Shotgun 蛋白质组学 样品处理 由开源实验室机器人自动执行

Summary

提供了详细的协议和三个Python脚本，用于操作开源机器人液体处理系统，以执行质谱实验的半自动蛋白质样品制备，包括去垢剂去除，蛋白质消化和肽脱盐步骤。

Abstract

基于质谱的鸟枪蛋白质组学实验需要多个样品制备步骤，包括酶蛋白消化和纯化，这可能占用大量的工作台劳动，并存在批次间变异性的来源。使用移液机器人实现实验室自动化可以减少手动工作，最大限度地提高通量，并提高研究的可重复性。尽管如此，标准自动化站的起始价格高昂，使许多学术实验室无法负担得起。本文介绍了使用经济实惠的开源自动化系统（Opentrons OT-2）的蛋白质组学样品制备工作流程，包括设置半自动蛋白质还原，烷基化，消化和纯化步骤的说明;以及随附的开源Python脚本，通过其应用程序编程接口对OT-2系统进行编程。

Introduction

基于质谱的鸟枪蛋白质组学是同时测量生物样品中许多蛋白质丰度的有力工具。具有生物信息学分析的蛋白质组学实验通常用于识别生物标志物并发现支持病理机制的相关生物复合物和途径。凭借其高分析物特异性和潜在的定量准确性，鸟枪蛋白质组学还具有极好的潜力，可以被研究机构和诊断实验室用于临床样品分析，而无需依赖抗体^1，2。

为了制备用于鸟枪蛋白质组学分析的蛋白质样品，从生物样品（例如，细胞和组织）中提取的蛋白质通常首先需要使用冗长的方案进行处理，包括测量样品蛋白质浓度，蛋白质还原和烷基化，以及酶消化成肽。此外，在含有去垢剂的普通裂解缓冲液中提取的蛋白质在分析之前通常需要额外的缓冲液交换或去除洗涤剂的步骤，因为洗涤剂会干扰胰蛋白酶消化并显着降低下游液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析的性能³。肽通常在酶消化后在LC-MS / MS相容性溶剂中进一步脱盐，干燥和重组。这些蛋白质生化程序可能是劳动密集型和耗时的。因此，它们继续限制蛋白质组学工作流程的通量，并导致所获取数据的可变性^4，5。人为错误和偏差已被公认为影响数据方差和可重复性的关键因素^6，

Protocol

开发的Python脚本已存放在GitHub上，网址为:https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。脚本的副本在 补充文件 1 中给出。有关最新版本，请参阅 GitHub 存储库。

1. 实验准备

1. 在启动协议之前检查所需的硬件。
   注:需要以下硬件组件:OT-2 移液器、移液器吸头、4 合 1 管架套件、铝块套件、磁性模块、温度模块、96 孔 2 mL 深孔板（见 材料表）。

2. 使用单一蛋白牛血清白蛋白（BSA）进行质谱（MS）样品制备

1. 在文本编辑器中打开 NoSP3_digestion.py 脚本，并在"仅在此处自定义"部分中根据需要指定特定于实验的变量。
   注:实验特定变量包括样本数和重复数;样品浓度;试剂二硫代甲状腺素 - DTT，碘乙酰胺 - IAA和胰蛋白酶的体积;DTT和IAA孵育时间，以及移液器P20/P50和P300的起始吸头）。
   1. 打开 Opentrons 应用程序并将脚本上传到 Opentrons 应用程序中的" 协议 "选项卡。
      注意:Ope....

Results

这里提供了三个与OT-2机器人兼容的Python脚本，它们使用单个蛋白质标准牛血清白蛋白（技术复制n = 5个消化）和一个含有洗涤剂的人心脏裂解物样品（n = 5个消化）执行质谱蛋白质组学的样品制备。每个消化产物被分成两个肽纯化反应。在每次运行BSA和心脏样品中，已鉴定的肽谱匹配（PSM），肽和蛋白质的数量如图 4 和 图5所示。BSA样本的中位数为728 PSM和65肽，变异系数（CV）分别为5.2%和3.2%。对于复杂的心脏样本，在10次运行中鉴定出9，526个PSM，7，558个肽和1，336个蛋白质的中位数，变异系数分别为7.6%，5.9%和3.6%。从心脏样本的10次运行中共鉴定出1，935种蛋白质，其中，在两次或多次运行中鉴定出1，677种蛋白质。为了确定肽定量的变异性，计算了映射到独特蛋白质的10种肽的提取离子色谱图（XIC）强度的CV（表2）。使用3种蛋白质标准样品和BCA测定法进一步比较了人类（手动移液）与机器人在测量蛋白质浓度方面的实验结果的变异性。发现机器人BCA.......

Discussion

协议中的关键步骤
为了获得最佳性能，应使用与OT-2兼容的Opentrons验证的实验室器具，模块和耗材。可以按照 Opentrons 在 ^Reference14 中的说明创建自定义实验室器具。确保在首次使用时校准OT-2甲板，移液器和实验室器具。遵循SP3磁珠制造商的指南来制备用于肽和蛋白质纯化的微球也至关重要。值得注意的是，在磁珠和肽结合反应过程中，结合反应中乙腈的体积需要≥95%，磁珠浓度需要≥0.1μg/μL。将肽浓度保持在10μg/mL-5mg/mL的范围内。在肽纯化脚本中优化参数的情况下，乙腈体积比为95%，磁珠浓度为0.37 μg/μL，肽浓度在14-37 μg/mL范围内。根据我们的经验，肽质量在100μL消化反应中估计为40-100μg。对于SP3蛋白纯化，使用5-10μg微珠至1μg蛋白，并确保在蛋白结合过程中最小微球浓度为0.5μg/ μL。推荐的蛋白质浓度在10μg/mL-5mg/mL的范围内。使用提供的脚本中的默认参数，1mg磁珠用于100μg蛋白质，结合过程中的磁珠浓度为3.75μg/μL，而蛋白质浓度为0.35mg/mL.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 和微;L 移液器吸头	Opentrons
4 合 1 试管架套件	Opentrons		每套包括 2 个底座和 4 个试管支架顶部 1.5 mL、2 mL、15 mL + 50 mL、15 mL 和 50 mL。在本研究中，我们使用 2 mL 和 15 mL + 50 mL 顶部。
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱	Thermo Scientific	#164568	3 μm 粒子;100 &毛孔;75 μm x 150 mm
乙腈 LC-MS 级	VWR	#JT9829
铝制模块套件	Opentrons		该模块套件包括 3 个与 96 孔 2.0 mL 试管兼容的顶部和一个与 OT-2 温度模块配合使用的 PCR 联管。我们在这份手稿中使用了 2.0 mL 试管架。
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	# A6141
牛血清白蛋白标准品，2 mg/mL	Thermo Scientific	#23210
二甲基亚砜 （DMSO） LC-MS 级	Thermo Scientific	#85190
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	#D5545
EASY-Spray HPLC 色谱柱	Thermo Scientific	#ES800A
EasynLC 1200 纳米液相色谱	Thermo Scientific	#LC140
乙醇证明 195-200	Fisher	#04-355-720
甲酸 LC-MS 级	Thermo Scientific	#85178
人心脏裂解物	Novus Biologicals	NB820-59217
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	#I1149
磁力管架	Thermo Scientific	#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43			Tyanova 等人，2016 （https://www.maxquant.org/）
mySPIN 6 迷你离心机	Thermo Scientific	#75004061	用于快速离心的台式微型离心机
NEST 2 mL 96 孔深孔板，V 型底	Opentrons
OT-2 磁性模块	Opentrons		GEN1
OT-2 P300 单通道移液器	Opentrons		GEN1
OT-2 P50 单通道移液器	Opentrons		GEN1
OT-2 移液机器人	Opentrons	OT-2
OT-2 温度模块	Opentrons		GEN1
Pierce 定量比色肽测定	Thermo Scientific	#23275
蛋白 LoBind 管 2.0 mL	Eppendorf	#022431102
蛋白质序列数据库	UniProt/SwissProt		https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20综述：是
Sera-Mag SpeedBead 羧酸盐修饰的磁性颗粒，疏水性	Cytiva	#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead 羧酸盐修饰的磁性颗粒，Hydrophylic	Cytiva	#45152105050250
SpeedVac	Thermo Scientific		真空蒸发器
Thermo Q Exactive HF 质谱仪	Thermo Scientific	#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
胰蛋白酶 MS 级	Thermo Scientific	#90057
水 LC-MS 级	VWR	#BDH83645.400