神经干细胞激活状态的分类 体外 利用自发荧光

摘要

本方案描述了通过自发荧光成像技术鉴定并富集原代成年小鼠神经干细胞培养物中特定细胞状态的策略，所用方法包括：i）共聚焦显微镜，ii）荧光激活细胞分选仪进行强度成像，或 iii）多光子显微镜进行荧光寿命成像。

摘要

神经干细胞（NSCs）通过一种称为成年神经发生的过程，在成年大脑中分裂并产生新生神经元。成年神经干细胞主要处于静息状态，这是一种可逆的细胞状态，细胞已退出细胞周期（G0期），但仍能对环境刺激作出响应。在成年神经发生的第一个步骤中，静息态神经干细胞（qNSCs）接收到信号并被激活，退出静息状态并重新进入细胞周期。因此，理解调控神经干细胞静息状态及其退出机制的因子，对于未来靶向成年神经发生策略的制定至关重要。然而，目前对神经干细胞静息状态的理解受到技术限制，尤其是在识别静息态神经干细胞（qNSCs）和激活态神经干细胞（aNSCs）方面存在困难。本实验方案描述了一种新的方法，用于识别和富集在成年海马体中生成的qNSCs和aNSCs 体外 通过成像神经干细胞（NSC）的自发荧光来鉴定细胞培养物。首先，本方案描述了如何利用共聚焦显微镜识别静息态神经干细胞（qNSC）和激活态神经干细胞（aNSC）的自发荧光标志物，并根据自发荧光强度对NSC的激活状态进行分类。其次，本方案描述了如何利用荧光激活细胞分选仪（FACS）基于自发荧光强度对NSC的激活状态进行分类，并富集qNSC或aNSC样品。第三，本方案描述了如何利用多光子显微镜在单细胞分辨率下进行荧光寿命成像（FLIM），对NSC激活状态进行分类，并结合自发荧光强度动态追踪静息态退出过程。 以及荧光寿命。因此，本方案提供了一种可用于研究神经干细胞静息状态及静息退出的活细胞、免标记、单细胞分辨率工具包。

引言

在许多生物体中，神经干细胞（NSCs）终生持续产生新生神经元，这一过程被称为成年神经发生^1,2。为了生成新生神经元，静息态神经干细胞（qNSC）首先必须被激活，进入细胞周期以 扩增细胞群体 并产生神经前体细胞^3,4,5,6。尽管目前对NSC静息状态已有较多了解，但由于技术上的局限性，我们仍难以全面鉴定驱动和调控NSC静息状态的关键因子及其从静息向激活转变的过程，这些局限性主要体现在qNSC的分离与识别方面。自发荧光成像技术此前已成功用于研究多种不同类型细胞（如小胶质细胞和T细胞）的细胞状态变化，其原理是通过解析代谢重塑过程，进而检测影响内源性荧光代谢辅因子（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]和黄素腺嘌呤二核苷酸[FAD]）光学特性的变化^7,8。当NSC退出静息状态时，其代谢网络会发生显著重塑^9,10<....

方案

本方案中的所有操作均经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 使用共聚焦显微镜成像qNSC和aNSC中的PAF以鉴定NSC细胞状态

1. 生成qNSCs和aNSCs 体外 来自原代NSC培养物。
   1. 在增殖培养基中培养从小鼠成年脑组织分离纯化的神经干细胞以进行扩增（表1)^18,20,21因此，默认情况下， 体外 NSC 培养物为 aNSCs。
   2. 为获得静息态神经干细胞（qNSCs），请按照以下方案将活化态神经干细胞（aNSCs）接种至包被的玻璃器皿中，随后使用qNSC培养基处理，诱导其进入静息状态，持续3天。
   3. 准备折射率适合油浸物镜的玻璃器皿，用于通过包被法黏附神经干细胞（NSCs）。首先使用聚-L-鸟氨酸（PLO；塑料器皿使用10 mg/mL水溶液，玻璃器皿使用50 mg/mL水溶液），加入足量溶液覆盖培养皿底部（对于直径1 cm的培养皿² 成像比色皿孔，使用约150 µL，在37 °C下孵育1小时₂O.
   4. 移除....

结果

共聚焦自发荧光成像用于区分神经干细胞状态图1)
利用共聚焦显微镜分析神经干细胞的激活状态，分别生成静息态神经干细胞（qNSCs）和激活态神经干细胞（aNSCs） 体外 使用激活培养基或静息培养基，具体如前所述^10,13,17,18为了检测神经干细胞（NSCs）中的PAF，使用共聚焦显微镜对活体静息态神经干细胞（qNSCs）和活体激活态神经干细胞（aNSCs）在相同曝光条件下进行成像（激发波长：405 nm，发射波长：580–620 nm）。结果显示，qNSCs中的PAF数量较aNSCs更多（图1A,B这一发现说明了自发荧光特性可作为标记物用于识别静息态神经干细胞（qNSCs.......

讨论

本方案描述了一种活细胞、无标记、非破坏性、单细胞分辨率的技术，可通过成像神经干细胞（NSC）中的自发荧光信号，在体外对NSC细胞状态进行分类。in vitro。该方法可检测NSC从静息状态退出过程中发生的代谢变化，这些变化会影响代谢辅因子（如NAD(P)H）的光学特性，在研究NSC静息状态方面相较于现有技术具有诸多优势。例如，许多用于研究静息态NSC（qNSC）和活化态NSC（aNSC）的传统技术（如使用EdU等细胞周期标记物进行标记）均需要对样本进行固定。而目前可用于研究活体NSC的方法则通常受限于需引入外源性标记，通常通过构建表达荧光蛋白的转基因来实现。这些工具不仅在构建所需资源方面存在限制，还伴随多种技术上的局限性。例如，中间丝蛋白巢蛋白（nestin）和胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）常被用作qNSC和aNSC的标志物^12,13,18,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40倍水镜物镜	Nikon	MRD77410	第3部分中多光子显微镜所用的物镜
8孔比色皿	Ibidi	80826-90	用于成像活化型神经干细胞/静息型神经干细胞（aNSCs/qNSCs）
模拟功率计	Thorlabs	PM100A	第3部分中多光子显微镜所用设备
抗生素-抗真菌素（100倍浓度）（PSF）	Thermo Fisher	15240062	神经干细胞培养基用抗生素
B-27	Invitrogen	17504044	神经干细胞培养基的营养补充剂
BMP4	Fisher Scientific	5020BP010	诱导细胞进入静息状态的因子
牛血清白蛋白	Sigma	A4919-25G	用于配制BMP4溶液
Chameleon超快激光器	Coherent	N/A	第3部分中多光子显微镜所用激光器
共聚焦显微镜	Nikon	C2	第1部分所用显微镜
DMEM/F-12（不含GlutaMAX）	Invitrogen	11320033	神经干细胞培养基的基础培养液
DNase	Sigma	D5025-15KU	添加至胰蛋白酶抑制剂中
EdU检测试剂盒	Invitrogen	C10337	细胞培养增殖检测用
EGF	PeproTech	AF-100-15-500UG	神经干细胞培养基的生长因子
FGF	PeproTech	100-18B	神经干细胞培养基的生长因子
荧光激活细胞分选仪	BD	FACSAria	第2部分所用的荧光激活细胞分选仪
肝素	Sigma	H3149-50KU	神经干细胞培养基的添加剂
L-15	Invitrogen	21083027	用于配制胰蛋白酶抑制剂溶液
层粘连蛋白	Sigma	L2020-1MG	用于玻璃器皿包被
Nikon TiE倒置显微镜	Nikon	N/A	第3部分所用显微镜主体框架
多聚赖氨酸（PLO）	Sigma	P3655-100MG	用于玻璃器皿包被
SPC-150单光子计数电子系统	Becker and Hickl	N/A	第3部分中多光子显微镜所用设备
胰蛋白酶（用于消化以球状或单层形式生长的aNSC细胞团）	Gibco	15090046	用于消化神经球或贴壁生长的活化型神经干细胞（aNSCs）
胰蛋白酶（用于消化qNSCs）	Gibco	25200072	用于消化贴壁生长的静息型神经干细胞（qNSCs）
胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522-100MG	用于终止aNSCs的胰蛋白酶消化反应
尿素晶体	Sigma	U5128-5G	用于采集红外响应函数（IRF）
Versene	Thermo Fisher	15040066	用于配制胰蛋白酶溶液