我们提出了一种用于确定多细胞手性的实验方案 体外，使用微图形化技术。该检测方法可自动量化多种类型细胞的左右偏向性，适用于筛选实验。
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本文内容
摘要
摘要
手性是一种细胞固有的特性，表现为细胞沿左右轴方向极化的不对称性。随着这一独特性质因其在发育和疾病中的重要作用而受到越来越多关注，建立一种标准化的细胞手性表征定量方法将有助于推动相关研究及潜在应用。本实验方案描述了一种利用微图案化细胞阵列进行多细胞手性表征的检测方法。细胞微图案通过微接触印刷技术制备于钛/金镀膜的玻璃载片上。将细胞接种至几何形状明确（例如环形）、蛋白包被的微小区域后，细胞会定向迁移并倾向于沿顺时针或逆时针方向形成偏置性排列，该现象可通过自行编写的MATLAB程序进行自动分析与量化。本文详细介绍了微图案化基底的制备、细胞接种、图像采集以及数据分析流程，并展示了使用NIH/3T3细胞获得的代表性结果。该方案已在多项已发表的研究中得到验证，是研究细胞手性的高效且可靠的工具 关键词：细胞手性，微图案化，左-右不对称性，微接触印刷，细胞极化，MATLAB分析，多细胞排列 体外.
引言
细胞的左右（LR）不对称性，也称为细胞手性或手征性，描述了细胞在左右轴上的极性，被认为是基本的、保守的生物物理特性1,2,3,4,5。细胞手性已在体内（in vivo）和体外（in vitro）多个尺度上被观察到。先前的研究发现，单个细胞在圆形岛状基底上培养时，其肌动蛋白细胞骨架呈现手性涡旋结构6；细胞在受限边界内表现出偏向性迁移和定向排列7,8,9,10,11；以及鸡胚心脏管的不对称环化现象12。
在多细胞层面，细胞手性可通过定向迁移或排列、细胞旋转、细胞骨架动态以及细胞器定位来确定
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方案
1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章的制备16
- 使用 CAD 软件绘制微尺度环阵列，内径为 250 µm，外径为 450 µm。本方案所用图案为 10 × 10 阵列，环与环之间的间距为 850 µm。
- 通过微加工公司的掩模打印服务，以所需分辨率打印该图案的透明掩模（见材料表）。
注意：已证实本方案中提供的环尺寸适用于多种细胞类型7。 - 利用包含目标特征的掩模进行紫外光（UV）光刻，制备负性光刻胶模具（如 SU-8）8。
- 将步骤 1.1–1.2 制备的透明掩模覆盖在旋涂有光刻胶的硅片上。
- 在紫外光接触式对准仪上，通过紫外光使掩模透明区域下的光刻胶发生聚合。
注意：经过后续清洗和显影后，即可制得具有目标特征的主模具8。具体操作细节取决于所使用的设备。
- 将 PDMS 弹性体预聚物与其固化剂按 10:1 的比例混合，配制 PDMS 混合物，然后将其浇注到培养皿中的模具上。
- 将培养皿放入真空腔中抽气 30 分钟以去除 PDMS 中的气泡，随后在 60 °C 烤箱中烘烤至少 2 小时。
- PDMS ....
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结果
NIH/3T3 细胞接种后 15 分钟，通过相差成像在视觉上确认了细胞在环形图案上的黏附。继续培养 24 小时后，图案上的细胞达到汇合状态，并呈现拉长形态，且明显沿顺时针方向不对称排列（图 2）。通过延时成像记录黏附细胞的定向迁移，视频经进一步分析后可对细胞运动性和形态发生进行量化。为进行手性分析，固定后采集高分辨率相差图像（图 2A-C），并输入 MATLAB 程序。该程序检测图像强度梯度，并计算细胞在环形区域上的相应排列方向。随后，基于细胞排列方向相对于环周方向的圆周统计，确定细胞的手性。因此，细胞可被归类为顺时针（CW）、逆时针（CCW）或非手性（NC）（图 2D）。分析结果显示，大多数环形区域表现出显著的顺时针偏向，表明 3T3 细胞具有强烈的顺时针手性。所生成的圆周统计结果还可提供偏角的附加信息，以供进一步分析（图 2E）。.......
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讨论
本文所述的环形图案化实验为多细胞手性的定量表征提供了一种易于使用的工具，能够产生高度可靠且可重复的结果。通过快速生成完全相同的定义微环境并进行无偏分析，可实现大规模样本的自动化高通量处理。本实验方案详细介绍了环形微图案的制备、细胞图案化以及细胞定向排列和方向性运动的自动分析方法。该方法可与活细胞成像技术兼容，用于研究细胞运动性和手性形态发生过程，并有望整合到其他平台中，应用于毒性检测9或药物筛选。
还有一些额外的提示需要分享。首先，在微接触印刷步骤中，印章必须制作在玻璃的镀金面（基底切割成小片后可能难以区分），并应避免重复印刷。其次，对于需要其他蛋白质才能正常贴附的细胞，可在步骤 3.17 使用所需的蛋白质。第三，在细胞培养过程中，细胞密度不应过高，且细胞不应在图案上生长至过度融合，否则细胞可能突破内侧边界，使环状结构填充为实心圆。第四，若接种后细胞图案出现断裂或不完整，可能是由于在接触印刷过程中（步骤 3.7–3.8）C18 图案转移不完全所致，应检查 PDMS 印章是否存在缺陷；适当增加印章压印时的力度也可能有所帮助。最后，若细胞.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（OD/NICHD DP2HD083961 和 NHBLI R01HL148104）资助。Leo Q. Wan 是生物医学科学 Pew 学者（PEW 00026185），由 Pew 慈善信托基金支持。Haokang Zhang 由美国心脏协会博士前奖学金（20PRE35210243）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200 证明乙醇 | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX 显微镜系统 | Keyence | BZX-600 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高葡萄糖 | Gibco | 11965092 | |
| 电子束蒸发仪 | Temscal | BJD-1800 | 金-钛薄膜涂层 |
| 胎牛血清 | VWR | 89510-186 | |
| 牛血浆来源纤连蛋白 | Sigma | F1141-5MG | |
| 玻璃显微镜载玻片 | VWR | 10024-048 | |
| 玻璃镊子 | Exelta | 390BSAPI | |
| 金蒸发颗粒 | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH（EG3） | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 细胞 | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI 接触式光刻对准仪 | OAI | 200 | 紫外光刻 |
| 十八烷硫醇（C18） | Sigma | O1858-25ML | |
| 旋转摇床 | VWR | 89032-088 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Research product international | P32080-100T | |
| 聚二甲基硅氧烷 Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| 硅晶圆 | University Wafer | ID#809 | |
| 丙酮酸钠 | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 光刻胶 | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| 钛蒸发颗粒 | International Advanced Materials | TI14 | |
| 透明掩模（带特征图案） | Outputicity.com | N/A | 掩模打印服务 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
参考文献
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q.
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