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神经干细胞激活状态的分类 体外 利用自发荧光

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DOI：

10.3791/63110

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2024年4月12日

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1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

本方案描述了通过自发荧光成像技术鉴定并富集原代成年小鼠神经干细胞培养物中特定细胞状态的策略，所用方法包括：i）共聚焦显微镜，ii）荧光激活细胞分选仪进行强度成像，或 iii）多光子显微镜进行荧光寿命成像。

摘要

神经干细胞（NSCs）通过一种称为成年神经发生的过程，在成年大脑中分裂并产生新生神经元。成年神经干细胞主要处于静息状态，这是一种可逆的细胞状态，细胞已退出细胞周期（G0期），但仍能对环境刺激作出响应。在成年神经发生的第一个步骤中，静息态神经干细胞（qNSCs）接收到信号并被激活，退出静息状态并重新进入细胞周期。因此，理解调控神经干细胞静息状态及其退出机制的因子，对于未来靶向成年神经发生策略的制定至关重要。然而，目前对神经干细胞静息状态的理解受到技术限制，尤其是在识别静息态神经干细胞（qNSCs）和激活态神经干细胞（aNSCs）方面存在困难。本实验方案描述了一种新的方法，用于识别和富集在成年海马体中生成的qNSCs和aNSCs 体外 通过成像神经干细胞（NSC）的自发荧光来鉴定细胞培养物。首先，本方案描述了如何利用共聚焦显微镜识别静息态神经干细胞（qNSC）和激活态神经干细胞（aNSC）的自发荧光标志物，并根据自发荧光强度对NSC的激活状态进行分类。其次，本方案描述了如何利用荧光激活细胞分选仪（FACS）基于自发荧光强度对NSC的激活状态进行分类，并富集qNSC或aNSC样品。第三，本方案描述了如何利用多光子显微镜在单细胞分辨率下进行荧光寿命成像（FLIM），对NSC激活状态进行分类，并结合自发荧光强度动态追踪静息态退出过程。 以及荧光寿命。因此，本方案提供了一种可用于研究神经干细胞静息状态及静息退出的活细胞、免标记、单细胞分辨率工具包。

引言

在许多生物体中，神经干细胞（NSCs）终生持续产生新生神经元，这一过程被称为成年神经发生1,2。为了生成新生神经元，静息态神经干细胞（qNSC）首先必须被激活，进入细胞周期以 扩增细胞群体 并产生神经前体细胞3,4,5,6。尽管目前对NSC静息状态已有较多了解，但由于技术上的局限性，我们仍难以全面鉴定驱动和调控NSC静息状态的关键因子及其从静息向激活转变的过程，这些局限性主要体现在qNSC的分离与识别方面。自发荧光成像技术此前已成功用于研究多种不同类型细胞（如小胶质细胞和T细胞）的细胞状态变化，其原理是通过解析代谢重塑过程，进而检测影响内源性荧光代谢辅因子（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]和黄素腺嘌呤二核苷酸[FAD]）光学特性的变化7,8。当NSC退出静息状态时，其代谢网络会发生显著重塑9,10,11,12,13,14。因此，为利用这一特性，近期研究已采用NSC的自发荧光来识别并富集处于不同激活状态的NSC，通过检测伴随静息退出过程中代谢重塑所引起的自发荧光信号变化实现区分15。自发荧光成像具有多项技术优势：i）无需引入外源性标记物，避免干扰细胞行为；ii）可提供高分辨率的单细胞水平NSC激活状态数据；iii）无需破坏细胞7,16。本实验方案概述了三种利用NSC自发荧光研究其静息态与激活态的策略15。

近期研究发现，从6周龄雄性小鼠海马齿状回颗粒下区分离的神经干细胞（NSCs），在体外培养并可逆地进入静息状态后in vitro10,13,17,18,19,20,21，表现出显著升高的点状自发荧光（PAF）水平，其激发波长范围为400–600 nm，发射波长范围为500–700 nm。该信号在静息态神经干细胞（qNSCs）中特异性存在，而在激活并进入细胞周期的NSCs中则不明显15。无需使用额外的抗体标记或报告基因，仅通过视觉即可区分这两种细胞群体，这一特性对于研究qNSCs的本质及其退出静息状态的机制具有重要意义。因此，本实验方案首先描述了利用共聚焦显微镜对qNSCs中的PAF进行成像的策略，可用于识别 NSC的激活状态；其次，本方案还介绍了利用荧光激活细胞分选技术（FACS）检测PAF信号的方法，并进一步阐述如何基于该信号进行分选，以富集qNSCs或aNSCs。这些方法提供了一种依据细胞状态对NSCs进行聚类和分离的有效手段。

为了开发一种更高分辨率的方法，不仅能够区分神经干细胞（NSCs）的不同状态，还能识别其从静息状态退出并向完全激活过渡的动态过程，本研究采用多光子显微镜进行荧光寿命成像（FLIM），同时检测NAD(P)H（称为通道1）的自发荧光和绿色自发荧光（称为通道2；该通道可检测FAD自发荧光以及静息态NSCs中的PAF）的寿命及其强度。该方法基于细胞内分子的光学特性依赖于其物理特性的原理16,22。例如，NAD(P)（NAD与NADP在光学上无法区分，因此使用NAD(P)指代两者）在氧化状态下不具有自发荧光，而在还原状态（NAD(P)H）下则具有自发荧光23。此外，通过荧光寿命成像还可推断出自发荧光分子的其他物理特性，例如其与酶的结合状态7,22,24。例如，当NAD(P)H未与酶结合时，其荧光寿命较短22。由于像NAD(P)H这类参与数百种代谢反应的自发荧光分子在不同状态或不同细胞行为的细胞中使用方式不同，因此可通过检测自发荧光寿命的多光子显微镜来识别并量化这些变化23。结合自发荧光的丰度（即强度）信息，这些测量可提供多维度的数据，用于将NSCs划分为不同的细胞状态，并解析其在状态之间的动态转变过程。第三，本方案详细描述了如何利用多光子显微镜对通道1（NAD(P)H）和通道2（PAF）信号进行FLIM及强度测量的操作、分析与解读。综上所述，本方案介绍了一套适用于活细胞、无需标记的工具，可用于研究NSC的静息状态，并提供关于 NSC状态的高分辨率单细胞数据。

方案

本方案中的所有操作均经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 使用共聚焦显微镜成像qNSC和aNSC中的PAF以鉴定NSC细胞状态

  1. 生成qNSCs和aNSCs 体外 来自原代NSC培养物。
    1. 在增殖培养基中培养从小鼠成年脑组织分离纯化的神经干细胞以进行扩增（表1)18,20,21因此，默认情况下， 体外 NSC 培养物为 aNSCs。
    2. 为获得静息态神经干细胞（qNSCs），请按照以下方案将活化态神经干细胞（aNSCs）接种至包被的玻璃器皿中，随后使用qNSC培养基处理，诱导其进入静息状态，持续3天。
    3. 准备折射率适合油浸物镜的玻璃器皿，用于通过包被法黏附神经干细胞（NSCs）。首先使用聚-L-鸟氨酸（PLO；塑料器皿使用10 mg/mL水溶液，玻璃器皿使用50 mg/mL水溶液），加入足量溶液覆盖培养皿底部（对于直径1 cm的培养皿2 成像比色皿孔，使用约150 µL，在37 °C下孵育1小时2O.
    4. 移除PLO溶液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。
    5. 用足够的层粘连蛋白溶液（5 mg/mL）包被培养皿底部（对于直径1 cm的培养皿）2 成像比色皿孔，使用约150 µL PBS，于37 °C孵育至少3小时，或过夜。
    6. 移除层粘连蛋白溶液，然后加入足以覆盖培养皿底部的培养基（对于直径1 cm的培养皿）2 成像比色皿孔，使用约150 µL。
    7. 通过在 120 x g 条件下离心 aNSCs（可起始于单层细胞或神经球）来准备细胞进行胰蛋白酶消化 g 室温（RT，约 25 °C）下孵育 4 分钟。
    8. 将上一步获得的aNSC细胞沉淀用100 µL胰蛋白酶混合液在37 °C消化5分钟，随后加入200 µL胰蛋白酶抑制剂混合液终止消化表1).
    9. 让神经干细胞静置 2 min，然后通过移液上下吹打 10 次进行机械性吹打分散。
    10. 加入5 mL aNSC培养基，以120 x g离心细胞 g 4 分钟。
    11. 将神经干细胞（NSCs）重悬于1 mL aNSC培养基中，并以10%-20%的汇合度将细胞接种至aNSC培养基中。例如，将约5,000个细胞接种至1 cm培养皿的一个孔中2 使用150 µL培养基对成像比色皿孔进行加样。
    12. 在让aNSCs贴壁24小时后，移除aNSC培养基，并加入足以覆盖培养皿底部的qNSC培养基（对于直径1 cm的培养皿2 成像比色皿孔，使用约150 µL； 表1- 如先前所述10,13,17,18在将诱导静息状态的孔中。
    13. 每2天至少更换一次aNSC和qNSC培养基。神经干细胞在qNSC培养基中培养3天后进入静息状态，可用于成像实验。
  2. 使用共聚焦显微镜对活体qNSCs和aNSCs进行成像 体外.
    注意：每台显微镜均有其专有软件，因此请参照本步骤执行相应的操作以配置特定显微镜。本方案将提供在 NIS-Elements 中操作的指导说明。
    1. 配置共聚焦显微镜以进行自发荧光成像。
      1. 点击 405 激光器，以及在发射窗口内的类型 405 激光器 菜单。点击 TD 采集透射光图像并设置 HV 用于可视化样品的值。
      2. 设置 激光功率 至 3.5% 和 增益 至 75。设定 缩放 2. 设置共聚焦扫描参数，设定 像素驻留时间 至 0.5，并设置 分辨率 2048 × 2048 像素
    2. 使用明场在约60倍油镜下将细胞调至焦点。
    3. 点击切换至共聚焦扫描模式 眼部端口，确保光路现在通向扫描头，并且光路中没有滤光立方体。
    4. PAF 在 qNSCs 中富集，具有广泛的可兴奋性和可释放性（参见 图1）。根据系统的功能选择最佳的光学配置 图1 作为参考。为获得最强且最清晰的信号，使用波长约为400-500 nm的激光激发，收集波长约为580-620 nm的发射光，并采用约60倍油浸物镜。
      注意：与常规成像实验相比，自发荧光成像需要更高的激光功率来激发。若将PAF与其他自发荧光分子或其他标记物同时成像，需仔细设计光学配置，以避免信号串扰至自发荧光通道。
    5. 获取qNSCs和aNSCs中自发荧光的图像。点击 扫描，然后聚焦图像，再点击 捕获为获得最佳图像，应采集细胞质（根据在整个细胞内弥散分布的较弱自发荧光判断）处于焦平面的单层图像，以获取每个细胞的代表性横截面。
    6. 若需直接比较不同图像，请在同一天使用相同的光学配置（例如相同的激光功率）对样本进行成像。
    7. 激光器和探测器的具体功率取决于各个系统。首先使用低激光功率，然后缓慢增加功率，直至信号可被检测到且未达到饱和。
  3. 在活体qNSCs和aNSCs中分析PAF 体外.
    1. 在获取qNSCs或aNSCs的自发荧光图像后，使用ImageJ打开文件对图像进行定量分析25.
    2. 使用该选项 过程 > 滤光片 > 高斯模糊 （Sigma：2）应用于qNSC/aNSC自发荧光图像，以平滑不均匀的像素。
    3. 使用 图像 > 调节 > 阈值 选择代表PAF的像素（消除背景像素）并单击 应用对所有需直接比较的图像使用相同的阈值参数。
    4. 使用 过程 > 二元的 > 分水岭 分离空间位置相近的PAF。
    5. 使用计算机鼠标，在细胞周围绘制一个感兴趣区域（ROI），该区域可根据明场图像或细胞胞质内均匀分布的弥散性自发荧光来确定。
      注意：通常可以排除细小的周边突起并包含细胞核，因为这些区域通常不存在自发荧光，因此不会干扰分析。
    6. 使用 分析 > 分析颗粒 （大小：0.1 至无穷 µm；圆形度：0–1），并勾选“汇总”。
      注意：ImageJ 随后将生成一个输出窗口，显示感兴趣区域中颗粒的数据，可用于统计每个细胞中 PAF 的数量。其他荧光分子可与 PAF 成像联合使用。但由于 PAF 信号相对较弱，必须验证其他荧光染料不会渗漏到 PAF 通道中。通常，吸收波长在 600 nm 以上、发射波长在 650 nm 以上的荧光染料可与 PAF 成像配合使用，例如 LipidSpot 610。

2. 利用FACS基于自发荧光富集培养的NSC中处于激活状态的NSC

  1. 按照第1节所述方法生成qNSCs和aNSCs。
  2. 根据自发荧光对活qNSCs和aNSCs的混合物进行分选。
    注意：作为示例，本方案将讨论如何在由qNSCs和aNSCs以1:1比例混合生成的样本中富集aNSCs或qNSCs。
    1. 在胰酶消化和细胞分选前，通过向细胞培养基中加入10 µM 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU；一种胸苷类似物，可掺入正在合成DNA的细胞中，例如细胞周期S期的细胞）孵育1小时，标记处于S期的细胞。
    2. 按照步骤1.1.8所述方法对qNSCs和aNSCs进行胰酶消化，重悬于0.5 mL FACS缓冲液（表1）中，然后置于冰上。
      注意：qNSCs对培养皿的黏附性较强。当细胞密度相对较高时，可通过机械方式将qNSCs从培养皿上解离。然而，若qNSCs密度较低或通过移液器机械吹打难以从培养皿上移除，则应使用胰酶将其从培养皿上消化下来。
      1. 移除qNSCs的培养基，加入足量0.25%胰酶以覆盖培养皿底部（对于1 cm2的成像比色皿孔，使用约150 µL），在37 °C孵育3分钟。
      2. 孵育结束后，加入与所加胰酶等体积的对应细胞类型的培养基以终止胰酶反应。在收集和离心前，通过机械方式将细胞从培养皿上解离。
    3. 使用约130 µm喷嘴，基于仪器能力设置光学条件，利用流式细胞仪或FACS分析qNSCs和aNSCs，并检测PAF，如图1所示。例如，使用405 nm激光激发样本，采用580–620 nm滤光片进行检测。
    4. 在数据文件中至少收集10,000个单细胞态的qNSCs和aNSCs，然后利用这些数据设定门控策略以富集qNSCs或aNSCs。例如，在aNSC:qNSC（1:1）混合样本中，根据自发荧光强度设定门控以收集荧光最强或最弱的前25%或后25%的NSCs。
    5. 在设定门控以分选自发荧光较强或较弱的单细胞态细胞后，将细胞分选至预先涂有PLO和层粘连蛋白、并加入aNSC培养基的孔中（10,000个细胞/cm2，参见步骤1.1.3）。
    6. FACS分选后，将NSCs在培养箱中静置3小时。使用足量4%多聚甲醛覆盖培养皿底部（对于1 cm2的成像比色皿孔，使用约150 µL），在室温下固定15分钟。
      注意：为可视化细胞中的EdU，最简便的方法是使用市售的EdU检测试剂盒，并遵循制造商推荐的操作流程。
    7. 首先，在室温下用含0.25% Triton的PBS处理细胞15分钟，进行细胞通透。
    8. 接着，在室温下用EdU染色液处理细胞30分钟。
      注意：EdU染色液的具体组分可能因试剂来源不同而有所差异，但大致包括反应缓冲液、反应缓冲液添加剂、硫酸铜以及修饰有炔基或叠氮基的分子。推荐试剂盒详见材料表。
    9. 完成EdU染色后，用PBS洗涤样本3次，每次10分钟。

3. 使用多光子显微镜检测通道1和通道2的自发荧光并对神经干细胞进行荧光寿命成像 体外 识别神经干细胞细胞状态群体及其转变

注意：每台显微镜都有其专有的软件；因此，请参照这些步骤执行相应的操作，以配置特定的显微镜。本方案将提供在 Prairie View 中操作的说明。

  1. 按照第1节所述方法生成qNSCs和aNSCs。
  2. 设置多光子显微镜以进行荧光寿命成像。
    1. 使用40倍或更高放大倍数的物镜（约1.15 NA）。
    2. 使用具备以下或同等组件的多光子显微镜：可调谐超快激光器、720 nm 长通二向色镜、砷化镓磷化物（GaAsP）光电倍增管（PMT）、时间相关单光子计数电子系统以及模拟功率计。
    3. 成像通道1时，将可调谐激光器设置为750 nm，并使用440/80 nm发射滤光片组；成像通道2时，将激光器设置为890 nm，并使用550/100 nm发射滤光片组。
      注意：在打开光电倍增管（PMT）之前，请关闭室内灯光。
  3. 仪器响应函数
    1. 通过成像压碎的尿素晶体来获取仪器响应函数（IRF），以校正测量衰减过程中仪器的时间响应。
      注意：IRF 需与衰减曲线进行卷积，以准确计算衰减拟合曲线。采集时，激光波长设为 890 nm，使用 440/80 nm 发射滤光片组。GaAsP 光电倍增管（PMT）增益设为 800，泡克耳斯盒（激光功率）初始值设为极低，通常为 1。
    2. 选择一个含有尿素结晶的视野，并略微增加普克尔斯盒电压（最高不超过15）。
    3. 接下来，使用与细胞成像相同的参数获取图像：恒定分数鉴别器（CFD）1 × 104 - 1 × 105，256 × 256 分辨率，驻留时间设为 4.8 µs，光学放大倍数设为 1.5 倍，积分时间为 60 s。
  4. 对活体qNSCs和aNSCs进行通道1和通道2自发荧光的荧光寿命成像与强度成像 体外
    1. 找到成像视野：使用目镜寻找合适的视野，并将显微镜的光路切换至样品位置，以进行成像。
      注意：将首先采集通道1的图像，然后采集同一视野下通道2的图像。
    2. 通道1图像采集设置：单击 功率/增益 选项卡并将PMT增益设为800，点击 2-P激光 标签并选择 750 nm 对于激光器，确保使用正确的滤光立方体（440/80 nm）。
    3. 采集通道1图像。
      1. 开始 预览 模式，前往 功率/增益 标签和设置 Pockels 30，然后前往 扫描 该屏幕区域并点击 活体扫描.
      2. 增加 Pockels 在低激光功率（低于3.6 mW）下找到合适的视野。找到视野后，调节 Pockels 使功率计在Pockels盒后的功率读数约为3.6 mW，且恒定分数甄别器（CFD）处于 计数率 标签尺寸为 1 x 104 - 1 × 105.
    4. 前往 扫描 部分并点击 单次扫描 一旦满足这些参数，将对通道1进行60秒的图像采集。
    5. 要采集第二通道图像，请单击 2-P激光 标签并选择 890 nm 对于激光器，将滤光立方体更换为通道2发射滤光立方体（550/100 nm）。
    6. 按照3.4.3节所述启动预览模式，增加 Pockels 直到功率计读数约为 7 mW，且 CFD 计数再次达到 1 × 104 -1 × 105.
    7. 前往 扫描 部分并点击 单次扫描 一旦满足这些参数，将对通道2进行60秒的图像采集。
    8. 采集更多图像——在获取通道1和通道2的图像后，选择新的视野，重复步骤3.4.2至3.4.4。通常情况下，每个实验条件采集4–6个视野，以成像约50–100个细胞即已足够。
      注意：mCherry 可用作额外的荧光标记，不会渗入通道1和通道2。
  5. 分析荧光寿命图像。
    1. 按照步骤 3.5.2–3.1.14，在 SPCImage 中生成荧光寿命图像的衰减矩阵。
      注意：欲了解更多信息，请查阅网上免费提供的最新版手册26.
    2. 打开 SPCImage 软件，并载入第 3.3 节中采集的 IRF FLIM 图像。
    3. 调整直方图中的垂直黑色条，使其范围限制在IRF衰减曲线内。从顶部菜单栏中，点击 IRF > 复制到剪贴板.
    4. 在第3.4节获得的数据集中打开一个待分析的FLIM图像文件。
    5. 从顶部菜单栏中，单击 IRF > 粘贴自剪贴板.
    6. 在软件的右下角，设置 组件 至 2.
    7. 在软件顶部菜单栏中，单击 选项 > 模型然后选择 MLE 用于 拟合方法，空间分箱 至 方形，阈值 至 峰值，以及在……之下 设置，选择 多指数衰减.
    8. 在软件的左下角，增加 箱 直到激发后光子计数达到峰值时，代表性细胞质像素中的光子计数至少为100。
    9. 在软件的左下角，设置 阈值。对于通道1，使用阈值 "50"对于通道2，使用阈值 "0."
    10. 在软件顶部菜单栏中（本方案描述的是如何操作 8.3 版本），单击 计算 > 衰变矩阵.
      注意：确保 Chi2 图像中各处的值约为0.8–1.2，这通过验证双指数衰减模型，证实了数据的稳健性。
    11. 在顶部菜单栏中，单击 文件 > 保存.
    12. 在软件顶部菜单栏中，单击 文件 > 导出，并导出以下内容：
      颜色编码值，T1，T2，Chi2，像素强度，A1[%]，A2[%] 和彩色编码图像（含图例）
      注意：现在 SPCImage 已设置为执行批量处理，分析指定通道的所有图像（先共同分析通道 1 的 FLIM 图像，然后从步骤 3.5.2 开始重复操作以分析通道 2 的 FLIM 图像）。
    13. 要执行批量处理，请点击 计算 > 批量处理 并选择要处理的FLIM图像。
    14. 在顶部菜单栏中，单击 文件 > 导出 > 批量导出 并选择要导出的衰变矩阵（在上一步中生成）。
    15. 使用 CellProfiler 按照步骤 3.5.16–3.5.24 创建细胞质掩膜。
      注意：为此，需在通道1强度图像上手动圈定细胞核，其中细胞核呈黑色且清晰可见。然后使用CellProfiler流程 manual_segmentation.cpproj27 (补充文件 1将根据核掩膜的指引，自动生成全细胞和细胞质掩膜。也可使用mCherry对细胞核进行标记，并与通道1和通道2的自发荧光同时成像，以实现细胞核识别的自动化。然而，许多常规的细胞核染料会在光谱上渗入自发荧光通道，因此与该技术不兼容。
    16. 在 R Studio 中，使用 R_ASCtoTIFF.rmd27 (补充文件 2) 以转化 X_photons.asc 文件，其中 X 是通道 1 图像集获取的图像名称，保存为 TIF 文件。
    17. 打开 Cell Profiler 并打开 manual_segmentation.cpproj.
    18. 载入第3.5.16步生成的通道1光子TIF文件 图像 管道顶部的步骤。
    19. 在标题为“流程”的底部3个步骤中 保存图像，为 CellProfiler 将生成的掩膜设置保存路径。
    20. 点击 开始测试模式 位于 CellProfiler 左下角。
    21. 点击 运行 位于 CellProfiler 左下角。当 CellProfiler 执行到该步骤时 手动识别对象 步骤，将弹出一个窗口，显示当前正在处理的通道1图像。
    22. 点击 F 按住键盘上的键，同时按住鼠标左键并手动绘制一个细胞核的轮廓。绘制完细胞核后，松开鼠标左键。对图像中的所有细胞重复此步骤。
    23. 点击 完成 在弹出窗口右下角的强度图像处。软件现在将完成整个流程，并导出细胞质、细胞核及全细胞的掩膜。
    24. 在左下角，单击 下一组图像 并对所有通道1的TIF图像重复步骤3.5.21–3.5.23。
    25. 使用 R 脚本（Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd），整合步骤 3.5.2–3.5.14 中生成的衰减矩阵与步骤 3.5.15–3.5.24 中生成的细胞质掩膜，按照步骤 3.5.26–3.5.30 获取每个细胞细胞质的平均荧光寿命成像参数
    26. 使用电子表格软件（例如 Microsoft Excel），创建一个名为 测试键27 [补充文件 3] 以3列为例）
    27. 将各列命名为 文件夹，NADH，以及 FAD填写表格以列出 文件夹位置 在 文件夹，然后图像标题前缀在 NADH 和 FAD，分别用于将每个通道1图像与每个通道2图像进行关联（参见示例数据 - 表2).
  6. 在 R Studio 中，打开 整合衰减矩阵与细胞质掩膜.rmd27(补充文件 4).
    1. 设置脚本中注明的以下文件路径：工作目录、通道1文件位置、FAD文件位置、掩膜文件位置，以及输出文件位置和名称。
    2. 运行整个脚本。脚本成功完成后，将生成一个输出文件，包含元数据和平均FLIM变量。
    3. 使用以下方法进行分析 自发荧光FLIM数据.rmd27 (补充文件 5）或使用其他任何分析软件。

结果

共聚焦自发荧光成像用于区分神经干细胞状态图1)
利用共聚焦显微镜分析神经干细胞的激活状态，分别生成静息态神经干细胞（qNSCs）和激活态神经干细胞（aNSCs） 体外 使用激活培养基或静息培养基，具体如前所述10,13,17,18为了检测NSCs中的PAF，使用共聚焦显微镜对活体qNSCs和aNSCs进行成像（激发波长：405 nm，发射波长：580–620 nm），成像条件保持一致。qNSCs中PAF的数量较aNSCs更高（图1A,B这一发现说明了如何利用自发荧光特性作为标记物来鉴定静息态神经干细胞（qNSCs）和活化态神经干细胞（aNSCs）的细胞状态。

利用自发荧光通过FACS富集NSC细胞状态图2)
为了富集 使用FACS分析细胞周期状态，生成qNSCs和aNSCs 体外10,13,17,18,19 如本方案所述，在实验前1小时预先用EdU标记 胰蛋白酶消化后通过流式细胞仪分析以标记进入S期的细胞。随后，通过流式细胞术分别或按1个静息态神经干细胞（qNSC）:1个活化态神经干细胞（aNSC）的比例混合后分析qNSCs和aNSCs。图2）。根据混合细胞群中的aNSCs或qNSCs特征设定门控，进而富集目标细胞，并依据门控进行细胞分选。FACS分选后，将各样本中的细胞接种于多聚赖氨酸-层粘连蛋白包被的玻璃器皿上，使其贴壁3小时，随后固定、染色并分析EdU阳性细胞百分比。结果如预期，来自高自发荧光门控的分选细胞EdU阳性率低于混合样本，而来自低自发荧光门控的分选细胞增殖活性高于混合样本（图2C）。这一发现证实了富集的能力 利用流式细胞术（FACS）从静止态神经干细胞（qNSCs）与活化态神经干细胞（aNSCs）的异质性混合物中分选神经干细胞的活化状态。

多光子荧光寿命成像用于分类神经干细胞状态图3)
qNSCs 和 aNSCs 被生成 体外 然后使用多光子显微镜对通道1的自发荧光（激发：750 nm（双光子），发射：360–520 nm）和通道2（激发：890 nm（双光子），发射：450–650 nm）进行荧光寿命成像（FLIM）图3A，表2）。静息态神经干细胞（qNSCs）和激活态神经干细胞（aNSCs）表现出显著不同的自发荧光特征。例如，qNSCs在通道1的荧光平均寿命更高 τm，但较低的 α1 与aNSCs相比。为了评估NSC FLIM自发荧光数据预测NSC活化状态的能力，采用通道1强度建立了一个逻辑回归模型， α1, τ1, τ2 以及通道2的强度， α1, τ1, τ2. 受试者工作特征曲线表明，这些数据足以构建一个接近完美的模型（曲线下面积 = 0.963），可准确预测神经干细胞的激活状态。综上所述，这些结果展示了荧光寿命成像显微术（FLIM）与自发荧光在对神经干细胞状态进行分类中的应用潜力。

figure-results-1
图 1：共聚焦成像可分辨神经干细胞活化状态的自发荧光生物标志物。（A-B）使用共聚焦显微镜在相同曝光条件下对静息态神经干细胞（qNSCs，紫色）和活化态神经干细胞（aNSCs，黑色）进行成像（红色；激发波长 405 nm，发射波长 580–620 nm），并分析 PAF 数量（N = 3，Mann-Whitney 检验，均值 ± 标准差）。白色虚线表示细胞边界，蓝色虚线表示细胞核。（C）对同一个 qNSC 在不同激发和发射条件下进行自发荧光成像，具体条件如图所示，激光功率和增益保持一致。比例尺：10 µm。**** p < 0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2FACS 可用于富集 NSC 激活状态 (A-C) 静息态神经干细胞（qNSCs）、活化态神经干细胞（aNSCs）或 qNSCs：aNSCs 混合物（1:1）用 EdU 处理 1 小时，经胰蛋白酶消化后， 然后通过流式细胞术分析（激发波长：405 nm，发射波长：580–620 nm）。将细胞以1:1比例混合后，通过FACS分选具有低或高自发荧光的细胞，接种培养， 通过检测EdU+细胞百分比来分析增殖情况。任意单位缩写为 "A.U." （N = 4，双因素方差分析，事后Tukey检验，均值） ± SD）。**** p < 0.0001. 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：多光子荧光寿命成像揭示NSC激活状态的生物标志物。 （A）对获取的荧光寿命成像数据进行曲线拟合分析的示意图。（B）通道1和通道2的荧光寿命成像测量结果，包括静息态NSC（紫色）和激活态NSC（黑色）的数据强度、平均寿命（Tm）及组分贡献比例（α1）（n = 501个细胞，双侧逻辑回归，广义线性模型）。（C）受试者工作特征曲线，显示使用通道1的强度、α1、τ1、τ2以及通道2的强度、α1、τ1、τ2建立的逻辑回归模型，用于将NSC分类为激活态或静息态。*** p < 0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：培养基与溶液。本实验方案中所用全部溶液的配制方法。请点击此处下载该表格。

表2：示例数据。 通道1和通道2自发荧光的代表性qNSC和aNSC荧光寿命成像（FLIM）数据。请点击此处下载该表格。

补充文件 1：manual_segmentation.cpproj 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：R_ASCtoTIFF.rmd 请点击此处下载该文件。

补充文件 3：test_key 请点击此处下载该文件。

补充文件 4：整合衰减矩阵与细胞质掩膜.rmd 请点击此处下载该文件。

补充文件 5：自发荧光 FLIM 数据.rmd 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了一种活细胞、无标记、非破坏性、单细胞分辨率的技术，可通过成像神经干细胞（NSC）中的自发荧光信号，在体外对NSC细胞状态进行分类。in vitro。该方法可检测NSC从静息状态退出过程中发生的代谢变化，这些变化会影响代谢辅因子（如NAD(P)H）的光学特性，在研究NSC静息状态方面相较于现有技术具有诸多优势。例如，许多用于研究静息态NSC（qNSC）和活化态NSC（aNSC）的传统技术（如使用EdU等细胞周期标记物进行标记）均需要对样本进行固定。而目前可用于研究活体NSC的方法则通常受限于需引入外源性标记，通常通过构建表达荧光蛋白的转基因来实现。这些工具不仅在构建所需资源方面存在限制，还伴随多种技术上的局限性。例如，中间丝蛋白巢蛋白（nestin）和胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）常被用作qNSC和aNSC的标志物12,13,18,28,29。然而，已知nestin和GFAP在qNSC与aNSC之间的表达存在差异12,13,18,28,29。此外，自发荧光成像可提供高分辨率的单细胞数据，有助于揭示在基于群体细胞进行整体分析的实验中容易丢失或难以解析的单细胞异质性。

然而，自发荧光成像也存在若干局限性。许多自发荧光信号在细胞固定后会丢失，因此自发荧光成像主要局限于活细胞的研究。自发荧光成像还依赖于未外源引入荧光染料，因为这些染料可能渗入自发荧光通道。尽管在特定情况下许多荧光染料可与自发荧光成像兼容，但将自发荧光成像与许多现有工具联合使用并不总是可行。活细胞成像还可能引发光毒性。本方案中单次成像不会产生足以降低神经干细胞（NSC）存活率的光毒性。然而，若在时间序列中以每日多次、更频繁的时间间隔重复成像，则可能产生显著的光毒性，因此不适合用于研究NSC的静息状态。最后，尽管自发荧光成像可用于研究来自6周龄雄性小鼠海马或侧脑室的NSC，但该技术是否可广泛应用于其他来源、年龄或其他类型干细胞的NSC研究，目前尚不明确。

本方案还假设能够准确地生成qNSCs和aNSCs 体外 采用先前已建立的实验方案10,13,17,18,19如果难以重复本方案的结果，应通过检测前述各种静息态神经干细胞（qNSCs）和活化态神经干细胞（aNSCs）标志物的有无，以确认qNSCs和aNSCs是否被正确生成。10,13,17,18,19综上所述，自发荧光成像为鉴定静息态神经干细胞（qNSCs）和活化态神经干细胞（aNSCs）以及研究神经干细胞从静息状态退出的过程提供了一种新颖的技术手段。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢威斯康星大学麦迪逊分校流式细胞术核心实验室（P30 CA014520 和 1S10RR025483-01）以及 Moore 实验室和威斯康星大学麦迪逊分校社区成员提供的建议。感谢我们的资助来源：NIH T32 T32GM008688（资助 C.S.M.）、AFAR 机构提供的 Diana Jacobs Kalman 奖学金（资助 C.S.M.）、威斯康星研究生奖学金（资助 C.S.M.）、NIH DP2 新锐创新者奖（1DP2OD025783，资助 D.L.M.）、Vallee 学者奖（资助 D.L.M.）、NIH 1R56NS130450（资助 D.L.M. 和 M.C.S.）、R01 CA185747（资助 M.C.S.）、R01 CA205101（资助 M.C.S.）、R01 CA211082（资助 M.C.S.），以及美国国家科学基金会资助项目编号 CBET-1642287（资助 M.C.S.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40倍水镜物镜NikonMRD77410第3部分中多光子显微镜所用的物镜
8孔比色皿Ibidi80826-90用于成像活化型神经干细胞/静息型神经干细胞（aNSCs/qNSCs）
模拟功率计ThorlabsPM100A第3部分中多光子显微镜所用设备
抗生素-抗真菌素（100倍浓度）（PSF）Thermo Fisher15240062神经干细胞培养基用抗生素
B-27Invitrogen17504044神经干细胞培养基的营养补充剂
BMP4Fisher Scientific5020BP010诱导细胞进入静息状态的因子
牛血清白蛋白SigmaA4919-25G用于配制BMP4溶液
Chameleon超快激光器CoherentN/A第3部分中多光子显微镜所用激光器
共聚焦显微镜NikonC2第1部分所用显微镜
DMEM/F-12（不含GlutaMAX）Invitrogen11320033神经干细胞培养基的基础培养液
DNaseSigmaD5025-15KU添加至胰蛋白酶抑制剂中
EdU检测试剂盒InvitrogenC10337细胞培养增殖检测用
EGFPeproTechAF-100-15-500UG神经干细胞培养基的生长因子
FGFPeproTech100-18B神经干细胞培养基的生长因子
荧光激活细胞分选仪BDFACSAria第2部分所用的荧光激活细胞分选仪
肝素SigmaH3149-50KU神经干细胞培养基的添加剂
L-15Invitrogen21083027用于配制胰蛋白酶抑制剂溶液
层粘连蛋白SigmaL2020-1MG用于玻璃器皿包被
Nikon TiE倒置显微镜NikonN/A第3部分所用显微镜主体框架
多聚赖氨酸（PLO）SigmaP3655-100MG用于玻璃器皿包被
SPC-150单光子计数电子系统Becker and HicklN/A第3部分中多光子显微镜所用设备
胰蛋白酶（用于消化以球状或单层形式生长的aNSC细胞团）Gibco15090046用于消化神经球或贴壁生长的活化型神经干细胞（aNSCs）
胰蛋白酶（用于消化qNSCs）Gibco25200072用于消化贴壁生长的静息型神经干细胞（qNSCs）
胰蛋白酶抑制剂SigmaT6522-100MG用于终止aNSCs的胰蛋白酶消化反应
尿素晶体SigmaU5128-5G用于采集红外响应函数（IRF）
VerseneThermo Fisher15040066用于配制胰蛋白酶溶液

参考文献

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