提供详细的实验方案和三个Python脚本，用于操作开源的机器人液体处理系统，以进行质谱实验的半自动化蛋白质样品制备，涵盖去污剂去除、蛋白质消化和肽段脱盐步骤。
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摘要
摘要
基于质谱的鸟枪法蛋白质组学实验需要多个样品制备步骤，包括蛋白质的酶解和纯化，这些步骤可能耗费大量实验人员工时，并导致批间变异。使用移液机器人进行实验室自动化可减少人工操作，最大化通量，并提高研究的可重复性。然而，标准自动化工作站高昂的初始成本使得许多学术实验室难以负担。本文介绍了一种利用经济实惠的开源自动化系统（Opentrons OT-2）进行蛋白质组学样品制备的工作流程，包括设置半自动化蛋白质还原、烷基化、酶解和纯化步骤的操作说明，以及配套的开源 Python 脚本，用于通过其应用程序编程接口对 OT-2 系统进行编程。
引言
基于质谱的鸟枪法蛋白质组学是一种强大的工具，可同时测量生物样本中多种蛋白质的丰度。结合生物信息学分析的蛋白质组学实验通常用于鉴定生物标志物，并发现支撑病理机制的相关生物复合物和通路。由于其高分析物特异性和潜在的定量准确性，鸟枪法蛋白质组学在研究机构和诊断实验室的临床样本分析中也具有广阔的应用前景，且无需依赖抗体1,2。
为了准备用于鸟枪法蛋白质组学分析的蛋白质样品，通常需要首先对从生物样本（例如细胞和组织）中提取的蛋白质进行处理，处理过程包括测定样品的蛋白质浓度、蛋白质还原与烷基化，以及将蛋白质酶解为肽段。此外，使用含去垢剂的常用裂解缓冲液提取的蛋白质在分析前通常还需要额外的缓冲液置换或去垢剂去除步骤，因为去垢剂会干扰胰蛋白酶消化，并显著降低后续液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的性能3。在酶解完成后，肽段通常还需进一步脱盐、干燥，并重新溶解于适合LC-MS/MS分析的溶剂中。这些蛋白质生化操作步骤往往耗时且劳动密集，因此持续限制了蛋白质组学工作流程的通量，并增加了所获得数据的变异性4,5。人为误差和偏差已被认为是影响数据变异性和可重复性的关键因素6,7。为了最大限度减少质谱样品制备过程中的人为误差，已采用自动移液机器人系统来提高鸟枪法蛋白质组学和靶向质谱分析中蛋白质鉴定与定量的通量和可重复性；这些进展被认为对于推动蛋白质组学技术在重要科研和临床环境中的广泛应用至关重要8,9,10,11,12,13。然而，大多数现有方案所使用的机器人液体处理平台需要较高的资金投入和专业培训，这限制了其在许多学术机构或其他预算有限的实验室中的应用。
本文介绍了一种利用低成本、开源的机器人液体处理系统 OT-2 来半自动化典型鸟枪法蛋白质组学样品制备流程的实验方案。OT-2 的成本低于许多其他机器人液体处理系统，在撰写本文时，其价格约为 5,000 美元。若计入不同模块和实验耗材的费用，本方案在撰写本文时的实验搭建总成本约为 10,000 美元，相较于更昂贵的替代方案，使更广泛的实验室能够负担。OT-2 支持通过 Python 脚本进行开源编程，用户可高度灵活地自定义 DIY 协议设计。利用三个自主开发的脚本，以下方案涵盖了在 OT-2 平台上使用典型蛋白质标准品（牛血清白蛋白；BSA）和正常人心脏裂解液的复杂蛋白质样品执行典型鸟枪法蛋白质组学样品制备流程（图 1）。BSA 样品和复杂心脏裂解液样品的处理步骤分别在方案第 1、2、5、6 节和第 3、4、5、6 节中详细描述。采用 Sera-Mag 羧基修饰的磁珠进行单管固相增强样品制备（SP3），以去除蛋白质和肽段样品中的去垢剂和盐。来自牛血清白蛋白和人心脏蛋白的胰蛋白酶消化产物进一步通过 SP3 磁珠纯化，随后进行 LC-MS/MS 分析。质谱数据使用 MaxQuant 软件进行肽段和蛋白质的鉴定分析。我们获得的代表性结果表明，该方案在节省实验操作时间的同时，实现了优异的技术重复性变异系数（CV），且性能不逊于手工消化方法。
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方案
开发的 Python 脚本已存放在 GitHub 上，地址为：https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。 脚本副本见补充文件 1。有关最新版本，请参考 GitHub 代码仓库。
1. 实验准备
- 开始实验方案前检查所需的硬件设备。
注意：需要以下硬件组件：OT-2 移液器、移液器吸头、4 合 1 试管架套装、铝块套装、磁力模块、温控模块、96 孔 2 mL 深孔板（参见材料表）。
2. 采用单一蛋白质牛血清白蛋白（BSA）进行质谱（MS）样品制备
- 打开 NoSP3_digestion.py 在文本编辑器中编写脚本，并根据需要在“仅在此处自定义”部分指定实验特定的变量。
注意：实验特异性变量包括样本数量和重复次数；样本浓度；试剂二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）和胰蛋白酶的体积；DTT和IAA的孵育时间；以及移液器P20/P50和P300的起始加样枪头。- 打开 Opentrons 应用程序并将脚本上传至 实验方案 在 Opentrons 应用程序中的标签
注意：Opentrons 应用程序可从参考文献处下载14 传输至本地计算机。撰写本文时，Opentrons 商店暂不提供 Opentrons P50 电子移液器的购买。该型号已被 P20 单通道电子移液器取代，后者兼容本实验方案中指定的体积范围。脚本中已添加相应说明和操作指引，以 P20 移液器替代 P50 移液器。用户可能需要根据 Opentrons API 指南测试并验证所用移液器与本方案的兼容性。
- 打开 Opentrons 应用程序并将脚本上传至 实验方案 在 Opentrons 应用程序中的标签
- 打开 机器人 标签并执行机器人甲板校准 校准平台 在 机器人 按照 Opentrons App 中的分步屏幕提示进行操作。
注意：仅当此前尚未执行此步骤或机器人近期被转移位置时，才需要进行此操作。 - 点击 管理移液器 点击按钮执行吸头长度校准，然后进行移液器偏移校准，以校准默认吸头与移液器组合的位置。
注意：如果首次使用移液器，则必须执行此步骤。 - 将所需的实验耗材和移液器放置在 Python 脚本中指定的 OT-2 甲板相应位置图2).
注意：确保温度模块已连接并已通电，且铝块已放置在温度模块上方。 - 打开 校准 标签并对此 Python 脚本中所需的耗材与移液器组合进行校准。
注意：Opentrons 应用程序将记录校准参数，但对于使用相同耗材和移液器的后续实验而言，此步骤并非必需。 - 在15 mL锥形管中，将39.53 mg碳酸氢铵（ABC）溶解于质谱级水中，定容至5 mL，配制100 mM碳酸氢铵（ABC）溶液（pH ~8.0）。将配制好的碳酸氢铵缓冲液置于4合1管架的A1孔中，管架顶部为15 mL + 50 mL试管架。
- 在2.0 mL低吸附蛋白管中制备1 mL牛血清白蛋白（BSA）蛋白（参见 材料表). 将样品置于带有2 mL离心管架上盖的4合1管架的A1孔中。
- 手动将2.0 mL低吸附蛋白管放入温度模块上方铝块的A1、B1、C1、D1、E1、F1、A2等孔位中。
注意：机器人移液器默认将按垂直顺序从 A1 孔（第一个样本）开始，直至最后一个样本进行加样。也可设定为水平加样。请参见15 详情请参见。需要准备的试管总数应等于样本总数（即生物样本数乘以每个样本的技术重复数）。 - 将9.26 mg DTT固体溶于质谱纯水中，定容至1 mL，配制60 mM DTT溶液。将该DTT溶液置于4合1管架的A6孔中，并使用2 mL管架顶盖固定。
警告：DTT 对人眼、皮肤和呼吸系统有害。操作时须穿戴个人防护装备，并在通风橱中进行。请参考生产商提供的安全数据表以获取正确的操作规程。 - 观察机器人将适量的ABC缓冲液转移至铝块中的样本管。
注意：每管中ABC与蛋白混合物的总体积为100 µL，ABC缓冲液体积由程序计算得出（V = 100 µL 减去100 µg蛋白样品的体积）。 - 确保机器人将100 µg BSA蛋白转移至各管ABC缓冲液中。
注意：典型的实验可能使用多达 100 µg 蛋白质进行蛋白质消化，例如，本 BSA 样品使用 50 µL 浓度为 2.0 µg/µL 的溶液。 - 手动确认机器人程序已暂停，并显示以下信息：在继续执行程序前，请确保已将DTT加入4号槽位中的2 mL试管架的A6孔。请将DTT试管放入A6孔并打开管盖。点击 简历 按钮在 Opentrons 确保机器人向每个样本孔中转移10 µL DTT溶液，随后进行五次混匀。
- 确认机器人程序已暂停，并显示以下信息：确保关闭样本管的管盖。手动关闭各管的管盖，然后点击 简历 继续操作。等待机器人的温控模块开始加热铝块，直至温度达到55 °C，随后孵育5分钟，使样品温度升至55 °C。
注意：孵育期间，机器人将温度保持在 55 °C 持续 30 分钟，以使 DTT 充分还原蛋白质。 - 在DTT孵育的30分钟期间，通过将34.68 mg碘乙酰胺（IAA）溶解于ABC缓冲液中并定容至1 mL，配制1 mL浓度为187.5 mM的IAA溶液。用手将IAA溶液用铝箔包裹，避免光照。
警告：IAA 可引起严重的眼部和呼吸道刺激。应在化学通风橱中佩戴适当的个人防护装备（PPE）进行操作。 - 确保机器人温控模块在完成30分钟DTT孵育步骤后降温。
注意：当模块温度达到 22 °C 后，模块将保持该温度 5 分钟，以确保样品充分冷却。 - 当机器人程序暂停并显示警告信息“请确保打开样本管的管盖”时，打开样本管的管盖。点击 简历 继续。
- 手动确认机器人程序已暂停，并显示警告信息：“在继续执行方案前，请确保已将IAA加入位于4号位2 mL离心管架B6位置的管中。” 确认IAA管所在管架位置，并打开管盖。点击 简历 继续操作。确保机器人向每个样品管中转移10 µL IAA，随后进行五次混匀步骤。
- 当机器人程序暂停时，盖上样本管的管盖，并显示以下消息：盖紧样本管管盖，并用铝箔覆盖样本管。用一张干净的铝箔完全覆盖整个铝块。单击 简历 继续操作。等待样品在22 °C孵育30分钟。确保机器人温控模块在IAA孵育完成后自动关闭。
- 在 IAA 孵育期间（步骤 2.19）配制胰蛋白酶溶液混合物，终浓度为 0.2 µg/µL：将 20 µg 质谱/测序级胰蛋白酶溶解于 100 µL 质谱级水中。
- 将胰蛋白酶溶液放入2 mL试管架的C6孔中，并保持管盖打开，此时机器人的程序处于暂停状态，并显示警告信息：“在继续执行程序之前，请确保已将胰蛋白酶加入位于4号槽位的2 mL试管架C6孔中。” 点击“继续”以恢复程序。
- 检查机器人的程序是否已暂停并显示 温度模块上的样本管盖子打开警告。请打开样本管盖子，然后点击 简历 继续操作。等待机器人向每个样品管中加入10 µL胰蛋白酶，随后进行五轮混匀。
- 用石蜡膜包裹样品管盖，将所有样品转移至温控混匀仪中，在37 °C、600 rpm振荡条件下孵育16–20小时。
注意：胰蛋白酶消化也可直接在37 °C的温控模块上进行。
3. 使用SP3顺磁性磁珠进行多肽纯化
- 胰蛋白酶消化过夜后的第二天，使用台式微量离心机（≤2,000 × g）短暂离心样品（参见材料表），并将样品置于磁力架上，静置2分钟。
- 用移液器小心转移上清液至一组新的蛋白质低吸附微量离心管中。将样品保存在冰箱中，并继续进行步骤3.2–3.9。
注意：如需长期保存，请将样品储存在-80 °C。
- 用移液器小心转移上清液至一组新的蛋白质低吸附微量离心管中。将样品保存在冰箱中，并继续进行步骤3.2–3.9。
- 使用文本编辑器打开SP3_peptide_cleanup.py Python脚本，并根据需要在“仅在此处自定义”部分进行设置。
注意：实验特异性变量包括样品数量和重复次数、待转移肽段的体积、试剂（磁珠、乙腈、DMSO）的体积、P20/P50和P300移液器的起始吸头位置，以及磁力模块深孔板上的起始孔位。每个BSA消化样品约含120 µL消化液，将被分装为两个技术重复，每个重复55 µL。若仅需纯化一半消化产物，请将重复次数变量更改为1。 - 将该脚本上传至Opentrons应用程序中的PROTOCOL选项卡。
- 按照Python脚本中指定的位置，将所需的实验耗材和移液器放置在OT-2平台的相应位置（图3）。确保磁力模块已通电并连接至机器人。将一个新的2 mL 96孔深孔板（参见材料表）放置在磁力模块顶部。
- 打开CALIBRATE选项卡，对本Python脚本所需的实验耗材与移液器组合进行校准。
注意：相同耗材与移液器组合的校准仅需执行一次，Opentrons应用程序将记录校准参数。 - 将已消化的样品（步骤3.1中收集的上清液）按垂直顺序放置于2.0 mL管架中的A1、B1……孔位。
- 在50 mL锥形管中准备15 mL适用于LC-MS/MS的乙腈，并将该管放置在4合1管架的A3孔位，使用15 mL + 50 mL管架顶部组件固定。
- 在15 mL锥形管中加入100 µL DMSO和4.9 mL质谱级水，配制5 mL的2% DMSO溶液，并将该管放置在15 mL + 50 mL管架的A1孔位。
- 将一个空的50 mL锥形管标记为“废液”（Waste），并放置在15 mL + 50 mL管架的B3孔位。
- 按照参考文献16的方法制备SP3磁珠。
- 在2.0 mL微量离心管中准备适量的混合磁珠。
注意：每次肽段纯化反应需要10 µL混合磁珠。例如，进行四次纯化反应时，至少准备40 µL混合磁珠。 - 将磁珠混合物置于磁力架上静置2分钟，用移液器小心吸除上清液，并用移液器测量上清液体积。
- 计算剩余磁珠体积，加入5–10倍体积的质谱级水（例如，20 µL磁珠加入100–200 µL水），涡旋振荡（速度10）10秒。再将磁珠置于磁力架上静置2分钟。
- 重复水洗步骤，共进行三次洗涤。
- 将最终磁珠重悬于质谱级水中，使其终浓度为50 µg/µL。将洗涤后的磁珠放置在2.0 mL管架的A6孔位。
注意：建议磁珠重悬浓度为10 µg/µL16。在当前优化过程中，终浓度调整为50 µg/µL，以最小化磁珠-肽段-乙腈混合物的总体积。
- 在2.0 mL微量离心管中准备适量的混合磁珠。
- 确保机器人将55 µL已消化的样品转移至磁力模块深孔板的各孔中。
- 确认机器人程序已暂停，并显示提示信息：“在继续执行程序前，请确保已将制备好的磁珠加载至第4号位置2 mL管架的A6孔位。” 涡旋振荡磁珠后，在小型台式离心机上短暂离心5秒，然后将磁珠放回2 mL管架的A6孔位，管盖保持打开状态。等待机器人通过上下移液操作混合磁珠，共混合10次，重复5轮。
注意：机器人将10 µL磁珠转移至深孔板中的每个已消化样品，随后进行五次混合。 - 确保机器人向每孔加入1,292 µL乙腈，并立即通过上下移液操作混合10次，以促进肽段与磁珠的结合。
注意：由于P300移液器单次最多只能转移300 µL，因此每次转移需分多轮完成。 - 确保机器人在深孔板中对所有样品进行五次上下移液混合。
- 等待磁力模块启动，样品在模块上孵育2分钟。
- 等待移液吸液和排液速度从默认的150 µL/s调整为缓慢的25 µL/s。
注意：磁力模块启动时，机器人将缓慢吸除各孔中的上清液，并将其弃入废液管中。 - 等待移液吸液和排液速度恢复至默认设置。观察磁力模块是否已释放。
- 确认机器人程序已暂停，并显示提示信息：“请确保乙腈管盖已打开。” 手动打开乙腈管盖，将其放回管架，然后点击继续以继续程序。确保机器人向每个样品加入1 mL乙腈进行洗涤，并立即混合10次。
- 确保机器人对所有样品进行10次混合以完成洗涤。
- 等待磁力模块启动，并孵育样品2分钟。
- 等待机器人将移液吸液速度调至缓慢，缓慢吸除上清液并排入废液管中。
- 观察机器人将样品在磁力模块上孵育60秒，使残留乙腈挥发，随后将 移液吸液速度恢复至默认值。观察磁力模块是否已释放。
- 确认机器人程序已暂停，并显示提示信息：“再次涡旋DMSO并打开管盖。” 手动将2% DMSO涡旋振荡10秒后放回15 mL–50 mL管架的A1孔位，点击继续以继续程序。
- 确保机器人向每孔加入80 µL的2% DMSO，并立即混合10次。
- 确保机器人对所有样品再进行10次混合，共重复五轮。
- 等待磁力模块启动，并孵育样品2分钟。
- 观察机器人将移液吸液速度调至缓慢（25 µL/s），并将上清液缓慢转移至深孔板中的空孔中。
- 等待机器人将样品在磁力模块上孵育2分钟，以去除样品中残留的磁珠。
- 确认机器人程序已暂停，并显示提示信息：“在2 mL管架中放置新的2 mL离心管，确保管数与样品总数一致。”
- 在最后一个BSA消化样品所在孔的下一个孔位放置第一个2 mL微量离心管，点击继续以继续程序。
注意：例如，本方案中测试的六个BSA消化样品位于A1、B1、C1、D1、A2和B2孔位，因此新的一组2.0 mL离心管应放置在B3、C3、D3……等后续孔位。 - 观察机器人将深孔板各孔中的88 µL样品转移至新的一组2.0 mL离心管中。
注意：方案中转移体积（1.1 × 80 µL）经过优化，以确保样品全部体积均能被移液器吸头完全吸取。 - 等待机器人将移液吸液速度恢复至默认值，并释放磁力模块。
- 手动使用真空离心浓缩仪干燥纯化后的肽段（参见材料表），然后进入第5节，或将干燥样品储存在-20 °C。
4. 使用SP3顺磁性磁珠对人心脏蛋白裂解液（5 mg/mL）进行质谱样品制备
- 打开 SP3_digestion.py Python 脚本，并在“仅在此处自定义”部分指定变量的值。
注意：变量包括样本数量和重复次数、样本浓度、试剂体积（DTT、IAA、胰蛋白酶、磁珠、100% 和 80% 乙醇）、DTT 和 IAA 的孵育时间、移液器 P20/P50 和 P300 的起始吸头位置，以及磁力模块上深孔板的起始孔位。 - 按照第 2 节中的步骤 2.2–2.23，使用单一蛋白质牛血清白蛋白进行质谱样品制备，完成 DTT 和 IAA 孵育。参见 图 1 中这些步骤的机器人工作台布局。
- 在 DTT 和 IAA 孵育步骤（步骤 2.15 和 2.19）期间，为蛋白质纯化（如步骤 3.10 所述）准备新鲜的 SP3 磁珠混合液（每轮纯化反应使用 20 µL 磁珠）。将磁珠置于 2 mL 管架的 D6 孔中。
- 确认机器人的程序已暂停，并显示消息：“打开管盖”。手动打开温度模块上方铝块中样本管的管盖，然后点击 继续 以继续运行程序。
- 确保机器人已将所有样本从 2.0 mL 管转移至磁力模块上方的新深孔板中。
- 检查机器人的程序是否已暂停，并显示消息：“在继续执行方案前，请确保已将准备好的磁珠加入位于第 4 孔位的 2 mL 管架的 D6 孔中。” 打开磁珠管盖，然后点击 继续 以继续运行程序。
- 观察机器人将 20 µL 磁珠转移至深孔板的每个孔中，并进行五轮磁珠混合，随后对样本与磁珠的混合物进行五轮混合。
- 确认机器人的程序已暂停，并显示消息：“在继续执行方案前，请确保已将 100% 乙醇加入位于第 5 孔位的 15 mL–50 mL 管架的 A3 孔中。” 在 50 mL 锥形管中准备 10–20 mL 的 100% 乙醇（即 200 证明乙醇，参见 材料表），并将其放入管架的 A3 孔中。点击 继续 以继续运行程序。
- 在机器人将 140 µL 100% 乙醇立即转移至板中每个孔后，观察其随后进行 10 轮混合，以促进肽段与磁珠的结合。
- 确保机器人对每个样本进行每轮上下移液 10 次，共进行五轮混合。
- 在磁力模块启动后，观察其将样本在模块上孵育 2 分钟。
- 观察机器人将移液速度调至慢速（25 µL/s），从每个孔中吸取上清液并排入废液管中。
- 等待机器人将移液速度恢复为默认值，并关闭磁力模块。
- 确认机器人的程序已暂停，并显示消息：“在继续执行方案前，请确保已将 80% 乙醇加入位于第 5 孔位的 15 mL–50 mL 管架的 A4 孔中。” 手动配制 20 mL 80% 乙醇，将 4 mL 质谱级水与 16 mL 100% 乙醇（即 200 证明）混合。将 80% 乙醇放入管架的 A4 孔中。点击 继续 以继续运行程序。确保机器人向每个孔转移 1 mL 80% 乙醇，并立即进行 10 次混合。
- 观察机器人将移液速度调至慢速（25 µL/s），从每个孔中吸取上清液并排入废液管中。等待机器人将移液速度恢复为默认值，并关闭磁力模块。
- 当机器人的程序暂停并显示消息“打开 ABC 管的管盖”时，打开 ABC 溶液的管盖。点击 继续 以继续运行程序。在机器人关闭磁力模块、向每个孔转移 250 µL ABC 溶液并立即进行 10 次混合时，保持观察。
注意：此步骤用于用 ABC 溶液洗涤样本。 - 确保机器人启动磁力模块，并将样本在模块上孵育 2 分钟。
- 观察机器人将移液速度调至慢速（25 µL/s），并将每个孔中的上清液转移至废液管中。等待机器人向每个孔转移 100 µL ABC 缓冲液，并立即进行 10 次混合。
- 确认机器人的程序已暂停，并显示消息：“在继续执行方案前，请确保已在 2.0 mL 铝块中放置新的收集管。” 在铝块中原先最后一个样本管之后，立即放入一组新的低蛋白吸附微量离心管。点击 继续 以继续运行程序。在机器人将 ABC 缓冲液中的每个样本转移至新的 2.0 mL 管时，保持观察。
注意：检查各孔，如有需要，手动转移残留样本至管中。 - 当机器人的程序暂停并显示消息“在继续执行方案前，请确保已将胰蛋白酶（0.2 µg/µL）加入位于第 4 孔位的 2 mL 管架的 C6 孔中”时，通过将 20 µg 质谱级胰蛋白酶溶解于质谱级水中，配制成终浓度为 0.2 µg/µL 的适当量的胰蛋白酶溶液（每样本 10 µL）。确保机器人向每个样本管中转移 10 μL 胰蛋白酶，随后进行五轮混合。
- 用石蜡膜包裹样本管盖，将所有样本转移至温控混匀仪中，在 37 °C 下以 1,000 rpm 震荡孵育 16–20 小时。
注意：建议在 1,000 rpm 震荡条件下进行消化，以尽量减少过夜孵育期间磁珠的沉淀。
5. 使用SP3顺磁性磁珠进行多肽纯化
- 按照步骤2中的逐步说明，使用SP3磁性微珠进行多肽纯化。
6. 液相色谱与质谱分析
- 用0.1%甲酸重悬BSA（步骤2-3）和心脏裂解物（步骤4）的肽段：将1 mL液相色谱-质谱级99%甲酸加入质谱用水中，定容至总体积1 L。
注意：甲酸为强酸，对眼睛、皮肤和呼吸系统具有高度腐蚀性。请在通风橱内佩戴个人防护装备（PPE）小心操作。 - 使用定量肽检测试剂盒17测定消化后肽段浓度，并分别进样0.5 µg BSA消化产物和1.5 μg心脏组织消化产物用于LC-MS/MS分析。
- 设置LC-MS/MS分析的液相色谱程序。
注：典型设置中，可使用反相C18色谱柱（3 µm粒径；100 Å孔径；75 µm × 150 mm；见材料表），参数详见补充文件2。 - 使用质谱仪（见材料表）并依据补充文件3中提供的参数采集鸟枪法蛋白质组学数据。
- 搜索蛋白质数据库以进行蛋白质鉴定。
- 下载并安装所需软件MaxQuant。
注：本实验采用MaxQuant软件（v.1.6.10.43）执行后续步骤（见材料表）。 - 从高质量蛋白质序列数据库（UniProt/SwissProt）下载经人工审校的人类蛋白质组数据库（见材料表）。点击下载按钮，选择FASTA（标准序列）。
注：如需在数据库中包含各基因的蛋白质异构体，可选择性下载FASTA（非标准序列）版本。 - 在MaxQuant软件界面中，进入全局参数面板，点击序列选项卡，然后点击添加按钮，指定所用FASTA文件的路径，以将其设为蛋白质数据库。
- 在MaxQuant软件界面中，进入原始数据面板，点击加载按钮，选择需分析的原始质谱数据文件（raw文件）。
- 按照表1所示设置搜索参数。如需，启用无标记定量（LFQ）功能。
- 等待搜索完成，随后在/combined/txt文件夹中的msms.txt文件内查找通过1%错误发现率（FDR）阈值的肽谱匹配数（PSMs）。
注：在本研究代表性结果部分所进行的比较中，已过滤掉映射至多个蛋白质的PSMs，仅保留唯一映射至单一蛋白质的PSMs，用于统计PSMs、肽段和蛋白质的数量（图4和图5）。
- 下载并安装所需软件MaxQuant。
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结果
提供了三个与 OT-2 机器人兼容的 Python 脚本，用于质谱蛋白质组学的样品制备，分别针对单一蛋白质标准品牛血清白蛋白（技术重复 n = 5 次消化）和含去垢剂的人心组织裂解液样品（n = 5 次消化）。每种消化产物被分为两个肽段纯化反应。BSA 样品和心脏样品每次运行中鉴定出的肽段-谱图匹配数（PSMs）、肽段数和蛋白质数分别如图4和图5所示。BSA 样品中，共鉴定出中位数为 728 个 PSMs 和 65 个肽段，变异系数（CV）分别为 5.2% 和 3.2%。在复杂的心脏样品中，10 次运行中共鉴定出中位数为 9,526 个 PSMs、7,558 个肽段和 1,336 个蛋白质，其变异系数分别为 7.6%、5.9% 和 3.6%。通过对心脏样品进行 10 次运行，共鉴定出 1,935 个蛋白质，其中 1,677 个蛋白质在两次或以上运行中被鉴定到。为评估肽段定量的变异性，计算了映射至唯一蛋白质的 10 个肽段的提取离子色谱（XIC）强度的 CV（表2）。进一步通过三种蛋白质...
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讨论
方案中的关键步骤
为了获得最佳性能，应使用经 Opentrons 验证且与 OT-2 兼容的实验耗材、模块和消耗品 。自定义实验耗材可根据参考文献14中 Opentrons 的说明进行创建。首次使用时，务必对 OT-2 的工作台、移液器和实验耗材进行校准。同时，必须遵循 SP3 磁珠生产商的指南，以制备用于多肽和蛋白质纯化的磁珠。值得注意的是，在磁珠与多肽结合反应过程中，结合反应中乙腈的体积需 ≥95%，磁珠浓度需 ≥0.1 µg/µL。多肽浓度应保持在 10 µg/mL–5 mg/mL 范围内。根据本多肽纯化脚本中优化的参数，乙腈体积比为 95%，磁珠浓度为 0.37 µg/µL，多肽浓度范围为 14–37 µg/mL。根据我们的经验，100 µL 消化反应中的多肽质量估计为 40–100 µg。对于 SP3 蛋白质纯化，每 1 µg 蛋白质使用 5–10 µg 磁珠，并确保在蛋白质结合过程中磁珠最低浓度为 0.5 µg/µL。推荐的蛋白质浓度范围为 10 µg/mL–5 mg/mL。在所提供脚本的默认参数下，每 100 µg 蛋白...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目的支持，包括授予YH的F32-HL149191项目；授予EL的R00-HL144829项目；以及授予MPL的R21-HL150456、R00-HL127302和R1-HL141278项目。图 1、图2、图3是借助基于网络的科学绘图工具BioRender.com制作的。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 300 µL 移液器吸头 | Opentrons | ||
| 四合一试管架套装 | Opentrons | 每套包含 2 个底座和 4 个管架顶部，适用于 1.5 mL、2 mL、15 mL + 50 mL、15 mL 和 50 mL 试管。本研究中使用了 2 mL 和 15 mL + 50 mL 的管架顶部。 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱 | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm 粒径；100 Å 孔径；75 μm × 150 mm |
| 色谱-质谱级乙腈 | VWR | #JT9829 | |
| 铝块套装 | Opentrons | 该套装包含 3 个顶部，分别兼容 96 孔板、2.0 mL 管和用于 OT-2 温控模块的 PCR 条板。本文中使用了 2.0 mL 管架。 | |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| 牛血清白蛋白标准品，2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| 色谱-质谱级二甲基亚砜（DMSO） | Thermo Scientific | #85190 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC 色谱柱 | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 纳流液相色谱系统 | Thermo Scientific | #LC140 | |
| 乙醇，纯度 195-200 证明 | Fisher | #04-355-720 | |
| 色谱-质谱级甲酸 | Thermo Scientific | #85178 | |
| 人心脏裂解液 | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| 磁力管架 | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova 等，2016（https://www.maxquant.org/） | ||
| mySPIN 6 微型离心机 | Thermo Scientific | #75004061 | 台式微型离心机，用于快速离心 |
| NEST 2 mL 96 孔深孔板，V 型底 | Opentrons | ||
| OT-2 磁力模块 | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 单通道移液器 | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 单通道移液器 | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 移液机器人 | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 温控模块 | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce 定量比色肽测定试剂盒 | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind 2.0 mL 蛋白管 | Eppendorf | #022431102 | |
| 蛋白质序列数据库 | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes | |
| Sera-Mag SpeedBead 羧基修饰磁性颗粒，疏水型 | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead 羧基修饰磁性颗粒，亲水型 | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | 真空浓缩仪 | |
| Thermo Q Exactive HF 质谱仪 | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| 质谱级胰蛋白酶 | Thermo Scientific | #90057 | |
| 色谱-质谱级水 | VWR | #BDH83645.400 |
参考文献
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- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
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