一种用于测量细胞手性的微图形化检测方法

摘要

我们提出了一种用于确定多细胞手性的实验方案 体外，使用微图形化技术。该检测方法可自动量化多种类型细胞的左右偏向性，适用于筛选实验。

摘要

手性是一种细胞固有的特性，表现为细胞沿左右轴方向极化的不对称性。随着这一独特性质因其在发育和疾病中的重要作用而受到越来越多关注，建立一种标准化的细胞手性表征定量方法将有助于推动相关研究及潜在应用。本实验方案描述了一种利用微图案化细胞阵列进行多细胞手性表征的检测方法。细胞微图案通过微接触印刷技术制备于钛/金镀膜的玻璃载片上。将细胞接种至几何形状明确（例如环形）、蛋白包被的微小区域后，细胞会定向迁移并倾向于沿顺时针或逆时针方向形成偏置性排列，该现象可通过自行编写的MATLAB程序进行自动分析与量化。本文详细介绍了微图案化基底的制备、细胞接种、图像采集以及数据分析流程，并展示了使用NIH/3T3细胞获得的代表性结果。该方案已在多项已发表的研究中得到验证，是研究细胞手性的高效且可靠的工具 关键词：细胞手性，微图案化，左-右不对称性，微接触印刷，细胞极化，MATLAB分析，多细胞排列 体外.

引言

细胞的左右（LR）不对称性，也称为细胞手性或手征性，描述了细胞在左右轴上的极性，被认为是基本的、保守的生物物理特性^1,2,3,4,5。细胞手性已在体内（in vivo）和体外（in vitro）多个尺度上被观察到。先前的研究发现，单个细胞在圆形岛状基底上培养时，其肌动蛋白细胞骨架呈现手性涡旋结构⁶；细胞在受限边界内表现出偏向性迁移和定向排列^7,8,9,10,11；以及鸡胚心脏管的不对称环化现象¹²。

在多细胞层面，细胞手性可通过定向迁移或排列、细胞旋转、细胞骨架动态以及细胞器定位来确定^{7,8,9,10,11,12,13}。我们已建立一种基于微图形化技术¹⁴的检测方法，可高效表征贴壁细胞的手性倾向^7,8,9,10。通过环形微图形在几何上限制细胞簇，细胞会集体表现出定向迁移和偏斜排列。我们开发了一个MATLAB程序，用于自动检测和测量环形区域相衬图像中的细胞排列情况。局部细胞排列方向通过一个偏转角进行量化，该角度取决于其相对于环周方向的偏离程度。经过统计分析后，将细胞的环形排列模式归类为逆时针（CCW）偏斜或顺时针（CW）偏斜。

该检测方法已被用于表征多种细胞表型的手性 （表1），且细胞的左右不对称性已被发现具有表型特异性^7,11,15此外，肌动蛋白动力学和形态的破坏可能导致手性偏好的逆转^7,8，氧化应激也能改变细胞的手性⁹由于该方法操作简便且结果稳定可靠^7,8,9,10这种二维手性检测方法为确定和研究多细胞手性提供了高效且可靠的工具 体外.

本实验方案旨在演示如何利用该方法表征细胞的手性。本方案详细描述了如何通过微接触印刷技术制备图案化细胞阵列，并使用MATLAB程序以自动化方式开展手性分析。

方案

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章的制备¹⁶

1. 使用 CAD 软件绘制微尺度环阵列，内径为 250 µm，外径为 450 µm。本方案所用图案为 10 × 10 阵列，环与环之间的间距为 850 µm。
2. 通过微加工公司的掩模打印服务，以所需分辨率打印该图案的透明掩模（见材料表）。
   注意：已证实本方案中提供的环尺寸适用于多种细胞类型⁷。
3. 利用包含目标特征的掩模进行紫外光（UV）光刻，制备负性光刻胶模具（如 SU-8）⁸。
   1. 将步骤 1.1–1.2 制备的透明掩模覆盖在旋涂有光刻胶的硅片上。
   2. 在紫外光接触式对准仪上，通过紫外光使掩模透明区域下的光刻胶发生聚合。
      注意：经过后续清洗和显影后，即可制得具有目标特征的主模具⁸。具体操作细节取决于所使用的设备。
4. 将 PDMS 弹性体预聚物与其固化剂按 10:1 的比例混合，配制 PDMS 混合物，然后将其浇注到培养皿中的模具上。
5. 将培养皿放入真空腔中抽气 30 分钟以去除 PDMS 中的气泡，随后在 60 °C 烤箱中烘烤至少 2 小时。
6. PDMS 完全固化后，将图案阵列切割成印章。
   ​注意：由于在后续微接触印刷步骤中更易于操作，建议使用较厚的印章（约 1 cm）。

2. 玻璃载玻片的包被

1. 清洗载玻片。将载玻片浸泡在100%乙醇溶液中，超声处理5分钟，然后用水冲洗。
2. 依次用丙酮和异丙醇重复此步骤，随后在氮气气流中干燥。
3. 使用电子束（E-beam）蒸发设备在载玻片上镀钛和金层。
   注意：钛层的期望厚度为15 Å（1 Å = 10^-10 m），金层的期望厚度为150 Å。应先镀钛层再镀金层，因为钛层可作为金与玻璃载玻片之间的粘附层。
4. 将清洗后的载玻片放入蒸发腔，并在快门下方放置金和钛坩埚。
5. 在熔化金属前，将腔体抽真空至低于10^-5 Pa。将电子束聚焦到金属上，并调节功率，使沉积速率适合精确控制沉积厚度。
6. 打开快门开始金属沉积。当达到所需厚度时，关闭快门。
7. 在连续蒸发两种金属时切换坩埚。
8. 根据设备要求等待坩埚冷却，向腔体通气，取出镀金的载玻片。
9. 再次抽真空以进行设备维护。
   ​注意：操作细节可能因具体的电子束蒸发仪而异。精确控制钛的沉积速率并保持较低速率非常重要。过厚的钛层通常会导致成像质量下降，尤其是在细胞荧光成像时。镀膜完成后，钛/金镀层载玻片可在室温下的干燥真空环境中保存至少1个月。

3. 微接触印刷

1. 如有需要，可将镀钛/金的载玻片切割成较小的片状。典型应用推荐使用 12 mm × 12 mm 的正方形（图1B）。
2. 使用玻璃切割刀在载玻片表面划出凹痕轨迹，然后用手握住载玻片两侧，在凹痕处弯折使其断裂为小块。避免触碰镀金表面。
   注意：若载玻片意外翻转，可通过比较两面的光线反射来判断哪一侧为镀层表面。镀金面反射更明亮，而未镀层面（玻璃另一侧的钛层）反射较暗。另一种方法是观察载玻片边缘，通过垂直切割面可判断镀层所在侧。
3. 将载玻片放入培养皿中，金面朝上，用100%乙醇浸泡，并置于摇床上至少清洗10分钟。吸除乙醇后，用氮气流吹干每片载玻片。
4. 用肥皂水清洗PDMS印章，再用100%乙醇冲洗，最后用氮气吹干。
5. 通过将5.74 mg C18粉末溶于10 mL 100%乙醇中，配制2 mM十八烷硫醇（C18）溶液。
   注意：C18溶液应密封并在室温下保存。使用C18进行图案化可形成具有黏附性的自组装单分子层，有利于纤连蛋白和细胞的选择性附着。
6. 将PDMS印章的图案面向下浸入C18溶液中10秒，随后用氮气轻柔吹干60秒。
   注意：干燥时，先将氮气流置于远离印章的位置（约1米远），待大部分液体蒸发后，再缓慢靠近以彻底干燥印章。此举可防止C18溶液被气流吹走而未能在印章表面干燥。
7. 将印章图案面向下贴附于金载玻片上，保持60秒后取下。
8. 为确保转印效果良好，可用镊子轻轻敲击印章表面，以实现图案的充分转移。切勿用力下压，通常镊子自身重量已足够。
   注意：敲击过程中目视检查印章，可确认印章与载玻片是否均匀接触。
9. 准备湿度培养室。
   1. 用移液器将1 mL 70%乙醇加入倒置的培养皿盖中，并铺上一片Parafilm覆盖表面（覆盖面朝上）。
   2. 使用镊子提起并铺设Parafilm，确保无气泡产生，必要时去除多余乙醇。
10. 配制2 mM HS-(CH₂)₁₁-EG₃-OH（EG3）溶液：将5 µL原液稀释至5 mL 100%乙醇中。
    注意：稀释后的EG3溶液可密封后于4 °C保存；未稀释的EG3原液应保存于-20 °C。EG3处理用于使未修饰C18的玻璃区域对细胞无黏附性。
11. 在湿度培养室的Parafilm上，为每块四分之一大小的载玻片滴加40 µL EG3溶液，各液滴之间留出足够间距，以匹配金载玻片的排列间隔。
12. 用镊子将已打印C18图案的金载玻片面朝下放置于液滴上，确保载玻片下无气泡。轻推载玻片使其靠拢，但不要抬起，以减少蒸发。
    注意：先将载玻片一端靠近液滴处放下，再缓慢放下另一端。若出现气泡，应在不抬起载玻片的前提下推动其移动，直至气泡消失。
13. 用Parafilm将培养皿密封严实，并在室温下静置至少3小时。
    注意：如需延长孵育时间，可双重密封培养皿并静置最长24小时。
14. 在生物安全柜中，将金载玻片面朝上放入培养皿，用70%乙醇浸泡并冲洗3次以去除EG3，随后在乙醇中继续浸泡10分钟以完成灭菌。
15. 吸除乙醇，替换为无菌PBS缓冲液。
16. 按照步骤3.9所述方法准备另一个湿度培养室，但使用PBS代替乙醇。
    注意：由于表面张力差异，建议先加入4–5 mL PBS以铺设Parafilm并排除气泡，之后吸除多余液体。
17. 在无菌PBS中配制50 µg/mL纤连蛋白溶液（如需要，也可使用其他蛋白），并为每块四分之一载玻片在Parafilm上滴加50 µL纤连蛋白溶液，各液滴之间留出适当间距。
    注意：纤连蛋白包被有助于细胞在图案化表面的黏附。
18. 使用晶圆镊子将载玻片面朝下放置于液滴上，确保载玻片下无气泡。轻推载玻片使其靠拢，但不要抬起。
    注意：推荐使用直头宽尖的玻璃载玻片镊子或晶圆镊子操作载玻片。
19. 将培养皿置于生物安全柜中静置30分钟。
20. 30分钟后，将金载玻片用PBS冲洗3次，然后面朝上置于PBS中。
    ​注意：纤连蛋白图案化的载玻片可在4 °C的PBS中保存约一个月。

4. 将细胞接种到微图形化载玻片上

1. 将细胞培养基和胰蛋白酶在 37 °C 水浴中预热。
   注意：以下传代培养的描述针对 NIH/3T3 细胞。不同细胞类型的培养条件可能有所不同。
2. （可选）将图案化玻片浸泡于 12 孔板中的培养基中，并在细胞消化前置于培养箱中升温至 37 °C，以促进细胞更好地贴附。
3. 用胰蛋白酶消化细胞，加入含 FBS 的培养基中和，以 100 × g 离心 3 分钟，然后充分混匀重悬于新鲜培养基中。
   注意：确保细胞已完全解离，彼此分开。
4. 计数细胞，调整浓度至 200,000 个细胞/mL，并向每孔中含一片金片的孔加入 0.5 mL 细胞悬液。
5. 轻轻振荡培养板数次以实现均匀接种，随后放入培养箱中孵育 15 分钟，使细胞贴附。
6. 15 分钟后，在显微镜下检查细胞贴附情况；如需要，可延长孵育时间。
   注意：已贴附的细胞会在表面铺展，可见伪足或变扁平，当轻轻敲击或移动培养板时，细胞不会从表面移动。
7. 吸除各孔中含未贴附细胞的培养基，每孔加入 1 mL 新鲜培养基。如需进行药物处理，可在该步骤向培养基中添加相应的试剂。
8. 将细胞在培养箱中继续培养 24 小时，观察汇合度以判断是否形成手性结构。
   ​注意：大多数细胞类型建议汇合度超过 75%；过度汇合可能影响手性特征的观察。

5. 图像采集

1. 细胞达到融合状态后进行固定。
   1. 从孔板中移除培养基，并用 PBS 洗涤一次。
   2. 加入 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
      注意：如果固定过程显著改变细胞形态，建议在固定前进行成像
2. 使用带相机功能的相差显微镜，以高分辨率对载玻片上的每个环进行成像（10x 物镜已足以用于分析）。

6. 细胞手性表征（图2）

1. 从补充文件中下载用于手性表征的 MATLAB 代码文件（补充文件 1）。
   注意：该代码已在 Windows 和 macOS 系统的 MATLAB_R2015b 及更高版本中测试通过。运行这些文件还需要安装圆形统计工具箱，可在参考文献¹⁷中找到。
2. 将代码文件夹及其子文件夹（包含圆形统计工具箱）添加到 MATLAB 路径中，并打开 "ROI_selection.m" 文件。在第 4 行中，将目录更改为所需的数据文件夹（对于 Windows 用户，在第 4 和第 5 行中将 "/" 更改为 "\"）。
3. 在第 14 行中更改图像尺寸，前两个数值表示环的内圆尺寸，后两个数值表示外圆尺寸。
   注意：确保待分析文件夹中所有图像的尺寸完全相同。
4. 点击 运行 按钮，执行 MATLAB 代码 "ROI_selection.m"，以确定相差图像中的感兴趣区域（ROI）。
5. 手动拖动选择框以适配环状结构，然后在图像上双击以确认选择。
6. 对文件夹中的每张图像重复此步骤（确认前一张图像的 ROI 后，下一张图像将自动弹出）；每个图像将生成一个 ".mat" 文件，用于存储该图像的 ROI 信息。
7. 打开 "Analysis_batch.m" 文件，并将文件夹目录更改为与步骤 6.2 相同（对于 Windows 用户，首次使用时，请在第 5、6、124 和 130 行中将 "/" 更改为 "\"）。
8. 点击 运行 按钮，执行代码 "Analysis_batch.m"，以确定多个细胞环状模式的手性。将生成一个 "datatoexcel.txt" 文件，其中包含每个环的圆形统计结果，以及顺时针、非手性和逆时针环的数量。

结果

NIH/3T3 细胞接种后 15 分钟，通过相差成像在视觉上确认了细胞在环形图案上的黏附。经过后续 24 小时的培养，图案上的细胞变得融合且伸长，呈现出明显不对称的排列，偏向顺时针方向（图 2）。通过延时成像记录贴壁细胞的定向迁移，进一步分析视频可量化细胞运动性和形态发生。为进行手性分析，在固定后采集高分辨率相差图像（图 2A-C），并输入 MATLAB 程序。该程序检测强度梯度，并计算细胞在环形结构上的排列方向。随后，基于细胞排列方向相对于环周方向的圆周统计学结果，确定细胞的手性。因此，细胞可被归类为顺时针（CW）、逆时针（CCW）或非手性（NC）（图 2D）。分析结果显示，大多数环形结构表现出显著的顺时针偏向，表明 3T3 细胞具有强烈的顺时针手性。所生成的圆周统计学数据还可提供偏转角度的附加信息，以供进一步分析（图 2E）。

讨论

本文所述的环形图案化实验为多细胞手性的定量表征提供了一种易于使用的工具，能够产生高度可靠且可重复的结果。通过快速生成完全相同的定义微环境并进行无偏分析，可实现大规模样本的自动化高通量处理。本实验方案详细介绍了环形微图案的制备、细胞图案化以及细胞定向排列和方向性运动的自动分析方法。该方法可与活细胞成像技术兼容，用于研究细胞运动性和手性形态发生过程，并有望整合到其他平台中，应用于毒性检测⁹或药物筛选。

还有一些额外的提示需要分享。首先，在微接触印刷步骤中，印章必须制作在玻璃的镀金面（基底切割成小片后可能难以区分），并应避免重复印刷。其次，对于需要其他蛋白质才能正常贴附的细胞，可在步骤 3.17 使用所需的蛋白质。第三，在细胞培养过程中，细胞密度不应过高，且细胞不应在图案上生长至过度融合，否则细胞可能突破内侧边界，使环状结构填充为实心圆。第四，若接种后细胞图案出现断裂或不完整，可能是由于在接触印刷过程中（步骤 3.7–3.8）C18 图案转移不完全所致，应检查 PDMS 印章是否存在缺陷；适当增加印章压印时的力度也可能有所帮助。最后，若细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200 证明乙醇	Koptec	DSP-MD-43
BZX 显微镜系统	Keyence	BZX-600
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高葡萄糖	Gibco	11965092
电子束蒸发仪	Temscal	BJD-1800	金-钛薄膜涂层
胎牛血清	VWR	89510-186
牛血浆来源纤连蛋白	Sigma	F1141-5MG
玻璃显微镜载玻片	VWR	10024-048
玻璃镊子	Exelta	390BSAPI
金蒸发颗粒	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH（EG3）	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 细胞	ATCC	CRL-1658
OAI 接触式光刻对准仪	OAI	200	紫外光刻
十八烷硫醇（C18）	Sigma	O1858-25ML
旋转摇床	VWR	89032-088
磷酸盐缓冲液（PBS）	Research product international	P32080-100T
聚二甲基硅氧烷 Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
硅晶圆	University Wafer	ID#809
丙酮酸钠	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 光刻胶	MicroChem	Y311075 0500L1GL
钛蒸发颗粒	International Advanced Materials	TI14
透明掩模（带特征图案）	Outputicity.com	N/A	掩模打印服务
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Thermo fisher scientific	25200-072