方法文章

从水生环境分离、扩增与鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌物种

DOI：

10.3791/63101

⸱

2021年12月7日

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了从水生环境中分离、扩增和表征降解烃类细菌的过程。该方案概述了细菌的分离方法、基于16S rRNA方法的鉴定，以及对其降解烃类潜力的测试。本文将有助于研究人员表征环境样品中的微生物多样性，并特异性筛选具有生物修复潜力的微生物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

烃类污染物难以降解，其在环境中积累对所有生命形式均具有毒性。细菌编码多种催化酶，天然具备代谢烃类的能力。科学家利用水生生态系统中的生物多样性，分离具有生物降解和生物修复潜力的细菌。这些从环境中分离的菌株提供了丰富的代谢途径和酶资源，可进一步用于工业化规模的降解过程。本文概述了从水生环境分离、扩增和鉴定细菌物种的一般流程，并筛选其以烃类作为唯一碳源进行生长的能力 关键词：烃类污染物，生物降解，生物修复，水生细菌，代谢途径，催化酶，碳源利用 体外 使用简单技术。本方案描述了从环境中分离多种细菌物种，并通过16S rRNA分析对其进行鉴定的步骤。方案还介绍了表征细菌分离株降解烃类潜力的方法。该方案对于致力于从环境生境中分离细菌并将其应用于生物技术领域的研究人员具有重要参考价值。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

碳氢化合物（HC）被广泛用作燃料和化学原料。芳香族碳氢化合物如苯、甲苯和二甲苯被广泛用作溶剂1。烯烃如乙烯和丙烯分别是合成聚乙烯和聚丙烯聚合物的前体。另一种碳氢化合物苯乙烯的聚合反应生成聚苯乙烯。 人类活动在碳氢化合物的生产和运输过程中将其引入环境。土壤和水体中的碳氢化合物污染对环境和人类健康构成严重威胁。微生物通过调控生物地球化学循环，并利用多种底物（包括污染物和异生物质）将其转化为碳源和能源，在维持生态系统中发挥重要作用。 微生物对环境污染物进行解毒的过程称为生物修复3,4,5,6,7。

具有降解烃类能力的微生物存在于水生环境和土壤生境中8,9,10。已鉴定出多种能够降解烷烃和芳香烃类（HC）的细菌，例如 Pseudomonas、Acinetobacter、Rhodococcus、Marinobacter 和 Oleibacter11。先进的非培养依赖型技术的发展有助于发现新的烃类降解微生物群落12。直接从来源样品中提取的基因组材料通过高通量方法（如下一代测序技术，NGS）进行扩增和测序，随后进行分析，从而无需对微生物进行培养。然而，诸如宏基因组分析等NGS方法成本较高，且在扩增过程中存在技术局限性13。选择性富集培养等培养技术14仍具有实用价值，因其可实现对烃类降解微生物的靶向分离，使研究人员能够深入探究并操控细菌分离株中的代谢通路。

基因组DNA的分离及其后续的基因组材料测序可揭示任何生物体的宝贵信息。全基因组测序有助于鉴定编码抗生素抗性、潜在药物靶点、毒力因子、转运蛋白、异源物质代谢酶等的基因15,16,17。对编码16S rRNA基因的测序已被证实是一种鉴定细菌系统发育关系的可靠技术。该基因序列和功能在多年进化中高度保守，使其成为鉴定未知细菌以及将分离株与最近缘物种进行比较的可靠工具。此外，该基因的长度非常适合生物信息学分析18。结合使用通用引物扩增该基因的简便性以及基因测序技术的进步，这些特点共同使其成为微生物鉴定的金标准。

本文介绍了一种从环境样品中回收具有烃类降解潜力的可培养微生物的实验方法。以下所述方法包括烃类降解细菌的采集与鉴定，共分为五个部分：（1）从水样中采集细菌，（2）纯培养物的分离，（3）探究细菌分离株的烃类降解能力，（4）基因组DNA的提取，以及（5）基于16S rRNA基因测序与BLAST分析的菌种鉴定。该方法可适用于分离用于多种不同生物技术应用的细菌。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 样品采集、处理与分析

注意：本文介绍了一种从水生环境中分离细菌的实验方案。部分分离得到的菌株可能具有致病性，因此操作时应佩戴手套，并在使用前后对工作区域进行消毒。

  1. 从水体的不同位置用五个无菌玻璃瓶采集 500 mL 水样。分别使用 pH 计和温度计测量每个样品的 pH 值和温度。
    注意：本方案不局限于特定地点，也可轻松适用于从受烃类污染的水体中分离微生物。
  2. 在无菌条件下，将样品以 100 mL 为一批次，通过孔径为 0.22 µm 的滤膜进行过滤。
    注意：滤纸直径不应超过培养皿直径。例如，对于直径为 100–120 mm 的培养皿，使用直径不超过 85 mm 的滤纸最为合适。
  3. 将滤膜分别置于不同的营养培养基平板上（PYE19、R2A20、M9、LB、NB、TSB、M6321 和 M2G22）。不同类型的培养基有助于选择和富集不同的微生物。各种培养基的组成见表 1。每种培养基平板使用一张滤膜，2 小时后用无菌镊子小心揭下。
  4. 将未过滤的水样在无菌双蒸水中进行连续梯度稀释（最高稀释至 106 倍）：取 100 µL 原水样加入 900 µL 无菌水中，得到 1:10 稀释液；从此稀释液中再取 100 µL 加入 900 µL 无菌水中，得到 1:100 稀释液；依此类推，直至完成 1:1,000,000 的稀释倍数。每次稀释均通过移液器反复吹打混匀。每次稀释后的终体积为 1 mL。
  5. 取 100 µL 各稀释度的水样，分别涂布于第 3 步所述的所有培养基平板上，每个稀释度设三个重复。
  6. 将平板在 30 °C 下培养 24 至 48 小时，具体时间根据菌落生长情况而定。
    注意：大多数环境分离菌在 30 °C 下生长最佳。若样品来源于极端温度环境，则应将平板在与采样点相同温度条件下培养。
  7. 随后使用无菌牙签或移液器吸头挑取菌落，并进行四区划线法接种，以获得单菌落。
  8. 将平板过夜培养。次日根据菌落的形态特征（如颜色、质地、形状、大小、边缘、隆起程度等）进行筛选，并重新划线以获得纯培养物。
  9. 对每种纯培养物进行革兰氏染色23，并进行甘油保存液的制备。
  10. 制备甘油保存液时，挑取单菌落接种于 3 mL 合适的液体培养基中，在 30 °C 下培养过夜。取 700 µL 过夜培养物加入含 300 µL 100% 甘油（经高压灭菌）的冻存管中24，混匀后于 -80 °C 冻存，用于长期保存。

2. 烃类的降解

注意：以下示例用于筛选能够降解苯乙烯的菌株。该方法是对先前报道中采用的方法25的轻微修改。所有步骤均需在无菌条件下进行。

  1. 从新鲜划线的平板上挑取单菌落，接种于5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）/营养肉汤（NB）中。在30 °C、200 rpm振荡条件下培养过夜，直至吸光度达到约2。
    注意：除TSB/NB外，可选择任何能使细菌达到高细胞密度的培养基。
  2. 第二天，以 2862 x g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。
  3. 将沉淀用 2 mL 灭菌生理盐水（0.9% NaCl）洗涤两次，每次在 2862 x g 下离心 g 4 °C下离心5分钟。
    注意：生理盐水是等渗的，因此可维持细菌细胞内的渗透压。
  4. 将沉淀重悬于2 mL液体无碳基础培养基（LCFBM）中。测定吸光度（OD600).
  5. 取两个无菌的150 mL锥形瓶，分别用于对照组和实验组，标记为A和B。
  6. 在未接种的对照组（A 瓶）中，加入 40 mL LCFBM 和苯乙烯（5 mM）。
  7. 在B瓶中加入35 mL LCFBM培养基和苯乙烯（调节苯乙烯终浓度为5 mM）。加入细胞悬液，使终末OD值为600 细胞密度≈0.1，并用LCFBM补足体积至40 mL。将锥形瓶置于30 °C、200 rpm振荡条件下培养30天。
    注意：过量的碳氢化合物可能对微生物具有毒性，因此应从低浓度开始，并逐步增加。
  8. 对每种需要评估烃类降解能力的额外菌株重复上述步骤。
  9. 测量OD600 每5天测定各锥形瓶的OD值并绘制生长曲线。若细菌能够利用苯乙烯，则将培养时间延长至45天。OD值升高表明细菌生长。600 表明该细菌能够代谢苯乙烯。

3. 细菌分离株降解儿茶酚能力的筛选

注意：芳香烃（如苯乙烯、苯、二甲苯、萘、酚类等）的降解会产生儿茶酚作为反应中间产物。这些儿茶酚可分别通过邻位裂解和间位裂解途径，在儿茶酚 1,2-双加氧酶和儿茶酚 2,3-双加氧酶的作用下被细菌进一步代谢26。这些酶也参与其他烃类化合物（如氯苯）的降解过程27。下述方案采用全细胞裂解液进行儿茶酚 2,3-双加氧酶活性检测28。相同的裂解方法也可用于儿茶酚 1,2-双加氧酶活性的筛选，但反应体系的组成会有所不同。这两种酶均为可诱导型酶，可通过在培养基中添加酚类物质进行诱导表达。

  1. 使用无菌接种环，从新鲜划线的平板上挑取细菌菌落，接种至添加了1-4 mM苯酚的无机盐培养基（MSM）中。在30 °C、200 rpm条件下培养。当OD600达到1.4–1.6（即处于对数生长后期）时，在4 °C下以4500 × g离心20分钟，收集菌体。
  2. 用磷酸盐缓冲液（0.5 M，pH 7.5）洗涤菌体沉淀。
  3. 将菌体重悬于上述磷酸盐缓冲液中，并调节最终OD600 ≈ 1.0。
  4. 采用脉冲式超声处理裂解细胞，总时长1.5分钟，每次脉冲持续15秒。此步骤后，悬液应变得澄清或浊度明显降低。若未达到，则增加脉冲次数并检查悬液是否澄清。每次脉冲后将样品置于冰上，以防蛋白质降解。
  5. 在4 °C条件下，以9,000 × g离心30分钟，去除细胞碎片和未破裂的细胞。
  6. 小心吸取上清液。该组分即为用于酶活性测定的粗提物。
  7. 采用Bradford法或Lowry法测定粗提物的蛋白质浓度29,30。
  8. 为测定儿茶酚2,3-双加氧酶活性，使用分光光度计检测反应终产物（2-羟基粘康酸半醛）的生成。
  9. 通过加入20 µL儿茶酚（50 mM）、960 µL磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.5）和20 µL粗提物，配制反应混合液。
  10. 对于阴性对照，用磷酸盐缓冲液替代粗提物，并将终体积调至1 mL。
  11. 将反应混合液孵育30分钟，按设定的时间间隔测定375 nm处的吸光度。吸光度的增加表明反应终产物2-羟基粘康酸半醛（2-HMS）的生成。实验需设三个重复。
    ​注意：儿茶酚对光和氧气敏感。应将反应混合液避光保存，并 tightly 封闭管口，以防止儿茶酚发生自然降解。

4. 纯培养物的基因组DNA提取

注意：本实验为基因组DNA提取的通用方案。在样品采集、处理和分析步骤中进行了革兰氏染色。由于革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的细胞壁厚度存在差异，需相应调整细胞裂解方法。提取过程中应佩戴手套，并使用70%乙醇对工作台进行消毒，以防止核酸酶降解DNA。下述部分化学试剂可能对皮肤造成严重灼伤，操作时须格外小心。

  1. 从革兰氏阴性细菌中分离基因组DNA31。
    1. 挑取单个菌落，接种于无菌试管中的新鲜培养基中。
    2. 将试管置于摇床培养箱中，在200 rpm条件下于30 °C过夜培养细菌。
    3. 次日，取1.5 mL过夜培养物，在12,400 × g条件下离心3分钟，收集菌体沉淀。
    4. 弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL裂解缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，pH 7.8，20 mM乙酸钠，1 mM EDTA，1% SDS）中。
    5. 加入66 µL NaCl溶液（5 M），充分混匀。
    6. 在4 °C条件下，于12,400 × g离心10分钟，收集沉淀。
    7. 用移液器吸取澄清的上清液至新的微量离心管中，加入等体积氯仿。
    8. 反复倒置混匀溶液，直至出现乳白色溶液。
    9. 在12,400 × g条件下离心3分钟，将上清液转移至洁净离心管中。
    10. 加入1 mL预冷的100%乙醇，轻轻颠倒混匀，直至析出白色丝状DNA沉淀。
    11. 在4 °C条件下，于2,200 × g离心10分钟收集DNA沉淀，弃去上清液。
    12. 用1 mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，在室温下干燥5分钟。
    13. 干燥后，将沉淀重悬于100 µL 1× Tris-EDTA（TE）缓冲液中，并将DNA于-20 °C保存。
    14. 使用分光光度计测定浓度（A260/280），并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量24。
  2. 从革兰氏阳性菌株中分离基因组DNA32
    1. 挑取单个菌落，接种于 无菌试管中的新鲜培养基中。
    2. 将试管置于摇床培养箱中，在200 rpm条件下于适宜生长温度过夜培养细菌。
    3. 次日，取1.5 mL培养物，在8,600 × g条件下离心5分钟。
    4. 弃去上清液，将菌体重悬于TE缓冲液中。
    5. 用TE缓冲液调节OD600至1.0，取740 µL菌悬液转移至洁净的微量离心管中。
    6. 加入20 µL溶菌酶（100 mg/mL储存液），用移液器充分混匀。在37 °C干浴中孵育30分钟。
    7. 加入40 µL 10% SDS，充分混匀。
    8. 加入8 µL蛋白酶K（10 mg/mL），充分混匀后在56 °C干浴中孵育1–3小时。此时悬浮液应变得澄清且黏度增加，表明细胞裂解充分。
      注意：若细胞未完全裂解，可过夜孵育。
    9. 将CTAB/NaCl混合液在65 °C预热（干浴），取100 µL加入菌悬液中，充分混匀。
    10. 在65 °C干浴中孵育10分钟。
    11. 加入500 µL氯仿:异戊醇（24:1），充分混匀。在25 °C条件下，于16,900 × g离心10分钟。
    12. 将水相转移至新的微量离心管中，避免吸取有机相（底部黏稠相）。
    13. 小心加入500 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分混匀。在25 °C条件下，于16,900 × g离心10分钟。
    14. 取水相至新的微量离心管中，加入500 µL氯仿:异戊醇（24:1），充分混匀。
    15. 转移水相，并加入0.6体积的异丙醇（预冷至-20 °C）。
    16. 应可见丝状DNA沉淀析出。在-20 °C孵育2小时至过夜。
    17. 在4 °C条件下，于16,900 × g离心15分钟，收集DNA沉淀。
    18. 小心倾去异丙醇，用1 mL预冷的70%乙醇（-20 °C预冷）洗涤沉淀，以去除杂质。
    19. 在4 °C条件下，于16,900 × g离心5分钟，弃去上清液。
    20. 将沉淀在室温下干燥20分钟，或置于37 °C干燥。注意避免过度干燥。
    21. 将沉淀重悬于100 µL 1× TE缓冲液中，并将DNA于-20 °C保存。
      注意：若沉淀过度干燥难以重悬，可将含有DNA沉淀的微量离心管与无核酸酶水在37 °C孵育15–20分钟，再用移液器重新混匀。
    22. 将DNA用1× TE缓冲液稀释100倍后，使用分光光度计测定浓度（A260/280），并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量24。

5. 16S rRNA 测序

注意：以下方案适用于细菌鉴定的16S rRNA扩增与测序。通过16S rRNA序列获得的信息可用于未知生物体的鉴定，以及分析不同生物体之间的亲缘关系。

  1. 为鉴定菌株，使用针对细菌16S rRNA序列的通用引物通过PCR扩增自纯培养细菌中提取的DNA：27F （5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R （5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）33。
  2. 在冰上配制PCR反应体系（25 µL反应体积），包含18 µL灭菌/无核酸酶水、2.5 µL 10x缓冲液、0.5 µL正向和反向引物（100 µM母液）、2 µL dNTPs混合液（100 µM母液）、1 µL DNA模板（2–15 ng/µL）以及1 U Taq DNA聚合酶。
  3. 16S rRNA基因扩增的PCR循环条件如下：94 °C预变性10 min；（94 °C变性40 s、56 °C退火1 min、74 °C延伸2 min）共30个循环；74 °C最终延伸10 min。
  4. 循环结束后，取5 µL产物与1 µL 5x DNA上样缓冲液混合，在1%琼脂糖凝胶上电泳以验证扩增结果。PCR产物可短期保存于4 °C，或长期保存于-20 °C冷冻备用。
  5. 进行16S rRNA基因测序时，按上述方法设置更大体积（100 µL）的相同反应体系。
  6. 使用PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化以用于Sanger测序24,34，或直接将全部样品与DNA上样缓冲液混合后上样至琼脂糖凝胶，采用凝胶回收法提取目标片段。
  7. 测序完成后，将结果文件转换为FASTA格式，并利用NCBI的局部比对搜索工具（BLAST）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）35比对序列相似性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从水生环境中分离和筛选细菌，并通过16S rRNA分析对其进行鉴定的完整流程示意图见 图1。水样采自印度达德里的一处湿地，收集于无菌玻璃瓶中，立即送往实验室进行处理。将样品通过孔径为0.22 µm的滤膜，随后将滤膜贴附于不同培养基平板上。2小时后移除滤膜，将平板置于30 °C条件下过夜培养以形成菌落（图2）。次日，挑选单个细菌菌落并在新鲜培养基平板上划线培养（图2）。获得的纯培养物被保存下来，并用于后续分析。利用该方法，我们成功构建了一个包含100多个独特细菌分离株的文库。我们的目标是鉴定能够利用烃类物质（尤其是聚苯乙烯塑料主要成分——苯乙烯）作为碳源的细菌分离株。将分离得到的细菌分别接种于相应的培养基中，并添加液态苯乙烯作为唯一碳源（图3）。我们成功鉴定出4株能够以苯乙烯为唯一碳源生长的菌株，其中2株被进一步深入表征其降解苯乙烯的能力

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

众所周知，地球上仅有约1%的细菌能够在 实验室6中被轻松培养。即使在可培养的细菌中，仍有许多尚未被表征。分子方法的进步为细菌群落的分析与评估提供了新的维度。然而，这些技术仍存在局限性，并未使培养分析变得多余。用于分离单一细菌物种的纯培养技术仍是表征其生理特性的主要手段。土壤和水生环境蕴藏着大量具有新颖酶类和代谢通路的细菌，这些资源可被用于生物技术应用。本研究描述了一种从生态样本中分离和表征细菌的简单且经济的方法。

不同的细菌具有不同的营养需求，因此使用了多种培养基以提高分离出多样化细菌种类的概率。该方法的一个主要局限性在于，具有苛刻生长需求的微生物可能会被排除在外。此外，此步骤的主要目标是最大化从样品中获得的细菌种类数量。样品文库中细菌种类的数量越多，就越有可能分离出具有生物修复潜力的微生物。尽管本研究仅改变了培养基，但改变培养温度和氧气浓度也可能进一步增加获得独特物种的机会41,42。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢 Karthik Krishnan 博士和 RP 实验室成员提供的有益评论和建议。DS 由首尔国立大学博士奖学金和地球观察研究所印度分会奖学金资助。RP 实验室由 CSIR-EMR 项目资助以及沙夫·纳达尔大学的启动资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Sigma-AldrichA4718凝胶电泳
氯化铵 (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434培养基组分
硫酸铵Sigma-AldrichA4418培养基组分
细菌琼脂Millipore1016141000固体培养基制备
氯化钙 (CaCl2)MERCKC4901-500G培养基组分
邻苯二酚Sigma-Aldrich135011烃类降解测定
十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)Sigma-AldrichH6269基因组DNA提取
氯仿HIMEDIAMB109基因组DNA提取
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136培养基组分
EDTASigma-AldrichE9884基因组DNA缓冲液组分
七水合硫酸亚铁 (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422培养基组分
葡萄糖Sigma-AldrichG7021培养基组分
甘油Sigma-AldrichG5516培养基组分；甘油菌保存
异丙醇HIMEDIAMB063基因组DNA提取
LB琼脂Difco244520培养基
LB培养基 (Luria-Bertani)Difco244620培养基
硫酸镁 (MgSO4)MERCKM2643培养基组分
一水合硫酸锰(II) (MnSO4.H20)Sigma-Aldrich221287培养基组分
营养肉汤 (NB)Merck (Millipore)03856-500G培养基
蛋白胨Merck91249-500G培养基组分
苯酚Sigma-AldrichP1037基因组DNA提取
磷酸氢二钾 (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786培养基组分
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791培养基组分
蛋白酶KThermoFisher ScientificAM2546基因组DNA提取
QIAquick凝胶回收试剂盒QIAGEN160016235DNA纯化
QIAquick PCR纯化试剂盒QIAGEN163038783DNA纯化
R2A琼脂Millipore1004160500培养基
SmartSpec Plus分光光度计BIO-RAD4006221吸光度测定
乙酸钠Sigma-AldrichS2889基因组DNA提取
氯化钠 (NaCl)Sigma-AldrichS9888培养基组分
十二烷基硫酸钠 (SDS)Sigma-AldrichL3771基因组DNA提取
苯乙烯Sigma-AldrichS4972苯乙烯生物降解
Taq DNA聚合酶NEBM0273X16S rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)缓冲液Sigma-Aldrich93283基因组DNA重悬
胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB)Merck22092-500G培养基
酵母提取物Sigma-AldrichY1625-1KG培养基组分
七水合硫酸锌 (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376培养基组分

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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