大鼠模型中的视网膜病理生理学评估

Summary

糖尿病视网膜病变是失明的主要原因之一。组织学、血液-视网膜屏障破坏测定和荧光血管造影是了解视网膜病理生理学的宝贵技术，可以进一步提高针对糖尿病视网膜病变的药物筛查效率。

Abstract

像糖尿病视网膜病变这样的后段眼病会改变视网膜的生理学。糖尿病视网膜病变的特征是视网膜脱离、血液-视网膜屏障 （BRB） 破裂和视网膜血管生成。体内大鼠模型是检查视网膜结构和功能变化的宝贵实验工具。我们在大鼠模型中提出了三种不同的实验技术，以识别视网膜细胞，视网膜脉管系统和受损BRB的形态变化。视网膜组织学用于研究各种视网膜细胞的形态。此外，通过视网膜细胞计数和不同视网膜层的厚度测量进行定量测量。BRB分解测定用于确定由于BRB分解而导致的眼外蛋白从血浆泄漏到玻璃体组织。荧光血管造影用于通过使用FITC-葡聚糖染料可视化视网膜脉管系统来研究血管的血管生成和泄漏。

Introduction

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最复杂的继发性并发症之一。它也是全世界劳动年龄人口中可预防的失明的主要原因。在最近一项针对 3240 万盲人的荟萃分析中，有 830，000 人（2.6%）因 ^DR1 而失明。2015 年，糖尿病导致的视力丧失比例在全球排名第七，为 1.06%（0.15-2.38）^2，3。

糖尿病视网膜病变由后眼组织血管异常诊断。临床上，它分为两个阶段 - 不增殖性DR（NPDR）和增殖性DR（PDR），基于视网膜中的血管形成。高血糖被认为是DR的有效调节剂，因为它涉及与视网膜中神经变性^4，5，炎症^6，7和微脉管⁸ 有关的几种途径。由高血糖引起的多种代谢并发症包括晚期糖基化终产物 （AGEs）、多元醇途径、己糖胺途径和蛋白激酶-C 途径的积累。这些途径负责基于糖尿病视网膜病变不同阶段的细胞增殖（内皮细胞），迁移（周细胞）和凋亡（神经视网膜细胞，包细胞和内皮细胞）。这些代谢改变可导致生理变化，例如视网膜脱离、视网膜细胞丧失、血液-视网膜屏障 （BRB） 分解、动脉瘤和血管生成⁹。

链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病是大鼠中评估糖尿病发病机制及其并发症的成熟和广泛接受的实践。STZ的致糖尿病作用是由于胰岛β细胞的选择性破坏¹⁰。结果，动物将经历胰岛素缺乏，高血糖，烦渴和多尿，所有这些都是人类1型糖尿病的特征¹¹。对于重度糖尿病诱导，STZ在成年期静脉注射或腹膜内以40-65mg / kg体重给药。大约72小时后，这些动物的血糖水平大于250mg / ^dL10，12。

为了了解由于神经变性，炎症和血管生成引起的视网膜的生理变化，应在实验动物模型中优化不同的技术。视网膜细胞和视网膜血管的结构和功能变化可以通过各种技术进行研究，例如组织学，BRB分解测定和荧光血管造影。

组织学涉及在微观水平上研究细胞，组织和器官的解剖结构。它在细胞/组织的结构和功能之间建立相关性。执行几个步骤来可视化和识别组织结构的微观变化，从而比较健康和患病的对应物¹³。因此，必须一丝不苟地标准化组织学的每个步骤。视网膜组织学涉及的各种步骤包括标本固定，修剪标本，脱水，清除，用石蜡浸渍，石蜡包埋，切片和染色（苏木精和曙红染色）^13，14。

在健康的视网膜中，分子在视网膜上的运输由BRB控制，BRB由内侧的内皮细胞和周围细胞以及外侧的视网膜色素上皮细胞组成。然而，在患病期间，BRB内皮细胞和周细胞开始退化，BRB也受到损害¹⁵。由于这种BRB分解，许多低分子量分子泄漏到玻璃体和视网膜组织中¹⁶。随着疾病的进展，许多其他蛋白质分子（低分子量和高分子量）也由于稳态紊乱而泄漏到玻璃体和视网膜组织中¹⁷。它导致各种其他并发症，最终导致黄斑水肿和失明。因此，量化玻璃体中的蛋白质水平并比较健康和糖尿病状态的测量会损害BRB。

荧光血管造影是一种用于使用荧光染料研究视网膜和脉络膜血液循环的技术。它用于 通过 静脉注射途径或心脏注射来可视化视网膜和脉络膜的脉管系统¹⁸。一旦染料被注射，它首先到达视网膜动脉，然后是视网膜静脉。染料的这种循环通常在注射染料¹⁹后5至10分钟内完成。它是诊断各种后段眼部疾病的重要技术，包括糖尿病视网膜病变和脉络膜新生血管形成²⁰。它有助于检测正常和疾病条件下的主要和次要脉管系统变化。

Protocol

该协议遵循海得拉巴校区BITS-Pilani机构动物伦理委员会提供的所有动物护理指南。

1. 视网膜组织学

1. 眼睛的去核和固定
   1. 使用通过腹膜内途径注射的高剂量戊巴比妥（150mg / kg）对2至3个月大的糖尿病Wistar雄性大鼠以及年龄匹配的对照组（14至15周龄）实施安乐死。没有可检测到的心跳在2-5分钟内确认死亡。
   2. 通过使用手术刀刀片在眼睛的鼻和颞叶区域做切口来修饰眼睛。然后用镊子和微型剪刀沿着其边缘切割，将眼睛从眼眶窝中取出。
      注意:在牺牲大鼠之前，请准备好固定溶液。
      注意:甲醛会刺激皮肤、眼睛、鼻子和呼吸道。它也可能导致癌症，因为它是一种有效的皮肤致敏剂。戴上手套，在引擎盖下处理²¹。
   3. 在培养皿中用10 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液彻底清洗眼睛，以去除血液。去除眼睛周围的多余脂肪，以便于渗透固定溶液。
   4. 在镊子的帮助下，立即将眼睛置于5毫升固定溶液中，并确保其不会粘在玻璃瓶壁上。轻轻搅拌几秒钟，然后用适当的标签更换盖子。在室温下，在黑暗条件下将眼睛在固定溶液中孵育24至48小时。
2. 组织修剪
   1. 固定后，将眼睛从固定溶液中取出，用10 mL PBS洗涤，并将其放入含有10 mLPBS的培养皿中，在4°C下冷却。
   2. 使用微型镊子，用视神经握住眼睛，并在微型剪刀的帮助下在 pars plana 上划痕。切开角膜的整个边缘，以分离眼睛的前杯。使用镊子，轻轻地拿起晶状体，丢弃它，然后切开视神经。
   3. 使用弯曲的微型剪刀，使后眼罩的纵向部分，穿过视盘将其分成两半。将其放在盒的底部，并正确关闭盖子，而不会对组织造成任何干扰。用组织样品名称和日期标记盒。
3. 组织脱水、清除和石蜡浸渍
   1. 通过逐渐转移到80mL的50%，70%，90%和100%乙醇中使修剪的组织脱水。将盒从一种浓度转移到另一种浓度时，请确保将它们轻拍在干净的薄纸上，以尽量减少污染。
      注意:让纸巾在每次转移中静置30分钟（两次）。此步骤消耗的总时间约为 4 小时。
   2. 脱水后，将盒转移到80mL二甲苯中30分钟（两次）以用二甲苯代替乙醇。
      注意:与二甲苯孵育后，组织变得半透明。
      注意:二甲苯是一种带有苯环的芳香族化合物。它刺激眼睛和粘膜，也可能导致抑郁症。
   3. 最后，在60°C下用预热的石蜡浸渍组织以取代组织中的二甲苯。将盒在薄纸上轻拍几次以尽量减少二甲苯含量，并将200mL石蜡（60°C下的液体）中放置2小时（1小时x 2）。
      注意:避免吸入融化的石蜡，因为它会产生微小的脂滴，可能导致呼吸不适。
4. 石蜡包埋
   1. 使用前至少1小时打开石蜡包埋机，使石蜡熔化并使其达到所需温度。将钢模放在热表面上，用熔化的石蜡填充钢模，然后一次从石蜡容器中取出一个盒。
   2. 将钢模从热表面移动到冷表面（4°C）。此时，模具中的蜡将开始凝固。在完全固化之前，在镊子的帮助下将组织放入蜡中并定向组织，使后杯的视盘部分面向模具的底部。
      注意:确保组织不会移动并保持其所需的方向。如果没有，请将模具放回温暖的工作台面上，直到整个石蜡液化，然后从步骤1.4.2重新开始。
   3. 当模具中的蜡开始凝固时，立即将盒底座放在模具顶部。小心地用石蜡填充模具，在盒的上边缘上方，然后缓慢地将其转移到冷表面（接近-20°C）以快速凝固。在固化之前，请用步骤1.4.2中的其他暗盒重复该过程。
   4. 一旦所有模具固化，将钢模与盒分开。如果很难，请稍等片刻，然后重试（不要强行将其删除）。完全凝固后，分离变得更加容易。现在，盒成为石蜡块的底部，在切片机切片过程中保持。
      注:该块可在室温下储存以备下次使用。此时，可以停止该过程并在以后继续（如果需要）。
5. 切片
   1. 在刀片架上安装一次性切片机刀片。去除盒周围多余的石蜡，使块的上部和下部都与刀平行。将块安装到盒式磁带支架上。
   2. 解锁手轮以使其前进，直到块的表面与刀刃接触。修剪块上多余的石蜡，直到组织在块的表面上可视化。将截面厚度设置为 5 μm，并切割五到六个截面的色带。
   3. 使用镊子，轻轻地将丝带转移到预温水浴（约50°C）的表面上以展开丝带。将载玻片放在涂有梅耶白蛋白的载玻片上，方法是将载玻片放在切片下方。轻轻抬起切片，让载玻片在37°C水平干燥过夜。
      注意:载玻片可以在室温下储存在干燥的盒子中数月。在此步骤中，该过程可以停止并在以后继续。
6. 染色
   1. 在使用之前，在60°C的热风烤箱中加热要染色的载玻片1小时，以使石蜡熔化，并按照 表1中提到的步骤进行操作。
      注意:赤霉素和曙红染色剂在吸入或摄入时有毒。据报道，它们是致癌的。

试剂	站立时间	重复（次数）
二甲苯	5 分	2
100%乙醇	5 分	2
90%乙醇	5 分	2
70%乙醇	5 分	2
50%乙醇	5 分	2
水	5 分	2
苏木精	4 分	1
水洗
1%酸醇在70%乙醇中	30 秒	1
水洗
斯科特的水	1 分钟	1
水洗
50%乙醇	1 分钟	1
95%乙醇	1 分钟	1
0.25%曙红	5 秒	1
水洗
水	2 分钟	1
95%乙醇	1 分钟	1
100%乙醇	1 分钟	1
二甲苯	5 分	2
安装胶和盖玻片

表 1.苏木精和曙红染色程序

2. 血脑屏障分解试验

1. 血液和玻璃体收集
   1. 使用氯胺酮（80 mg / kg）和木屈嗪（8 mg / kg）麻醉2至3个月大的糖尿病Wistar雄性大鼠以及年龄匹配的对照组（14至15周）。通过踏板抽出反射（脚趾捏）确认麻醉状态。立即通过心脏穿刺将 1 mL 血液收集到乙二胺四乙酸 （EDTA） 包被的管中，以将血浆从全血中分离出来。
   2. 使用高剂量的戊巴比妥（150mg / kg）对大鼠实施安乐死，通过腹膜内途径注射。没有可检测到的心跳在2-5分钟内确认死亡。对眼睛进行眼部检查，并立即将其放在干冰上。
   3. 将眼睛放在干冰上方的干净培养皿中（推荐），然后按照步骤1.2.2所述开始解剖眼睛。
   4. 取出晶状体，使用微镊子小心地将玻璃体从后杯中拉出，并将其放入含有三到四个玻璃珠（2-4毫米）的均质管中。
      注意:建议在干冰上解剖，因为在冷冻条件下更容易取下晶状体和玻璃体。
2. 样品制备
   1. 在珠状均质机中以中速均质10秒的玻璃体液。
   2. 将血液（1mL）和玻璃体样品（10-20μL）转移到微量离心管中，并在4°C下以5200× g 离心两个样品10分钟。
      注意:在成功均质化的情况下，玻璃体在离心后具有均匀的稠度。然而，在玻璃体稠度不均匀的情况下，从步骤2.2.1重复，增加均质时间。
   3. 从两个样品中收集上清液，并用PBS分别以1:10和1:20的比例稀释玻璃体和血浆样品。
3. 蛋白质定量和玻璃体血浆蛋白质比值
   1. 为了定量玻璃体和血浆样品中的蛋白质浓度，将5μL稀释的样品加入250μLBradford试剂中，充分混合，并在40分钟内读取590nm处的吸光度。
      注:如果样品的吸收值高于1.0，请进一步稀释样品并重复步骤2.2.3中的步骤。
   2. 将同一只大鼠的玻璃体蛋白水平归一化为血浆蛋白水平，并测量健康大鼠与糖尿病大鼠之间的折叠差异。

3. 荧光血管造影

1. FITC-葡聚糖₇₀₀₀₀ 染料注射液
   1. 使用3%异氟醚麻醉2至3个月大的糖尿病Wistar雄性大鼠以及年龄匹配的对照组（14至15周），并确认踏板戒断反射（脚趾捏）。将尾巴浸入装有温水（37-40°C）的烧杯中。在注射染料之前，用70%乙醇清洁尾部。定位尾部的侧静脉，并在尾部的下部标记注射位置。
      注意:如果针的插入失败，请尝试插入当前位置上方的另一个位置（尖端到尾部底部）。然而，建议注射一次，因为反复刺痛可能导致大鼠的压力发展，这可能导致血管收缩。
   2. 通过尾静脉注入1 mL 50 mg / mL FITC-葡聚糖₇₀₀₀₀ 染料溶液，让染料循环5分钟。用高剂量的戊巴比妥（150mg / kg）安乐死大鼠，通过腹膜内途径注射。没有可检测到的心跳在2-5分钟内确认死亡。如步骤1.1.1中提到的眼睛进行眼部眼部检查。
      注意:如果需要，眼睛可以固定在4%甲醛溶液中，不超过30分钟。
2. 平安装准备
   1. 为了准备平坦的支架，请准备好解剖工具以及载玻片和盖玻片。将眼睛放在装满冷却PBS的培养皿中，然后按照步骤1.2.2所述开始解剖眼睛。
   2. 现在将尖镊子的尖端放在巩膜和视网膜之间。沿着杯子的边缘轻轻移动它，确保视网膜在任何时候都不会附着在巩膜上。如果有任何障碍物，使用弯曲的微型剪刀沿着边缘慢慢切开该部分。
   3. 一旦确认视网膜没有从任何一侧连接到巩膜，在视盘附近切开，形成一个小孔，使视网膜完全脱离巩膜。将视网膜慢慢推入PBS溶液中，并在刮刀或镊子的帮助下将其放在干净的平玻片上。
   4. 使用微型剪刀或手术刀刀片，在视网膜组织中进行小切口，将其分成四个象限。确保切口距离中心视盘留下的孔至少2毫米，如图 1所示。
   5. 使用 0.2 mL 吸头从组织侧面取出多余的 PBS，而不会干扰平板支架。
   6. 将一滴防褪色安装介质（50 μL至100 μL）放在平面支架上，用盖玻片盖住，并在共聚焦显微镜下立即可视化。
      注:在整个过程中保持最小的光线。
3. 平面安装的可视化
   1. 在共聚焦显微镜的10倍物镜下可视化平面安装。执行切片扫描以将整个平面装载捕获为单个映像。瓷砖的数量取决于视网膜扁平支架的大小。此外，执行Z堆叠以可视化不同病灶中的静脉和动脉（Z-stack的首选大小为5μm，取决于哪个，Z堆叠步骤的数量会有所不同）。
   2. 使用PMT和HyD检测器，%增益分别为700-900和100-150。选择 FITC-葡聚糖染料的发射范围介于 510-530 nm 之间。

Results

视网膜组织学
在糖尿病视网膜中，视网膜细胞发生变性。此外，由于水肿²²，视网膜层的厚度增加。苏木精和曙红染色后获得的图像可用于细胞计数和不同层厚度的测量，如图 2 所示，使用ImageJ。

血液-视网膜屏障分解测定
由于糖尿病大鼠的BRB受损，泄漏变得突出，导致生物分子从血浆到视网膜和玻璃体的积累。在糖尿病大鼠中，与健康大鼠相比，从血浆到玻璃体的蛋白质泄漏率高出约三倍（图3）。可以使用任何试剂盒方法估计蛋白质，例如Lowry方法，联苯可宁酸（BCA）方法或Bradford方法（在本文中提到，第2.3节）。建议新鲜解剖眼睛，因为处理延迟可能导致玻璃体与视网膜的强烈粘附，使其难以分离。玻璃体与视网膜分离不当可能导致假阳性结果。

荧光血管造影
该技术...

Discussion

组织学
进行视网膜组织学检查以可视化视网膜细胞和层的形态变化。需要优化各种步骤，包括固定溶液的选择、固定持续时间、脱水和石蜡浸渍。组织大小不应超过3毫米，因为固定剂渗透变得缓慢。常用的4%多聚甲醛即使在健康的眼睛中也会导致视网膜脱离，因为与房水和玻璃体房相比，溶液的渗透压相对较高，从而导致假阳性结果²³。溶液的高渗透压导致体积收缩并导致组织收缩。该方案中使用的固定溶液是1%甲醛和1.25%戊二醛，其渗透压相对较小，减少组织变形，最大限度地减少视网膜色素上皮层的脱落，并且还保持其天然状态的结构。固定溶液的另一种选择是乙酸和乙醇与甲醛。固定溶液的酸性条件可以帮助组织的快速固定，而乙醇改善固定溶液的渗透。然而，优化乙醇和乙酸的比例至关重要，因为过量的浓度可能分别导致组织收缩或肿胀²⁴。成功组织固定的评估参数包括视网膜脱离、视网膜层完整和组织收缩。进行固定时的另一个关键因素是固定溶液的体积，其大小应至少为眼睛大小的20至25倍才能正确固定²⁵。此外，重要的是，每当...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
组织学
试剂
Isoflurane	Abbott		麻醉剂
盐酸氯胺酮	Troikaa Pharmaceuticals 麻醉		剂
甲苯噻嗪	印度免疫学有限公司		麻醉剂
戊巴比妥钠	Zora Pharma		安乐死剂
固定液（1% 甲醛、1.25% 戊二醛	HiMedia、Avra	MB059、ASG2529	内部制备
的乙醇	Hayman	F204325	脱水
二甲苯	HiMedia	MB-180	清除乙醇或石蜡
蜡	HiMedia	GRM10702	用于包埋组织
甘油	HiMedia	TC503	制备白蛋白包被的载玻片。甘油和蛋清蛋白以 1：1 的比例混合，包被在载玻片上
盐酸	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	用于制备 1 % 酸性醇
酸	HiMedia	AS119	用于制备伊红
Scotts 水	Leica	3802900	蓝光试剂
巴氏菌溶液 1b 苏木精溶液	Sigma	1.09254.0500	细胞核染色
曙	HiMedia	GRM115	细胞质染色，制备 0.25 % 溶液内部
DPX 封片剂培养基	Sigma	6522	视网膜切片的可视化和保护
设备
玻璃器皿	Borosil
角膜钳	Stephens Instruments	S5-1200	解剖
Colibri 钳	Stephens Instruments	S5-1135	解剖
弯曲微型剪刀	Stephens Instruments	S7-1311	解剖
Vannas 剪刀	Stephens Instruments	S7-1387	解剖
鸢尾剪刀	Stephens Instruments	S7-1015	解剖
盒	HiMedia	PW1292	在组织学处理过程中固定组织
水浴	GT Sonic	GT Sonic-D9	保温
石蜡包埋站	Myr	EC 350	石蜡块的制备
切片机	郑州南北仪器设备有限公司	YD-335A	切片
刀片	徕卡	Leica Leica 818	切片
玻片	HiMedia	BG005	固定石蜡组织切片
盖玻片	HiMedia	BG014C	添加封固剂后覆盖组织
血液视网膜屏障 分解
试剂
Isoflurane	Abbott	B506	麻醉
干冰	不适用	不适用	解剖
Bradford 试剂	Sigma	B6916	蛋白质定量
设备
角膜钳	Stephens Instruments	S5-1200	解剖
Colibri 钳	Stephens Instruments	S5-1135	解剖
弯曲微型剪刀	Stephens Instruments	S7-1311	解剖
Vannas 剪刀	Stephens Instruments	S7-1387	解剖
鸢尾剪	Stephens Instruments	S7-1015	解剖
玻璃器皿	Borosil	不适用
EDTA 涂层管	J.K Diagnostics	不适用	从全血中分离血浆
匀浆管	MP Biomedicals	SKU：115076200-CF	玻璃
匀浆帽	MP Biomedicals	SKU：115063002-CF	均质
	MP Biomedicals	SKU：116914801	玻璃体的均质化
均质器	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	玻璃体
96 孔板	Grenier	GN655101	蛋白质定量
读板	器 分子设备	SpectrMax M4	吸光度测量
离心	REMI	CPR240 Plus	离心
<强>荧光血管造影
试剂
异氟醚	雅培	B506	麻醉
FITC-葡聚糖 70 kD（来自 Sigma 的 FITC、葡聚糖、二月桂酸二丁酯、DMSO	FITC、葡聚糖和二月桂酸二丁酯;来自 HiMedia 的 DMSO	FITC-F3651，右旋糖酐-31390，二月桂酸二丁酯-29123，DMSO-TC185	内部制备
荧光	Sigma	F6182	抗褪色封固剂
设备
角膜钳	Stephens Instruments	S5-1200	解剖
Colibri 钳	Stephens Instruments	S5-1135	解剖
弯曲微型剪刀	Stephens Instruments	S7-1311	解剖
Vannas 剪刀	Stephens Instruments	S7-1387	解剖
虹膜剪刀	Stephens Instruments	S7-1015	解剖
玻璃器皿	Borosil	不适用
载玻片	HiMedia	BG005	平板制备
盖玻片	HiMedia	BG014C	添加封固剂后覆盖组织
共聚焦显微镜	Leica	DMi8	平板平板可视化