和整合儿科研究工作。光明联盟同时与悉尼大学和新南威尔士大学悉尼分校保持合作关系。KMA 获得澳大利亚政府研究培训计划奖学金资助。LKF 获得悉尼港扶轮社/悉尼儿童医院基金会和新南威尔士大学研究生奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺嘌呤Sigma-AldrichA278610 mg/mL
高级DMEM/F-12培养基Thermo Fisher Scientific12634-010
丙氨酰-谷氨酰胺Sigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford Instruments高帧率（>100 Hz）科研相机
瓶顶式真空过滤系统Sigma-AldrichCLS431098
头孢他啶水合物Sigma-AldrichA698750 mg/mL
细胞培养显微镜OlympusCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCNikon Instruments Inc.MRH08230长工作距离物镜，数值孔径NA0.45，工作距离WD 8.2-6.9
霍乱毒素Sigma-AldrichC8052-1MG200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UMSigma-AldrichCLS431750孔径40 μm
Corning Matrigel基质（无酚红）Corning356231细胞外基质（ECM）
Corning瓶顶式真空过滤系统Sigma-AldrichCLS431098
Corning CoolCell LX细胞冻存容器Sigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell聚酯膜细胞培养小室Sigma-AldrichCLS3470可渗透支持插入物，6.5 mm Transwell，带0.4 μm孔径聚酯膜插入物
Countess细胞计数板载玻片Thermo Fisher ScientificC10228
Countess II全自动细胞计数仪ThermoFisher ScientificAMQAX1000全自动细胞计数仪
细胞学刷McFarlane Medical33009
DMEM/F12-Ham培养基Thermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-Ham培养基Thermo Fisher Scientific11330032
DMEM-高葡萄糖Thermo Fisher Scientific11965-092
Dulbecco′s磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-ENikon活细胞成像显微镜
胎牛血清，经认证，热灭活，美国来源Thermo Fisher Scientific10082147
两性霉素B（Fungizone）Thermo Fisher Scientific15290018250 µg/mL
庆大霉素溶液Sigma-AldrichG139750 mg/mL
Graphpad PrismGraphpad科学分析软件
Greiner Cryo.s冻存管Sigma-AldrichV3135低温冻存管
HEPES溶液Sigma-AldrichH08871 M
HI-FBSThermo Fisher Scientific10082-147
氢化可的松Sigma-AldrichH08883.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000PeCon显微镜环境培养室，支持热空气培养及局部CO2和O2供气
胰岛素Sigma-AldrichI26432 mg/mL
Lab Armor 74220 706 无水珠浴6LJohn Morris Group74220 706珠浴装置
Lab Armor珠粒Thermo Fisher ScientificA1254302热传导珠粒
MATLABMathWorks计算软件
Microsoft ExcelMicrosoft电子表格软件
NIH/3T3American Type Culture CollectionCRL-1658经辐照的NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞
NIS-Elements ARNikon Instruments Inc.图像采集软件
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333每毫升含10,000单位青霉素和10 mg链霉素
Dulbecco′s磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8537
PneumaCult气道类器官试剂盒StemCell Technologies5060气道类器官试剂盒
PneumaCult-ALI培养基StemCell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus培养基StemCell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015I型胶原蛋白溶液
ReagentPack传代试剂LonzaCC-5034
重组人EGF（表皮生长因子，人源）Sigma-AldrichE964425 µg/mL
Y-27632 2HCl（ROCK抑制剂）SelleckchemS104910 mM
妥布霉素Sigma-AldrichT4014100 mg/mL
台盼蓝溶液Sigma-AldrichT81540.4%
UNO载物台培养箱Okolab显微镜培养箱，支持温度、湿度和CO2调控

参考文献

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