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儿童弥漫性中线胶质瘤的活体三维细胞免疫细胞化学检测

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DOI：

10.3791/63091

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2021年11月11日

 ,  ,  , 
1Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Bambino Gesù Children's Hospital, IRCCS, 2Oncology Service, Children's Health Queensland Hospital and Health Service, 3Child Health Research Centre, The University of Queensland

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种应用于儿童弥漫性中线胶质瘤细胞系的活细胞三维免疫细胞化学技术方案，可用于实时研究动态过程（如三维细胞侵袭和迁移）中细胞质膜上蛋白质的表达情况。

摘要

细胞迁移和侵袭是H3K27M突变型弥漫性中线胶质瘤（DMG）肿瘤的特异性特征。我们已通过基于三维（3D）细胞的侵袭和迁移实验对这些特征进行了建模。在本研究中，我们优化了这些3D实验，以适用于活细胞免疫细胞化学分析。使用一种抗体标记试剂，实时检测H3K27M突变型DMG原代患者来源细胞系中迁移和侵袭细胞质膜上黏附分子CD44的表达。CD44与肿瘤干细胞表型以及肿瘤细胞的迁移和侵袭相关，并参与与中枢神经系统（CNS）细胞外基质的直接相互作用。将H3K27M突变型DMG细胞系的神经球（NS）包埋于基底膜基质（BMM）中，或置于一层薄BMM包被的表面，在存在抗CD44抗体的同时加入抗体标记试剂（ALR）。利用活细胞分析仪器对活体3D细胞免疫细胞化学图像进行分析，定量测定迁移和侵袭细胞上CD44的总体表达水平。该方法还可实时可视化观察迁移和侵袭细胞质膜上CD44表达的间歇性变化。此外，该实验还为CD44在H3K27M突变型DMG细胞从间充质样向阿米巴样表型转换过程中的潜在作用提供了新的见解。

引言

肿瘤细胞逃避免疫监视并侵入周围组织的能力是癌症的一个显著特征1。特别是肿瘤细胞的运动能力是恶性肿瘤的典型特征，无论是转移性肿瘤（如乳腺癌2或结直肠癌3），还是局部侵袭性肿瘤（如弥漫性胶质瘤4,5）均如此。

成像技术在研究肿瘤细胞表型的诸多方面具有核心作用；然而，在研究细胞迁移和侵袭等动态过程时，尤其是当细胞形态及细胞间相互作用发生变化时6,7，活细胞成像无疑是更优的选择，因为这些变化能够通过时间序列更直观地被观察。对于活细胞成像，可采用多种光学显微镜系统，从相差显微镜到共聚焦荧光显微镜均可使用，图像采集可在倒置显微镜上进行，该显微镜需配备温控和CO2控制的培养室，也可在内置培养室的高内涵图像分析系统中进行，或使用可直接置于培养箱内的成像系统，从而在整个实验过程中无需移动细胞。所用系统的选取通常取决于多种因素，包括所需的分辨率、总采集时长及时间间隔、所用培养器皿类型和检测通量（单腔室或多孔板）、所用细胞的敏感性（珍贵和/或稀有细胞），以及当存在荧光染料时细胞的光毒性。

关于活细胞模式下的荧光成像，可通过转导细胞使其稳定表达荧光蛋白，或构建可诱导表达系统8，也可通过瞬时转染细胞，或使用现有可用于活细胞标记7、活细胞示踪以及亚细胞器标记的细胞染料来实现9。

最近开发出一种用于活细胞免疫细胞化学的实用方法，该方法中，识别特定表面标志物的抗体可与标记试剂结合，加入培养基后，即可通过活细胞成像技术实时观察表达该特定标志物的细胞。当细胞在二维（2D）培养条件下生长时，利用该系统可轻松实现对标志物表达的可视化与定量分析10。

本研究中，我们优化了针对儿童弥漫性中线胶质瘤（DMG）患者来源细胞的活体3D细胞免疫细胞化学侵袭与迁移实验方案11,12。DMG是一种高度侵袭性的儿童脑肿瘤，绝大多数病例与组蛋白H3变异体中的K27M驱动突变相关。DMG起源于脑干及中枢神经系统（CNS）的中线区域，具有高度浸润性。研究表明，这种侵袭能力至少部分由肿瘤内异质性及DMG细胞所具有的癌干细胞样特性所介导7。

为了展示我们的检测方法，我们联合使用了一种抗体标记试剂（ALR）和针对CD44的抗体。CD44是一种跨膜糖蛋白和黏附分子，表达于干细胞及其他多种细胞类型，与癌症干细胞表型以及肿瘤细胞的迁移和侵袭相关13。该实验方案包括样本制备、明场和荧光模式下的图像采集，以及在活细胞分析仪器上对弥漫性中线胶质瘤（DMG）细胞膜表面CD44总体表达水平进行实时定量分析，持续监测其在三维侵袭与迁移过程中的动态变化。该检测方法还可实现对单个细胞在迁移和侵袭过程中CD44间歇性荧光信号的可视化观察。有趣的是，我们还观察到抗CD44抗体具有一定的生物学效应：该抗体可能发挥阻断作用，不仅似乎抑制了细胞的迁移与侵袭能力，还诱导了侵袭模式由集体性、类间充质样转变为更倾向于单细胞、类阿米巴样的表型。

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方案

本方案遵循各机构人类研究伦理委员会的指导方针。

注意：本研究使用 Incucyte S3 和/或 SX5 活细胞分析仪（以下简称活细胞分析仪）进行。

1. 生成大小可重现的肿瘤球体

注意：以下所述方案（第1部分）基于Vinci等（2015）7,12所报道的方法，并作了一些修改：

  1. 收集携带 H3K27M 突变的弥漫性中线胶质瘤（DMG）神经球（NS），在室温（RT）下以 170 × g 离心 10 分钟（min）。
  2. 加入 500 µL 的 accutase 溶液，在 37 °C 下孵育 3 分钟，以解离神经球。
  3. 用肿瘤干细胞（TSM）培养基7中和 accutase 溶液，并在室温下以 355 × g 离心 5 分钟，收集细胞悬液。
  4. 将细胞沉淀重悬于 1 mL TSM 培养基中，使用细胞计数板进行细胞计数。
  5. 将细胞悬液稀释至 2.5–5 × 103 个细胞/mL，每孔接种 100 µL 至超低吸附（ULA）96 孔圆底培养板（参见 材料表）。选择适当的细胞密度，以确保接种后 4 天形成直径约 300 µm 的单个神经球（对于高侵袭性胶质瘤细胞，推荐接种密度为每孔 250–500 个细胞）。
  6. 细胞接种 4 天后，使用倒置显微镜观察并确认神经球的形成情况。

2. ALR/抗体复合物的制备及侵袭实验的建立

注意：抗体标记步骤采用活细胞免疫细胞化学的抗体标记染料方案10，并根据下述内容进行了一些修改。侵袭实验则遵循 Vinci 等人 2015 年 previously described 的方案12。

  1. 考虑需要分析的孔数（例如 60 孔），并计算每种试剂所需的体积。同时包括阴性对照孔（含 ALR 但不含抗体的样品）。
  2. 向 ALR 中加入 100 µL 无菌水以重悬试剂（终浓度 = 0.5 mg/mL）。用移液器吹打混匀。
    注意：该试剂对光敏感，因此需避光保存。将剩余试剂分装后于 -80 °C 保存（避免反复冻融）。
  3. 在圆底多孔板或棕色管中，将抗体与 ALR 混合于 TSM 培养基（或所选细胞系适用的细胞培养基）中，并避光处理。
  4. 配制足够量的培养基，使其以 25 µL/孔加入时达到 3 倍终浓度。室温孵育 15 分钟。
    注意：建议抗体与 ALR 的摩尔比为 1:3，测试抗体的终浓度（1x）应<1.5 µg/mL。本方案实验中使用抗人 CD44 小鼠抗体（起始浓度 86 µg/mL），终浓度为 0.1 µg/mL（3x 浓度 = 0.3 µg/mL）。按以下顺序添加试剂：i）抗体；ii）ALR；iii）TSM 培养基。通过移液器吹打混匀。
  5. 将背景抑制试剂（BSR）用 TSM 培养基（或所选细胞系适用的细胞培养基）稀释至 1.5 mM（3x），以确保在检测结束时达到 0.5 mM 的终浓度。
  6. 直接在最初接种细胞的 ULA 96 孔圆底板中进行侵袭实验。开始前用倒置显微镜目视检查神经球（NS）。
  7. 轻柔缓慢地从每孔中移除 75 µL 培养基，避免触碰底部的神经球（NS）。目视检查神经球的存在情况。
  8. 向每孔轻柔加入 25 µL BSR。
  9. 向每孔轻柔加入 25 µL ALR/抗体复合物。等待 2 至 3 分钟，使 ALR/抗体复合物与培养基充分混合。
  10. 使用倒置显微镜目视检查，确保每个神经球位于孔底中央。避免产生气泡。如有气泡，可用针头去除。
  11. 将培养板置于冰上，静置 5 分钟，使板底充分冷却。
  12. 使用预冷的 p200 吸头，将 75 µL/孔的基底膜基质（BMM）沿孔内壁加入，避免触碰孔底。避免产生气泡，并用无菌针头去除已形成的气泡。
    注意：确保 BMM 已于前一晚在 4 °C 条件下解冻。
  13. 将培养板继续置于冰上 5 分钟，使 BMM 与培养基充分混合。使用倒置显微镜目视检查神经球的存在及其是否位于孔中央。若未居中，可在 4 °C 条件下以 180 × g 离心 5 分钟。
  14. 将培养板转移至培养箱内的活细胞分析仪（材料表）中，设置条件为 37 °C、5% CO2、95% 湿度。

3. ALR/抗体复合物的制备及迁移实验的建立

注意：抗体标记步骤采用活细胞免疫细胞化学的标记染料方案10。

  1. 考虑需要分析的孔数，并计算每种试剂所需的体积，同时包括阴性对照所需的孔。开始实验前，使用倒置显微镜目视检查类球体（NS）的状态。
  2. 使用平底96孔板。按照Vinci等（2013）14所述方法进行包被操作。本研究中，使用薄层BMM进行包被。
  3. 包被完成后，用p200枪头沿孔壁边缘吸除多余的BMM包被液，避免触碰孔底。若同时处理多个孔，建议使用多通道移液器。
  4. 剪切p200枪头，从每个选定孔中吸取50 µL细胞培养基+类球体（NS），转移至已包被的平底孔中。目视检查每个孔中类球体（NS）的存在及其位置。
    注意：每个类球体（NS）必须位于孔中央。转移过程中避免枪头接触孔壁边缘，应将培养基滴加至孔中央，且不接触孔底。对于迁移能力较强的细胞，建议设置高于常规三复孔的重复数，因为当类球体（NS）过于靠近孔边缘时，迁移细胞可能覆盖更小的孔面积。
  5. 按照上述步骤（2.2–2.3）对ALR进行再水化。
    注意：该试剂对光敏感。请参见前述内容了解正确的操作方法。
  6. 在圆底多孔板或棕色管中，将抗体与ALR溶于适量的完全细胞培养基中，避光混合。配制足够体积，使每孔可加入50 µL，且抗体终浓度为检测所需浓度的3倍。室温孵育15分钟。
    注意：请按照上述步骤（2.4）中指定的顺序添加试剂。
  7. 按照步骤2.5中所述相同程序操作。
  8. 向每孔轻柔加入50 µL的BSR。
  9. 向每孔轻柔加入50 µL ALR/抗体混合液。静置2至3分钟使试剂充分混合，并使用倒置显微镜目视检查，确保大多数重复孔中的类球体（NS）位于孔中央。
  10. 避免产生气泡，如有气泡可用针头去除。轻柔地将培养板转移至置于37 °C、5% CO2、95%湿度培养箱内的活细胞分析仪中。

4. 活细胞分析仪器设置以进行图像采集

  1. 使用活细胞分析仪（仪器规格详见材料表）对培养板进行扫描，扫描时间点从侵袭和迁移实验设置完成后的零时（t0）开始，分别在步骤2.14和3.10完成后启动，持续至96小时。
    注意：务必确保在侵袭和迁移实验开始后立即启动活细胞分析仪。根据肿瘤类型的不同，细胞可能在实验设置后1小时内即开始从神经球（NS）中侵袭或迁移。
  2. 在活细胞分析仪软件中，选择定时采集选项。点击+标签，选择按计划扫描选项。
  3. 在软件窗口创建或恢复容器中，点击新建选项。
  4. 在活细胞分析仪中选择适用于侵袭和迁移实验的特定应用。侵袭实验选择类球体扫描类型、4倍物镜、相差+明场和绿色荧光图像通道；迁移实验选择稀释克隆扫描类型、4倍物镜以及相差和绿色荧光图像通道。
  5. 选择培养板类型，并在板图上高亮标记需要扫描的孔位。
  6. 设置扫描频率（本实验方案中，侵袭实验的扫描频率为15分钟，迁移实验为30分钟）。
  7. 点击添加到计划并启动扫描。

5. 用于图像分析的活细胞分析仪器设置

  1. 选择 创建新分析定义 选项卡。
  2. 在该选项卡上，分别选择 类球体侵袭 或 基础分析器 应用程序用于侵袭和迁移分析。
  3. 在图像通道中选择适用于侵袭和迁移的通道（侵袭：相差+明场-绿色；迁移：相差-绿色）。
  4. 从 3–4 个孔中选择若干具有代表性的图像，用于预览并优化分析设置。
  5. 对于侵袭实验，在 分析定义 选项卡中，通过以下设置调整 明场 和 绿色 通道的应用参数，以在整体类球体与侵袭细胞之间实现精确分割（参见 图5；蓝色掩膜）：
    明场分割：整体类球体灵敏度 = 50；侵袭细胞灵敏度 = 100；图像清理 = 默认。
    整体类球体滤波：所有参数设为默认值。
    侵袭细胞滤波：所有参数设为默认值。
    绿色通道分割：半径 = 900。
  6. 对于迁移实验，通过以下设置调整 相差 和 绿色 通道的应用参数，以在汇合区域与绿色标记细胞之间实现精确分割（参见 图5，黄色和粉色掩膜）：
    相差通道：所有参数设为默认值。
    绿色通道分割：半径 = 300；阈值 = 1000。
    图像清理：填充孔洞 = 400；滤波 = 默认。
    整孔分析：所有参数设为默认值。
  7. 随机点击多个孔，检查NS的分析设置是否正确。分割结果应准确勾勒出类球体轮廓。若未达到要求，请相应调整设置。
  8. 选择需要分析的孔和时间点。
  9. 保存 分析定义，然后点击 完成。

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结果

侵袭和迁移的活体三维细胞免疫细胞化学实验方案在图1中以简明且可重复的工作流程进行了总结。通过将DMG细胞接种于ULA 96孔圆底培养板中，可获得大小均一的神经球（NS），并用于后续各步骤。当神经球达到约300 µm的理想尺寸（接种后约4天）时，开始进行侵袭12和迁移14检测。将ALR/抗体复合物与背景抑制剂加入各个神经球的培养基中，可在活细胞成像过程中随时间推移追踪细胞膜上特异性标志物的表达。利用活细胞分析仪器，可从t = 0开始至96小时，按时间间隔轻松监测细胞侵袭和迁移过程中的表面标志物表达情况。该成像系统支持全自动图像分析。

采用一种源自患者的原代细胞系QCTB-R059，以例证儿童弥漫性中线胶质瘤（DMG）肿瘤扩散的侵袭与迁移特性。QCTB-R059最初被定义为儿童丘脑胶质母细胞瘤（GBM）细胞系15。随后，根据2016年世界卫生组织脑肿瘤分类标准，将H3F3A K27M突...

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讨论

我们在此用于儿童弥漫性中线胶质瘤侵袭和迁移的活体3D细胞免疫细胞化学技术，也可轻松适用于其他高度侵袭性的肿瘤细胞类型，包括乳腺癌和结肠癌细胞系。

与先前进行的活细胞二维免疫细胞化学检测10不同，在进行三维实验时，建议注意一些关键步骤。特别是对于本实验所描述的侵袭检测，建议在加入骨髓基质基质（BMM）之前，直接将ALR/抗体混合物加入各孔中含NS的培养基中，而不是加入BMM中，或在BMM凝胶化后加在其表面。这样做可使试剂与培养基充分混合，并确保试剂更直接地作用于细胞表面。此外，为获得更高质量的成像效果，尽管本方案中使用了BSR，我们仍建议使用不含酚红的培养基和BMM。

活细胞免疫细胞化学实验需要考虑的另一个问题是，任何与活细胞表面膜蛋白结合的抗体都可能通过改变蛋白构象，或占据配体或相邻细胞上其他蛋白的结合位点，从而影响该蛋白的功能，起到“阻断剂”的作用18,19。尽...

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披露

作者与任何在经济利益上与本文讨论的主题或材料存在利益关系或利益冲突的组织或实体均无相关关联或财务牵连。

致谢

我们感谢意大利罗马IRCCS-雷焦纳·埃莱娜国家癌症研究所细胞网络与分子治疗靶标研究单元的Silvia Soddu博士和Giulia Federici博士，为我们使用IncuCyte S3活细胞成像系统进行成像方案的初步建立提供了支持。此外，我们感谢Bernadett Kolozsvari提供的技术建议。本研究得到了英国儿童抗癌基金会（Children with Cancer UK）资助项目（编号16-234）以及意大利卫生部Ricerca Corrente项目的资助。M. Vinci是英国儿童抗癌基金会研究员。R. Ferretti是Veronesi基金会博士后奖学金（2018年和2019年）获得者。作者谨此感谢Heal基金会的支持，以及儿童医院基金会对昆士兰儿童肿瘤库的经费资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔TC处理微孔板Corning359596孔规格，聚苯乙烯材质，平底
AccutaseEurocloneECB3056D用于神经球解离的溶液
Burker计数室Mv medicalFFL16034细胞计数用计数室
CD-44 (156-3C11)Cell Signaling Technology3570小鼠单克隆抗体IgG2a
Corning Matrigel基质Corning356237基底膜基质（BMM），无酚红，无LDEV
Fabfluor-488 抗体标记染料Incucyte4743抗体标记试剂（ALR）：用于活细胞免疫细胞化学的小鼠IgG2a 488抗体
Incucyte S3 和/或 SX5 活细胞分析仪Sartorius-Incucyte S3 和/或 SX5 仪器用于实时细胞监测、细胞健康与活力评估、迁移与侵袭分析，以及多种表型细胞功能检测。
倒置显微镜-任意型号倒置显微镜
Opti-Green 背景抑制试剂Incucyte6500-0045背景抑制试剂（BSR）
肿瘤干细胞（TSM）培养基--细胞生长培养基（详见文中参考文献）
超低吸附多孔板Corning Costar700796孔规格，圆底透明

参考文献

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
  3. Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
  4. Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
  5. Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
  6. Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763(2020).
  7. Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
  8. Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
  9. Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045(2015).
  10. Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
  11. Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
  12. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686(2015).
  13. Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64(2018).
  14. Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
  15. Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
  16. Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
  17. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  18. Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209(2020).
  19. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  20. Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
  21. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).

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