生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

Yonatan R. Lewis-Israeli; Brett D. Volmert; Mitchell A. Gabalski; Amanda R. Huang; Aitor Aguirre

doi:10.3791/63097

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方法文章

生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

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DOI：

10.3791/63097

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2021年9月15日

Yonatan R. Lewis-Israeli¹^,² , Brett D. Volmert¹^,² , Mitchell A. Gabalski¹^,² , Amanda R. Huang¹^,² , Aitor Aguirre¹^,²

¹Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, ²Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用人类多能干细胞通过自组织方式高效生成具有发育相关性的人类心脏类器官（hHOs）的实验方案。该方案依赖于发育信号的顺序性激活，可产生高度复杂且功能相关的人类心脏组织。

摘要

研究人类心脏在健康与疾病状态下发育的能力，受到体外模拟人类心脏复杂性的严重限制。in vitro 建立能够模拟复杂 in vivo 表型的更高效类器官平台（如类器官和器官芯片）将有助于提升对人类心脏发育及疾病的研究能力。本文介绍了一种利用人类多能干细胞通过自组织并结合小分子抑制剂逐步激活发育通路来生成高度复杂的人类心脏类器官（hHOs）的实验方案。胚胎体（EBs）在96孔圆底超低吸附培养板中生成，以利于单个结构的悬浮培养。

类器官通过三步Wnt信号通路调控策略分化为人心外膜类器官（hHOs），该策略包括：首先激活Wnt通路以诱导心源性中胚层命运；其次抑制Wnt通路以生成定型的心脏谱系；最后再次激活Wnt通路以诱导生心外膜器官组织。这些步骤在96孔板体系中进行，效率高、可重复性强，且每次实验可产生大量类器官。通过免疫荧光成像对分化第3天至第11天的样本进行分析，发现到第15天时，hHOs内部已呈现出第一和第二心场的特征，并形成高度复杂的组织结构，包括心肌组织，其中包含心房和心室样心肌细胞区域，以及由内皮细胞组织衬里的内部腔室。类器官还表现出贯穿整体结构的复杂血管网络和外层的心外膜组织。在功能层面，hHOs表现出强烈的搏动活性，并通过Fluo-4活细胞成像检测显示正常的钙离子活动。总体而言，该方案构建了一个可靠的平台体外类人心脏组织研究。

引言

先天性心脏病（CHDs）是人类最常见的先天性缺陷，影响约1%的活产婴儿¹^,²^,³。在大多数情况下，CHDs 的病因仍不明确。能够在实验室中构建出与发育中的人类心脏高度相似的人类心脏模型，是直接研究人类 CHDs 根本病因的重要进展，而非依赖替代性动物模型。

实验室培养的组织模型的典范是类器官，即在细胞组成和生理功能上均类似于特定器官的三维细胞结构。类器官通常来源于干细胞或祖细胞，已被成功用于构建多种器官的模型，例如大脑⁴^,⁵，肾脏⁶^,⁷，肠道⁸^,⁹，肺¹⁰^,¹¹肝脏¹²^,¹³和胰腺

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方案

1. 人多能干细胞的培养与维持

注意：人诱导性多能干细胞（hiPSCs）或人胚胎干细胞（hESCs）在解冻后需连续培养至少两个传代，方可用于生成拟胚体（EBs）以进行分化或进一步冻存。hPSCs 应在已包被基底膜细胞外基质（BM-ECM）的6孔培养板中，使用PSC培养基（见材料表）进行培养。在对6孔板中的hPSCs进行换液时，应将培养基直接加至孔的内侧壁，而非直接滴加在细胞层上，以避免引起非预期的细胞脱落或应激。使用者需注意，某些PSC培养基不可在37 °C预热；本实验方案中所使用的全部PSC培养基均为热稳定型。

为将BM-ECM包被于培养板中，将一份BM-ECM（根据生产商说明保存于-20 °C）置于冰上解冻，取0.5 mg BM-ECM与12 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12培养基（保存于4 °C）混合。将2 mL DMEM/F12-BM-ECM混合液加入6孔板的每孔中，于37 °C孵育至少2 h。
解冻细胞时，先将hPSC冻存管在37 °C金属浴或水浴中解冻1-2 min，直至仅剩少量冰晶可见。将解冻后的细胞转移至离心管中，缓慢加入8-9 mL含2 µM ROCK抑制剂thiazovivin（Thiaz）的PSC培养基，于300 × g离心5 min。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含2 µM Thiaz的PSC培养基中。根据冻存管中细胞浓度，将细....

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结果

为实现自组织的人类类脑器官（hHO）体外我们改进并整合了先前报道的用于心肌细胞二维单层分化的方法²¹ 和心外膜细胞²² 使用Wnt信号通路调节剂构建三维前心器官样体¹⁶ 使用生长因子 BMP4 和 Activin A。采用本研究所述并展示的 96 孔板 EB 及 hHO 分化方案图1，通过优化Wnt信号通路激活剂CHIR99021的浓度和处理时间，可获得由人多能干细胞（hPSCs）衍生的高度可重复且结构复杂的类人脑类器官（hHOs）。处于60–80%融合度、以类集落形态生长、且无明显分化迹象的人多能干细胞（hPSCs）或人胚胎干细胞（hESCs），在PSC培养基中培养至适宜状态，是生成拟胚体（EB）的理想起始材料。图1B).

将拟胚体（EBs）培养48小时，并在24小时后更换培养基，随后于第0天开始诱.......

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讨论

近年来，源自人类干细胞的心肌细胞及其他心脏来源的细胞已被用于模拟人类心脏发育²²^,²⁴^,²⁵ 和疾病²⁶^,²⁷^,²⁸，并作为筛选治疗药物²⁹^,³⁰ 和毒性物质³¹^,³² 的工具。本文报道了一种易于实施且高度可重复的方案，用于生成类胚体（EBs）并将其分化为高度复杂的人类心脏类器官（hHOs）。该方案已在多种细胞系中成功应用，包括hPSCs和hESCs²³，均表现出稳定的心肌搏动频率和细胞类.......

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院下属的国家心、肺和血液研究所资助，资助编号为 K01HL135464 和 R01HL151505，以及由美国心脏协会资助，资助编号为 19IPLOI34660342。我们感谢密歇根州立大学先进显微镜中心以及密歇根州立大学药理学与毒理学系的 William Jackson 博士提供共聚焦显微镜的使用机会，感谢 IQ 显微镜中心以及密歇根州立大学基因组学中心提供的测序服务。同时，我们感谢 Aguirre 实验室所有成员所提出的宝贵意见和建议。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
抗体
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 驴抗兔	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 驴抗兔	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 驴抗山羊	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	兔；1:200
HAND2	Abcam	ab200040	兔；1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	兔；1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	兔；1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	小鼠；1:200
THY1	Abcam	ab133350	兔；1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	山羊；1:250
VIM	Abcam	ab11256	山羊；1:250
WT1	Abcam	ab89901	兔；1:200
培养基与试剂
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	细胞解离试剂
Activin A	R&D Systems	338AC010
B-27 补充剂（不含胰岛素）	Gibco	A1895601	无胰岛素细胞培养补充剂
B-27 补充剂	Gibco	17504-044	细胞培养补充剂
BMP-4	Gibco	PHC9534
牛血清白蛋白	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-果糖	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
二甲基亚砜	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex 培养基试剂盒	Gibco	A2858501	含1%青霉素-链霉素的多能干细胞（PSC）培养基
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
甘油	Millipore Sigma	G5516
甘氨酸	Millipore Sigma	410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	基底膜细胞外基质（BM-ECM）
正常驴血清	Millipore Sigma	S30-100mL
多聚甲醛	MP Biomedicals	IC15014601	粉末溶于PBS缓冲液 – 使用浓度为4%
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010049
磷酸盐缓冲液（10倍浓缩）	Gibco	70011044
Polybead 微球	Polysciences, Inc.	73155	90 µm
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	人多能干细胞（hPSCs）解离试剂
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
吐温X-100	Millipore Sigma	T8787
台盼蓝溶液	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
其他
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	02682002
15 mL Falcon 管	Fisher Scientific	1495970C
2 mL 冻存管	Corning	13-700-500
50 mL 试剂储液槽	Fisherbrand	13681502
6孔平底细胞培养板	Corning	0720083
8孔腔室盖玻片，#1.5 高性能盖玻片	Cellvis	C8-1.5H-N
96孔透明超低吸附微孔板	Costar	07201680
ImageJ	NIH		图像处理软件
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	06-666	实验室擦拭纸
显微盖玻片	VWR	48393-241	24 x 50 mm，No. 1.5
显微镜载玻片	Fisherbrand	1255015
Moxi 细胞计数仪	Orflo Technologies	MXZ001
Moxi Z 细胞计数卡盒 – M型	Orflo Technologies	MXC001
多通道移液器	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µL
Olympus cellVivo	Olympus		用于钙成像，ImageJ 分析
Sorvall Legend X1 离心机	ThermoFisher Scientific	75004261
恒温混匀仪	ThermoFisher Scientific	13-687-717
Top Coat 指甲油	Seche Vite		可在任意超市购买

参考文献

Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease....

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结果

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致谢

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参考文献

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