Method Article

使用自发荧光对 体外 神经干细胞活化状态进行分类

DOI:

10.3791/63110

⸱

April 12th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案描述了通过使用 i） 共聚焦显微镜，ii） 荧光激活细胞分选仪进行强度成像，或 iii） 多光子显微镜进行荧光寿命成像，通过自发荧光成像识别和富集原代成年小鼠神经干细胞培养物中细胞状态的策略。

Abstract

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神经干细胞 （NSC） 通过称为成体神经发生的过程在成人大脑中分裂和产生新生神经元。成体 NSC 主要是静止的，这是一种可逆的细胞状态，它们已经退出细胞周期 （G0） 但仍对环境保持反应。在成体神经发生的第一步，静止 NSC （qNSC） 接收信号并激活，退出静止并重新进入细胞周期。因此，了解 NSC 静止和静止退出的调节因子对于未来针对成体神经发生的策略至关重要。然而，我们对 NSC 静止的理解受到识别静止 NSC （qNSC） 和激活 NSC （aNSC） 的技术限制的限制。该方案描述了一种通过对 NSC 自发荧光成像来识别和富集 体外 培养物中产生的 qNSC 和 aNSC 的新方法。首先，该协议描述了如何使用共聚焦显微镜识别 qNSCs 和 aNSCs 的自发荧光标志物，以使用自发荧光强度对 NSC 激活状态进行分类。其次，该方案描述了如何使用荧光激活细胞分选仪 （FACS） 对 NSC 激活状态进行分类，并使用自发荧光强度富集 qNSC 或 aNSC 的样品。第三，该协议描述了如何使用多光子显微镜以单细胞分辨率进行荧光寿命成像 （FLIM），对 NSC 激活状态进行分类，并使用自发荧光强度和荧光寿命跟踪静止退出的动力学。因此，该方案提供了一种活细胞、无标记、单细胞分辨率工具包，用于研究 NSC 静止和静止退出。

Introduction

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NSC 在许多生物体的整个生命周期中都会产生新生神经元，这一过程称为成体神经发生 1,2。要产生新生神经元，qNSC 首先必须激活，进入细胞周期以扩大细胞群并产生神经祖细胞 3,4,5,6。尽管人们对 NSC 静止了解很多，但我们完全识别 NSC 静止的驱动因素和调节因子的能力受到存在的技术限制，这些技术限制用于分离和识别 qNSCs 及其向激活的转变。自发荧光成像以前通过解析代谢重塑成功地研究了许多不同细胞类型（如小胶质细胞和 T 细胞）的细胞状态变化，代谢重塑会影响自发荧光代谢辅因子的光学特性，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NAD（P）H） 和黄素腺嘌呤二核苷酸 （FAD）7,8。NSC 在经历静止退出9、10、11、12、13、14 时会显着重塑它们的代谢网络。因此，为了利用这些差异，NSC 自发荧光最近被用于通过检测归因于 NSC 退出静止时发生的代谢重塑的自发荧光变化来识别和丰富 NSC 激活状态15。成像自发荧光具有几个技术优势:i） 它不需要添加会影响细胞行为的外源标记;ii） 它可以提供有关 NSC 激活状态的高分辨率单细胞数据;iii） 它不需要销毁细胞 7,16。该方案概述了利用 NSC 自发荧光研究 NSC 静止和活化细胞状态的三种策略15。

最近，从海马体亚颗粒区分离的 6 周龄雄性小鼠中分离的 NSCs，培养并在体外可逆置于静止状态 10,13,17,18,19,20,21，发现点状自发荧光 （PAF） 水平增加，激发波长在 400-600 nm 之间，发射波长在 500-700 nm 之间。与激活的循环 NSC 相比，该信号对 qNSCs 具有特异性15。无需使用额外的抗体标记物或报告基因即可在视觉上区分这两个群体的能力对于许多关于 qNSC 性质和静止退出的实验问题非常有用。因此，首先，该协议描述了使用共聚焦显微镜对 qNSC 中的 PAF 进行成像的策略，该策略可用于识别 NSC 激活状态。其次，该协议描述了使用荧光激活细胞分选 （FACS） 检测 PAF 的策略，并进一步描述了如何根据该信号进行分选以富集 qNSCs 或 aNSC。这些策略提供了一种可用于根据细胞状态对 NSC 进行聚类和分离的度量。

为了开发一种更高分辨率的方法，不仅分离不同状态的 NSC，而且在它们从静止退出过渡到完全激活时，使用多光子显微镜进行荧光寿命成像 （FLIM），以对 NAD（P）H（称为通道 1）自发荧光和绿色自发荧光（称为通道 2;检测 qNSC 中的 FAD 自发荧光和 PAF）寿命及其强度进行成像。这种方法利用了细胞中分子的光学特性取决于其物理特性的事实16,22。例如，NAD（P）（NAD 和 NADP 在光学上无法区分，因此 NAD（P） 用于指代这两个物种）在氧化态下不自发荧光，但在还原态下自发荧光 （NAD（P）H）23。此外，可以通过进行荧光寿命成像来推断自发荧光分子的其他物理性质，例如它们与酶的结合状态 7,22,24。例如，NAD（P）H 在未与酶22 结合时具有较短的荧光寿命。由于参与数百种代谢反应的自发荧光分子（如 NAD（P）H））在经历不同状态或细胞行为的细胞中被不同的使用，因此可以使用检测自发荧光寿命23 的多光子显微镜来检测和量化这些变化。这些测量与自发荧光的丰度或强度一起，通过状态之间的动态转换，提供多维信息，将 NSC 分离成一种细胞状态或另一种细胞状态。第三，该协议描述了使用多光子显微镜执行、分析和解释通道 1 （NAD（P）H） 和通道 2 （PAF） 信号的 FLIM 和强度测量。总之，该协议描述了一种用于研究 NSC 静止的活细胞、无标记工具包，该工具包提供有关 NSC 状态的高分辨率单细胞数据。

Protocol

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本协议中的所有程序均已获得威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 使用共聚焦显微镜对 qNSC 和 aNSCs 中的 PAF 进行成像，以识别 NSC 细胞状态

  1. 从原代 NSC 培养物 中 体外生成 qNSC 和 aNSC。
    1. 在增殖培养基中从成年小鼠大脑中纯化的培养 NSC 以进行扩增（表 1）18,20,21。因此，默认情况下，体外 NSC 培养物是 aNSC。
    2. 要生成 qNSC，请使用以下方案将 aNSC 接种在涂层玻璃器皿上，然后用 qNSC 培养基处理它们以诱导 3 天内的静止。
    3. 制备折射率适合油浸物镜以粘附 NSC 的玻璃器皿，方法是先涂上聚-L-鸟氨酸（PLO;塑料水中 10 mg/mL，玻璃水中 50 mg/mL）溶液，足以覆盖培养皿底部（对于 1 cm2 成像比色皿孔，使用 ~150 μL）在 37 °C 下在 ddH2O 中放置 1 小时。
    4. 取出 PLO 溶液并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤 3 次。
    5. 在 PBS 中涂覆足以覆盖培养皿底部的层粘连蛋白溶液 （5 mg/mL）（对于 1 cm2 成像比色皿孔，使用 ~150 μL），并在 37 °C 下孵育至少 3 小时或过夜。
    6. 去除层粘连蛋白溶液，然后添加足以覆盖培养皿底部的培养基（对于 1 cm2 成像比色皿孔，使用 ~150 μL）。
    7. 通过在室温（RT，~25°C）下以 120 x g 离心 aNSC（它们可以从单层或神经球开始）4 分钟来制备用于胰蛋白酶消化的细胞。
    8. 在 37 °C 下，在 100 μL 胰蛋白酶混合物中胰蛋白酶消化上一步沉淀的 aNSC 5 分钟，然后用 200 μL 胰蛋白酶抑制剂混合物淬灭胰蛋白酶消化（表 1）。
    9. 让 NSC 静置 2 分钟，然后通过上下移液 10 次来机械研磨它们。
    10. 加入 5 mL aNSC 培养基，并以 120 x g 离心细胞 4 分钟。
    11. 将 NSC 重悬于 1 mL aNSC 培养基中，并将细胞以 10%-20% 汇合度接种在 aNSC 培养基中。例如，将 ~5,000 个细胞接种到 1 cm2 成像比色皿孔的一个孔中，其中含有 150 μL 培养基。
    12. 让 aNSCs 粘附在培养皿表面 24 小时后，去除 aNSC 培养基，并用足以覆盖培养皿底部的 qNSC 培养基替换它（对于 1 cm2 成像比色皿孔，使用 ~150 μL; 表 1 - 如前所述10、13、17、18），其中将诱导静止。
    13. 至少每 2 天更换一次 aNSC 和 qNSC 培养基。在 qNSC 培养基中放置 3 天后，NSC 处于静止状态，可用于成像实验。
  2. 使用共聚焦显微镜 在体外对活 qNSC 和 aNSC 进行成像。
    注意:每台显微镜都有其专有软件;因此，通过执行类似操作来配置特定的显微镜，以执行这些步骤。该协议将提供在 NIS-Elements 中工作的说明。
    1. 配置共聚焦显微镜以进行自发荧光成像。
      1. 单击 405 Laser，然后在 405 Laser 菜单中的发射窗口中键入。单击 TD 收集透射光图像并设置 HV 值以可视化样品。
      2. 将 Laser Power 设置为 3.5%，将 Gain 设置为 75。将 Zoom 设置为 2。设置共聚焦扫描参数，将 Pixel Dwell （像素停留 ） 设置为 0.5，并将 Resolution （分辨率 ） 设置为 2048 x 2048 像素。
    2. 使用 明场聚焦，在 ~60 倍油浸物镜下聚焦细胞。
    3. 单击 Eye Port 切换到共聚焦扫描模式，确保光路现在流向扫描头，并且光路中没有滤光片立方体。
    4. PAF 富含 qNSCs，并且具有广泛的可激发性和可发射性（见 图 1）。以 图 1 为指导，根据系统的功能选择最佳光学配置。为了获得最强和最干净的信号，使用 ~400-500 nm 之间的激光激发，收集 ~580-620 nm，并使用 ~60 倍油浸物镜。
      注意:自发荧光成像需要比典型成像实验所需的更高的激光功率来激发。如果其他自发荧光分子或其他标记物与 PAF 一起成像，请仔细设计光学配置，以避免渗入自发荧光通道。
    5. 获取 qNSCs 和 aNSCs 中自发荧光的图像。单击 Scan（扫描），然后聚焦于图像，然后单击 Capture（捕捉）。为了获得最佳图像，收集单平面图像，聚焦细胞的细胞质（基于漫散在整个细胞中的较暗的自发荧光），以获得每个细胞的代表性横截面。
    6. 如果旨在直接比较不同的图像，请在同一天使用相同的光学配置（例如，相同的激光功率）和图像样本。
    7. 激光器和探测器的确切功率将取决于每个特定系统。首先使用低激光功率，然后慢慢增加功率，直到可以检测到信号而不会饱和。
  3. 在体外分析活 qNSC 和 aNSC 中的 PAF。
    1. 在 qNSCs 或 aNSCs 中获取自发荧光图像后，通过在 ImageJ25 中打开文件来量化图像。
    2. 在 qNSC/aNSC 自发荧光图像上使用选项 处理>滤镜>高斯模糊 （Sigma: 2） 来平滑不均匀的像素。
    3. 使用 "图像>调整>阈值" 选择表示 PAF 的像素（消除背景像素），然后单击 "应用"。对将要直接比较的所有图像使用相同的阈值参数。
    4. 使用 Process > Binary > Watershed 分隔空间接近的 PAF。
    5. 使用计算机鼠标，在细胞周围绘制感兴趣区域 （ROI），这是通过查看明场图像或查看均匀存在于整个细胞质中的弥漫自发荧光来确定的。
      注意:通常可以排除薄的外围过程并包括细胞核，因为这些位置通常不存在自发荧光，因此不会干扰分析。
    6. 使用 Analyze > Analyze Particles （大小:0.1-infinity μm;循环度:0-1），并选中 summarize。
      注意:然后 ImageJ 将生成一个输出窗口，其中包含感兴趣区域中粒子的数据，这允许将每个单元格中 PAF 的数量制成表格。其他荧光分子可以与成像 PAF 配对。然而，由于 PAF 是一个相对暗淡的信号，因此验证其他荧光团不会渗入 PAF 通道非常重要。通常，吸收 600+ nm 并发射 650+ nm 的荧光基团可以与成像 PAF 配对，例如 LipidSpot 610。

2. 使用 FACS 基于自发荧光富集培养的 NSC 中的 NSC 激活状态

  1. 生成 qNSC 和 aNSC，如第 1 节所述。
  2. 根据自发荧光对活 qNSC 和 aNSC 的混合物进行分选。
    注意:作为示例，该协议将讨论如何通过以 1:1 的比例混合 qNSC 和 aNSC 生成的样品中富集 aNSC 或 qNSC。
    1. 在胰蛋白酶消化和细胞分选之前，通过向细胞培养基中加入 10 μM 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶（EdU;一种掺入合成 DNA 的细胞中的胸苷类似物，例如在细胞周期的 S 期）来标记通过 S 期的细胞。
    2. 如步骤 1.1.8 中所述，胰蛋白酶消化 qNSC 和 aNSC，重悬于 0.5 mL FACS 缓冲液中（表 1），然后置于冰上。
      注意:qNSC 牢固地粘附在培养皿上。在相对较高的汇合度下，qNSCs 可以从培养皿中机械解离。但是，如果 qNSCs 的汇合度相对较低或难以通过移液从培养皿中机械去除，请使用胰蛋白酶将它们从培养皿中去除。
      1. 从 qNSC 中取出培养基，加入足以覆盖培养皿底部的 0.25% 胰蛋白酶（对于 1 cm2 成像比色皿孔，使用 ~150 μL），在 37 °C 下孵育 3 分钟。
      2. 孵育后，通过添加等于添加的胰蛋白酶体积的每种细胞类型对应的培养基来淬灭胰蛋白酶反应。在收集和离心之前，将细胞从培养皿中机械解离。
    3. 使用 ~130 μm 喷嘴，使用流式细胞仪或 FACS 在基于仪器功能的光学条件下分析 qNSC 和 aNSC，并检测 PAF，如图 1 所示。例如，使用 405 nm 激光激发样品，并使用 580-620 nm 滤光片进行检测。
    4. 在数据文件中收集至少 10,000 个单重态 qNSC 和 aNSC，然后使用它们来设计门以收集 qNSCs 或 aNSC 的富集。例如，设置门以根据 aNSC:qNSC （1:1） 混合样品中的自发荧光强度收集前 25% 或后 25% 的 NSC。
    5. 如上所述，在设置门以分选具有更亮或更暗自发荧光的单细胞后，将细胞分选到充满 aNSC 培养基（10,000 个细胞/cm2，参见步骤 1.1.3）的 PLO，层粘连蛋白包被的孔中。
    6. 遵循 FACS，让 NSC 在培养箱中静置 3 小时。通过在室温下用足以覆盖培养皿底部的 4% 多聚甲醛处理细胞来固定细胞（对于 1 cm2 成像比色皿孔，使用 ~150 μL）。
      注:要在细胞中可视化 EdU，最简单的方法是获得用于检测 EdU 的商业试剂盒并遵循制造商推荐的方案。
    7. 首先，通过在室温下用 0.25% triton 的 PBS 溶液处理 15 分钟来透化细胞。
    8. 接下来，在 RT 下用 EdU 染色溶液处理细胞 30 分钟。
      注:EdU 染色溶液的精确组成会因试剂来源而异，但大致由反应缓冲液、反应缓冲液添加剂、硫酸铜和炔烃或叠氮化物修饰的分子组成。有关推荐的套件，请参阅 材料表 。
    9. 染色后使 EdU 可视化，用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。

3. 使用多光子显微镜检测通道 1 和通道 2 自发荧光，并在 体外 对 NSC 进行 FLIM 以识别 NSC 细胞状态群体和转换

注意:每台显微镜都有其专有软件;因此，通过执行类似操作来配置特定的显微镜，以执行这些步骤。该协议将提供在 Prairie View 中工作的说明。

  1. 生成 qNSC 和 aNSC，如第 1 节所述。
  2. 设置多光子显微镜以进行荧光寿命成像。
    1. 使用放大倍率为 40 倍或更高 （~1.15 NA） 的物镜。
    2. 使用带有以下或等效组件的多光子显微镜:可调谐超快激光器、720 nm 长通二向色性、磷化砷化镓 （GaAsP） 光电倍增管 （PMT）、时间相关单光子计数电子设备和模拟功率计。
    3. 对于成像通道 1，将可调谐激光器设置为 750 nm，并使用 440/80 nm 发射滤光片立方体。对于成像通道 2，将激光器设置为 890 nm 并使用 550/100 nm 发射滤光片立方体。
      注意: 在 PMT 打开之前关闭室内灯。
  3. 仪器响应功能
    1. 通过对粉碎的尿素晶体进行成像来捕获仪器响应函数 （IRF），以解释仪器在测量衰减中的时间响应。
      注意:IRF 与衰减进行卷积，以准确计算衰减拟合曲线。对于采集，将激光设置为 890nm，并使用 440/80 nm 发射滤光片立方体。GaAsP PMT 的增益设置为 800，普克尔（激光功率）最初设置得非常低，通常为 1。
    2. 选择具有结晶尿素的视野并略微增加粒数（最多 15 个）。
    3. 接下来，使用与细胞成像相同的参数采集图像:恒定分数鉴别器 （CFD） 1 x 104 - 1 x 10 5,256 x 256 分辨率，停留时间设置为 4.8 μs，光学变焦设置为 1.5 倍，积分时间为 60 s。
  4. 在体外对活体 qNSC 和 aNSC 进行通道 1 和通道 2 自发荧光的荧光寿命成像和强度成像
    1. 找到图像的视野:使用目镜找到合适的视野，并改变显微镜上样品的光路以实现成像。
      注意:将首先获取通道 1 图像，然后是相同视野的通道 2 图像。
    2. 通道 1 图像收集设置:单击 "功率/增益" 选项卡并将 PMT 上的增益设置为 800，单击 2-P 激光 选项卡并为激光器选择 750 nm ，并确保使用正确的滤光片立方体 （440/80 nm）。
    3. 收集通道 1 图像。
      1. 通过转到 Power/Gain 选项卡并将 Pockels 设置为 30，然后转到该屏幕的 Scanning 部分并单击 Live Scan 来启动预览模式。
      2. 增加 普克尔斯 以在低激光功率（低于 3.6 mW）下找到良好的视野。找到视野后，调整 普克尔斯 ，使功率计在普克尔单元之后的功率上读取 ~3.6 mW，计数 率 选项卡中的常数分数鉴别器 （CFD） 尺寸为 1 x 104 - 1 x 105。
    4. 转到 扫描 部分，然后单击 单次扫描 满足这些参数后。这将在 60 秒内获取通道 1 图像。
    5. 要收集通道 2 图像，请单击 2-P 激光 选项卡并为激光器选择 890 nm ，将滤光片立方体交换到通道 2 发射立方体 （550/100 nm）。
    6. 按照 3.4.3 中的说明启动预览模式，增加 Pockels ，直到功率计读数为 ~7 mW，CFD 计数再次为 1 x 104 -1 x 105。
    7. 转到 扫描 部分，然后单击 单次扫描 满足这些参数。这将在 60 秒内获取通道 2 图像。
    8. 采集更多图像 - 采集通道 1 和通道 2 图像后，找到新的视野并重复步骤 3.4.2 - 3.4.4。通常，收集 4-6 个视野来对 ~50-100 个细胞进行成像就足以满足实验中的一种条件。
      注:mCherry 可用作额外的荧光标记，而不会渗入通道 1 和通道 2 通道。
  5. 分析荧光寿命图像。
    1. 按照步骤 3.5.2-3.1.14 在 SPCImage 中为荧光寿命图像生成衰变矩阵。
      注意:有关更多信息，请查阅在线免费提供的更新手册26.
    2. 打开 SPCImage 并打开第 3.3 节中收集的 IRF FLIM 图像。
    3. 调整直方图中的垂直黑条，使其限制为 IRF 衰减曲线。在顶部菜单栏中，单击 IRF > 复制到剪贴板.
    4. 在要分析的数据集中打开一个 FLIM 图像文件，在第 3.4 节中获得。
    5. 在顶部菜单栏中，单击 IRF > 从剪贴板粘贴。
    6. 在软件的右下角，将 Components （ 组件 ） 设置为 2。
    7. 在软件的顶部菜单栏中，单击选项 > 模型。然后为 Fit Method 选择 MLE，为 Spatial Binning to Square，为 Threshold to Peak，并在 Settings 下选择 Multiexponential Decay。
    8. 在软件的左下角，增加 Bin ，直到激发后立即光子计数峰值处代表性细胞质像素中的光子计数至少为 100。
    9. 在软件的左下角，设置 阈值.对于通道 1，使用阈值 "50"。对于通道 2，使用阈值 "0"。
    10. 在软件的顶部菜单栏中（此协议描述了如何操作版本 8.3），单击 Calculate > Decay Matrix。
      注意:确保整个图像的 Chi2 值为 ~0.8-1.2。这通过验证双指数衰减建模证实了数据将是稳健的。
    11. 在顶部菜单栏中，单击 File > Save。
    12. 在软件的顶部菜单栏中，单击 File > Export，然后导出以下内容:
      颜色编码值、T1、T2、Chi2、像素强度、A1[%]、A2[%] 和颜色编码图像（带图例）
      注意:现在 SPCImage 设置为执行批处理，分析给定通道的所有图像（一起分析通道 1 FLIM 图像，然后从通道 2 FLIM 图像的步骤 3.5.2 开始重复）。
    13. 要执行批处理，请单击 计算 > 批处理 并选择要处理的 FLIM 图像。
    14. 在顶部菜单栏中，单击 File > Export > Batch Export ，然后选择要导出的衰减矩阵（在上一步中生成）。
    15. 按照步骤 3.5.16-3.5.24 使用 CellProfiler 创建细胞质掩码。
      注意:为此，细胞核将手动位于通道 1 强度图像周围，其中细胞核是黑色的且清晰可见。然后，CellProfiler 管道 manual_segmentation.cpproj27 （补充文件 1）将按照细胞核掩码的指示自动生成全细胞和细胞质掩码。细胞核也可以用 mCherry 标记，并与通道 1 和通道 2 自发荧光一起成像，以提供自动识别细胞核的能力。然而，许多传统的核染料会在光谱上渗入自发荧光通道，因此与该技术不兼容。
    16. 在 R Studio 中，使用 R_ASCtoTIFF.rmd27 （补充文件 2）转换 X_photons.asc 文件，其中 X 是从设置为 TIF 文件的通道 1 图像中获取的图像的名称。
    17. 打开 Cell Profiler 并打开 manual_segmentation.cpproj。
    18. 加载在管道顶部的 Images 步骤中的步骤 3.5.16 中创建的通道 1 光子 TIF。
    19. 在标题为 SaveImages 的管道的底部 3 个步骤中，为 CellProfiler 将生成的掩码设置保存路径。
    20. 单击 CellProfiler 左下角的 Start Test Mode 。
    21. 单击 CellProfiler 左下角的 Run 。当 CellProfiler 进入 IdentifyObjectsManually 步骤时，将出现一个窗口，显示当前正在处理的通道 1 图像。
    22. 单击键盘上的 F 键，然后在按住鼠标左键的同时手动绘制一个细胞核的轨迹。追踪原子核后，松开鼠标左键。对图像中的所有单元格重复此步骤。
    23. 单击带有强度图像的弹出窗口右下角的 Done 。该软件现在将完成管道并导出细胞质、细胞核和总细胞掩模。
    24. 在左下角，单击 "下一个图像集 "，然后对所有通道 1 TIF 图像重复步骤 3.5.21-3.5.23。
    25. 使用 R 脚本 （Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd） 整合步骤 3.5.2-3.5.14 中生成的衰变矩阵和步骤 3.5.15-3.5.24 中生成的细胞质掩码，按照步骤 3.5.26-3.5.30 获得每个细胞细胞质的平均荧光寿命成像变量
    26. 使用电子表格（例如，Microsoft Excel）创建一个标题为 test_key27 [补充文件 3] 的示例）的 .csv 文档，其中包含 3 列。
    27. 将列的标题命名为 Folder、NADH和 FAD。填写表格以列出文件夹中的文件夹位置，然后分别在 NADH 和 FAD 中列出图像标题前缀，以将每个通道 1 图像链接到每个通道 2 图像（请参阅示例数据 - 表 2）。
  6. 在 R Studio 中，打开 Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd27（补充文件 4）。
    1. 按照脚本中的注释设置以下文件路径:设置工作目录、通道 1 文件位置、FAD 文件位置、遮罩文件位置以及输出文件位置和名称。
    2. 运行整个脚本。成功完成脚本后，将生成一个输出文件，包括元数据和平均 FLIM 变量。
    3. 使用 自发荧光 FLIM data.rmd27 （补充文件 5）或任何其他分析软件进行分析。

Results

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共聚焦自发荧光成像以分离 NSC 细胞状态（图 1）
为了使用共聚焦显微镜来解析 NSC 激活状态，使用活化培养基或静态培养基在体外生成 qNSC 和 aNSC，如前所述 10,13,17,18。为了检测 NSC 中的 PAF，在共聚焦显微镜上使用相同的曝光对活 qNSC 和 aNSC 进行成像（例如:405 nm，Em:580-620 nm）。与 aNSCs 相比，qNSCs 表现出更高的 PAF 数量（图 1A、B）。这一发现说明了如何使用自发荧光特性作为标记物来识别 qNSCs 和 aNSCs 的细胞状态。

使用自发荧光对 NSC 细胞状态进行 FACS 富集（图 2）
为了使用 FACS 富集细胞周期状态，如本方案所述，在 体外10、13、17、18、19 中产生 qNSC 和 aNSC，并在胰蛋白酶消化之前用 EdU 预标记 1 小时，并在流式细胞仪中进行分析以标记细胞进展到 S 期。然后通过流式细胞术单独或以 1 qNSC:1 aNSC 的比例混合分析 qNSC 和 aNSC（图 2


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Discussion

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该协议描述了一种活细胞、无标记、非破坏性、单细胞分辨率技术，该技术允许通过 NSC 中自发荧光信号的成像 在体外 对 NSC 细胞状态进行分类。这种方法检测 NSC 静止退出期间发生的代谢变化，这些变化会影响代谢辅助因子（如 NAD（P）H））的光学特性，并且与现有技术相比，为研究 NSC 静止提供了许多优势。例如，许多研究 qNSC 和 aNSC 的常规技术，例如使用 EdU 等细胞周期标志物标记，需要固定样品。目前存在的能够研究活 NSC 的方法由于需要引入外源标记（通常是通过产生荧光蛋白编码转基因）而进一步受到限制。这些工具在生成它们所需的资源和许多技术注意事项方面都受到限制。例如，中间丝蛋白巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 通常用作 qNSC 和 aNSC 的标志物12、13、18、28、29。然而，已知巢蛋白和 GFAP 在 qNSC 和 aNSC 之间差异表达12、13、18、28、29。此外，自发荧光成像可提供高分辨率的单细胞数据，这些数据可以揭示在实验中丢失或难以解释的单细胞异质性，最终对细胞群进行批量分析。

然而，自发荧光成像也有一些局限性。许多自发荧光信号在细胞固定时丢失。因此，自发荧光成像在很大程度上仅限于活细胞的研究。自发荧光成像还依赖于缺乏外源性引入的荧光团，这些荧光团会渗入自发荧光通道。尽管许多荧光基团在特定情况下可以与自发荧光成像兼容，但并不总是可以将自发荧光成像与许多现有工具配对。活细胞成像也可诱导光毒性。使用该方案的一次成像迭代不会诱导足够的光毒性以降低 NSC 活力。然而，在时间过程中以更频繁的间隔每天多次重复细胞成像可能会产生显着的光毒性，因此不是研究 NSC 静止的可行策略。最后，尽管自发荧光成像可用于研究来自海马体或侧脑室的 6 周龄雄性小鼠的 NSC，但目前尚不清楚该技术可用于研究来自其他来源、年龄或其他干细胞类型的 NSC 的广泛程度。

此处描述的方案还假设使用先前建立的方案10、13、17、18、19 在体外准确生产 qNSC 和 aNSC。如果重现该方案的结果具有挑战性，请确保通过探测 qNSCs 和 aNSC 的各种标记物的存在或不存在来正确生成 qNSCs，如前所述10、13、17、18、19。综上所述，自发荧光成像为识别 qNSC 和 aNSC 以及研究 NSC 静止退出提供了一种新颖的技术方法。

Disclosures

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作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

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我们感谢威斯康星大学麦迪逊分校流式细胞术核心（P30 CA014520 和 1S10RR025483-01）以及摩尔实验室和威斯康星大学麦迪逊分校社区的成员提供的意见。我们感谢我们的资金来源:NIH T32 T32GM008688（给 C.S.M.）、来自 AFAR 的 Diana Jacobs Kalman 奖学金（给 C.S.M.）、威斯康星州研究生奖学金（给 C.S.M.）、DP2 NIH 新创新者奖（1DP2OD025783，给 D.L.M.）、Vallee 学者奖（给 D.L.M.）、NIH 1R56NS130450（给 D.L.M 和 MCS）， R01 CA185747（给 MCS）、R01 CA205101（给 MCS）、R01 CA211082（给 MCS）和美国国家科学基金会拨款号。CBET-1642287（至 MCS）。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40x 水物镜尼康MRD77410用于多光子显微镜的物镜 第 3 部分
8 孔比色皿Ibidi80826-90用于成像 aNSCs/qNSCs
模拟功率计ThorlabsPM100A用于第 3 部分的多光子显微镜
抗生素-抗真菌剂 （100X） （PSF）Thermo Fisher15240062用于 NSC 培养基的抗生素
B-27Invitrogen17504044NSC 培养基的营养补充剂
BMP4Fisher Scientific5020BP010诱导静止的因子
牛血清白蛋白SigmaA4919-25G用于制造 BMP4
变色龙超快激光器相干N/A激光器用于第 3 部分
聚焦显微镜中的多光子显微镜尼康C2显微镜，用于第 1 部分
DMEM/F-12（不含 GlutaMAX）Invitrogen11320033NSC 的
DNA 酶SigmaD5025-15KU添加到胰蛋白酶抑制剂
EdU 检测试剂盒InvitrogenC10337细胞培养增殖检测
EGFPeproTechAF-100-15-500UGNSC 培养基的生长因子
FGFPeproTech100-18BNSC 培养基生长因子
荧光活化细胞分选仪BDFACSAria用于第 2 部分的荧光激活细胞分选仪
素Sigma H3149-50KUNSC 培养基添加剂
L-15Invitrogen21083027用于制备胰蛋白酶抑制剂溶液
层粘连蛋白SigmaL2020-1MG用于镀膜玻璃器皿
尼康 TiE 倒置显微镜尼康N/A显微镜框架 用于第 3 部分
PLOSigmaP3655-100MG用于镀膜玻璃器皿
SPC-150 单光子计数电子器件贝克尔和希克尔N/A用于第 3 部分的多光子显微镜
蛋白酶（用于胰蛋白酶消化生长为球体或单层的 aNSC 颗粒）Gibco15090046用于胰蛋白酶消化神经球或贴壁 aNSCs
胰蛋白酶（用于胰蛋白酶消化 qNSCs）Gibco25200072胰蛋白酶消化贴壁 qNSCs
胰蛋白酶SigmaT6522-100MG用于抑制 aNSCs 胰蛋白酶消化
尿素晶体SigmaU5128-5G用于收集 IRF
VerseneThermo Fisher15040066用于制备胰蛋白酶
共中 肝 胰用于抑制剂

References

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