从水生环境分离、扩增与鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌物种

摘要

我们介绍了从水生环境中分离、扩增和表征降解烃类细菌的过程。该方案概述了细菌的分离方法、基于16S rRNA方法的鉴定，以及对其降解烃类潜力的测试。本文将有助于研究人员表征环境样品中的微生物多样性，并特异性筛选具有生物修复潜力的微生物。

摘要

烃类污染物难以降解，其在环境中积累对所有生命形式均具有毒性。细菌编码多种催化酶，天然具备代谢烃类的能力。科学家利用水生生态系统中的生物多样性，分离具有生物降解和生物修复潜力的细菌。这些从环境中分离的菌株提供了丰富的代谢途径和酶资源，可进一步用于工业化规模的降解过程。本文概述了从水生环境分离、扩增和鉴定细菌物种的一般流程，并筛选其以烃类作为唯一碳源进行生长的能力 关键词：烃类污染物，生物降解，生物修复，水生细菌，代谢途径，催化酶，碳源利用 体外 使用简单技术。本方案描述了从环境中分离多种细菌物种，并通过16S rRNA分析对其进行鉴定的步骤。方案还介绍了表征细菌分离株降解烃类潜力的方法。该方案对于致力于从环境生境中分离细菌并将其应用于生物技术领域的研究人员具有重要参考价值。

引言

碳氢化合物（HC）被广泛用作燃料和化学原料。芳香族碳氢化合物如苯、甲苯和二甲苯被广泛用作溶剂¹。烯烃如乙烯和丙烯分别是合成聚乙烯和聚丙烯聚合物的前体。另一种碳氢化合物苯乙烯的聚合反应生成聚苯乙烯。 人类活动在碳氢化合物的生产和运输过程中将其引入环境。土壤和水体中的碳氢化合物污染对环境和人类健康构成严重威胁。微生物通过调控生物地球化学循环，并利用多种底物（包括污染物和异生物质）将其转化为碳源和能源，在维持生态系统中发挥重要作用。 微生物对环境污染物进行解毒的过程称为生物修复^3,4,5,6,7。

具有降解烃类能力的微生物存在于水生环境和土壤生境中^8,9,10。已鉴定出多种能够降解烷烃和芳香烃类（HC）的细菌，例如 Pseudomonas、Acinetobacter、

方案

1. 样品采集、处理与分析

注意：本文介绍了一种从水生环境中分离细菌的实验方案。部分分离得到的菌株可能具有致病性，因此操作时应佩戴手套，并在使用前后对工作区域进行消毒。

1. 从水体的不同位置用五个无菌玻璃瓶采集 500 mL 水样。分别使用 pH 计和温度计测量每个样品的 pH 值和温度。
   注意：本方案不局限于特定地点，也可轻松适用于从受烃类污染的水体中分离微生物。
2. 在无菌条件下，将样品以 100 mL 为一批次，通过孔径为 0.22 µm 的滤膜进行过滤。
   注意：滤纸直径不应超过培养皿直径。例如，对于直径为 100–120 mm 的培养皿，使用直径不超过 85 mm 的滤纸最为合适。
3. 将滤膜分别置于不同的营养培养基平板上（PYE¹⁹、R2A²⁰、M9、LB、NB、TSB、M63²¹ 和 M2G²²）。不同类型的培养基有助于选择和富集不同的微生物。各种培养基的组成见表 1。每种培养基平板使用一张滤膜，2 小时后用无菌镊子小心揭下。
4. 将未过滤的水样在无菌双蒸水中进行连续梯度稀释（最高稀释至 10⁶

结果

从水生环境中分离和筛选细菌并通过对16S rRNA分析进行鉴定的整个流程示意图如 图1所示。从印度达德里（Dadri）一处湿地采集的水样被收集于无菌玻璃瓶中，并立即送往实验室进行处理。样品经孔径为0.22 µm的滤膜过滤后，将滤纸分别贴附于不同的培养基平板上。2小时后移除滤纸，平板在30 °C下培养过夜以促进菌落形成（图2）。次日，挑取单个细菌菌落并在新鲜培养基平板上划线分离（图2）。获得的纯培养物被保存下来，并用于后续分析。通过该方法，我们成功构建了一个包含100多个独特细菌分离株的文库。我们的目标是鉴定能够利用烃类物质（尤其是聚苯乙烯塑料主要成分——苯乙烯）作为碳源的细菌分离株。将分离得到的细菌分别接种于添加液态苯乙烯作为唯一碳源的相应培养基中进行培养（图3）。我们成功鉴定出4株能够以苯乙烯为唯一碳源生长的菌株，其中2株被进一步深入表征其降解苯乙烯的能力

讨论

众所周知，地球上仅有约1%的细菌能够在 实验室⁶中被轻松培养。即使在可培养的细菌中，仍有许多尚未被表征。分子方法的进步为细菌群落的分析与评估提供了新的维度。然而，这些技术仍存在局限性，并未使培养分析变得多余。用于分离单一细菌物种的纯培养技术仍是表征其生理特性的主要手段。土壤和水生环境蕴藏着大量具有新颖酶类和代谢通路的细菌，这些资源可被用于生物技术应用。本研究描述了一种从生态样本中分离和表征细菌的简单且经济的方法。

不同的细菌具有不同的营养需求，因此使用了多种培养基以提高分离出多样化细菌种类的概率。该方法的一个主要局限性在于，具有苛刻生长需求的微生物可能会被排除在外。此外，此步骤的主要目标是最大化从样品中获得的细菌种类数量。样品文库中细菌种类的数量越多，就越有可能分离出具有生物修复潜力的微生物。尽管本研究仅改变了培养基，但改变培养温度和氧气浓度也可能进一步增加获得独特物种的机会^41,42。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A4718	凝胶电泳
氯化铵 (NH4Cl)	Sigma-Aldrich	A9434	培养基组分
硫酸铵	Sigma-Aldrich	A4418	培养基组分
细菌琼脂	Millipore	1016141000	固体培养基制备
氯化钙 (CaCl2)	MERCK	C4901-500G	培养基组分
邻苯二酚	Sigma-Aldrich	135011	烃类降解测定
十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)	Sigma-Aldrich	H6269	基因组DNA提取
氯仿	HIMEDIA	MB109	基因组DNA提取
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S5136	培养基组分
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	基因组DNA缓冲液组分
七水合硫酸亚铁 (FeSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	215422	培养基组分
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021	培养基组分
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	培养基组分；甘油菌保存
异丙醇	HIMEDIA	MB063	基因组DNA提取
LB琼脂	Difco	244520	培养基
LB培养基 (Luria-Bertani)	Difco	244620	培养基
硫酸镁 (MgSO4)	MERCK	M2643	培养基组分
一水合硫酸锰(II) (MnSO4.H20)	Sigma-Aldrich	221287	培养基组分
营养肉汤 (NB)	Merck (Millipore)	03856-500G	培养基
蛋白胨	Merck	91249-500G	培养基组分
苯酚	Sigma-Aldrich	P1037	基因组DNA提取
磷酸氢二钾 (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786	培养基组分
磷酸二氢钾 (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	培养基组分
蛋白酶K	ThermoFisher Scientific	AM2546	基因组DNA提取
QIAquick凝胶回收试剂盒	QIAGEN	160016235	DNA纯化
QIAquick PCR纯化试剂盒	QIAGEN	163038783	DNA纯化
R2A琼脂	Millipore	1004160500	培养基
SmartSpec Plus分光光度计	BIO-RAD	4006221	吸光度测定
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889	基因组DNA提取
氯化钠 (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	培养基组分
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	基因组DNA提取
苯乙烯	Sigma-Aldrich	S4972	苯乙烯生物降解
Taq DNA聚合酶	NEB	M0273X	16S rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)缓冲液	Sigma-Aldrich	93283	基因组DNA重悬
胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB)	Merck	22092-500G	培养基
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG	培养基组分
七水合硫酸锌 (ZnSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	221376	培养基组分