大鼠模型中视网膜病理生理学评估

摘要

糖尿病视网膜病变是导致失明的主要原因之一。组织学、血-视网膜屏障破坏检测以及荧光血管造影是研究视网膜病理生理学的宝贵技术，这些技术可进一步提高针对糖尿病视网膜病变的高效药物筛选能力。

摘要

糖尿病视网膜病变等后节眼病会改变视网膜的生理状态。糖尿病视网膜病变的特征包括视网膜脱离、血-视网膜屏障（BRB）破坏以及视网膜血管新生。在体大鼠模型是研究视网膜结构与功能变化的重要实验工具。我们提出在大鼠模型中采用三种不同的实验技术，以识别视网膜细胞的形态学变化、视网膜血管系统以及受损的BRB。视网膜组织学用于研究各类视网膜细胞的形态；同时通过视网膜细胞计数及不同视网膜层厚度测量进行定量分析。BRB破坏检测用于评估因BRB破坏导致的血浆蛋白向玻璃体组织的渗漏情况。荧光血管造影则通过使用FITC-葡聚糖染料对视网膜血管系统进行可视化，以研究血管新生及血管渗漏情况。

引言

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最复杂的继发性并发症之一，也是全球劳动年龄人群中可预防性失明的首要原因。在一项近期针对3240万名盲人的荟萃分析中，有83万人（2.6%）因糖尿病视网膜病变而失明¹。2015年，全球范围内由糖尿病导致的视力丧失占比为1.06%（0.15–2.38），位居第七位^2,3。

糖尿病视网膜病变通过眼后部组织的血管异常进行诊断。临床上根据视网膜的血管状况将其分为两个阶段：非增殖性糖尿病视网膜病变（NPDR）和增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）。高血糖被认为是糖尿病视网膜病变的主要调控因素，因为它涉及多种与视网膜神经退行性变^4,5、炎症^6,7以及微血管系统⁸相关的通路。由高血糖引发的多种代谢紊乱包括晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累、多元醇通路、氨基己糖通路以及蛋白激酶C通路。这些通路在糖尿病视网膜病变的不同阶段分别导致细胞增殖（内皮细胞）、细胞迁移（周细胞）以及细胞凋亡（视网膜神经细胞、周细胞和内皮细胞）。这些代谢改变可引起一系列生理变化，如视网膜脱离、视网膜细胞丢失、血-视网膜屏障（BRB）破坏、动脉瘤以及血管生成⁹。

链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病在大鼠中是一种广泛建立且被普遍接受的研究模型，用于评估糖尿病的发病机制及其并发症。STZ的致糖尿病作用源于其对胰腺胰岛β细胞的选择性破坏¹⁰。因此，动物会出现胰岛素缺乏、高血糖、多饮和多尿等症状，这些均是人类1型糖尿病的典型特征¹¹。为诱导重度糖尿病，通常在成年期以40–65 mg/kg体重的剂量通过静脉或腹腔注射给予STZ。大约72小时后，这些动物的血糖水平将超过250 mg/dL^10,12。

为了理解神经退行性变、炎症和血管生成导致的视网膜生理改变，应在实验动物模型中优化不同的技术方法。视网膜细胞和视网膜血管的结构与功能变化可通过多种技术进行研究，例如组织学、血-视网膜屏障破坏检测以及荧光血管造影。

组织学涉及在显微镜下研究细胞、组织和器官的解剖结构，旨在建立细胞/组织结构与功能之间的关联。为了观察和识别组织结构的显微变化，进而比较正常与病变组织，需要完成多个步骤¹³。因此，必须严格标准化组织学的每一个步骤。视网膜组织学所包含的多个步骤主要有：标本固定、修块、脱水、透明、石蜡浸润、石蜡包埋、切片以及染色（苏木精和伊红染色）^13,14。

在健康的视网膜中，分子在视网膜内的转运由血-视网膜屏障（BRB）调控，该屏障由内侧的内皮细胞和周细胞以及外侧的视网膜色素上皮细胞组成。然而，在疾病状态下，内层BRB的内皮细胞和周细胞开始退化，导致BRB功能受损¹⁵。由于BRB的破坏，许多低分子量分子会渗漏至玻璃体和视网膜组织中¹⁶。随着疾病进展，由于稳态失衡，多种其他蛋白质分子（包括低分子量和高分子量）也会渗入玻璃体和视网膜组织¹⁷。这会导致多种并发症，最终引发黄斑水肿和失明。因此，通过定量分析玻璃体中的蛋白质水平，并比较健康状态与糖尿病状态下的差异，可评估BRB的受损程度。

荧光血管造影是一种利用荧光染料研究视网膜和脉络膜血液循环的技术。通过注射荧光素染料，可对视网膜和脉络膜的血管结构进行可视化观察。 通过 静脉注射途径或心脏注射¹⁸染料注射后，首先到达视网膜动脉，随后进入视网膜静脉。该染料循环过程通常在注射后5至10分钟内完成。¹⁹它是诊断多种眼后段疾病（包括糖尿病视网膜病变和脉络膜新生血管形成）的重要技术。²⁰有助于检测正常和疾病状态下主要及次要血管结构的变化。

方案

本方案遵循印度 BITS-Pilani 海得拉巴校区机构动物伦理委员会提供的所有动物护理指南。

1. 视网膜组织学

1. 眼球去核与固定
   1. 通过腹腔注射高剂量戊巴比妥（150 mg/kg）处死一只2至3月龄的糖尿病雄性Wistar大鼠，同时处死年龄匹配的对照组大鼠（14至15周龄）。注射后2-5分钟内心跳不可检测即确认死亡。
   2. 使用手术刀片在眼球的鼻侧和颞侧区域做切口，然后用镊子和显微剪刀沿边缘剪开，将眼球从眼眶中摘除。
      注意：在处死大鼠前，应提前准备好固定液。
      警告：甲醛对皮肤、眼睛、鼻腔和呼吸道具有刺激性，且因其为强效皮肤致敏剂，可能致癌。操作时应佩戴手套，并在通风橱中进行²¹。
   3. 将眼球置于培养皿中，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）充分清洗以去除血液。清除眼球周围多余的脂肪组织，以利于固定液充分渗透。
   4. 用镊子立即将眼球放入5 mL固定液中，确保其不粘附于玻璃瓶壁。轻轻搅动数秒后盖上瓶盖并做好标记。在室温避光条件下，将眼球在固定液中孵育24至48小时。
2. 组织修整
   1. 固定完成后，将眼球从固定液中取出，用10 mL PBS清洗，然后置于含有10 mL、4 °C预冷PBS的培养皿中。
   2. 用显微镊夹住带有视神经的眼球，借助显微剪刀在pars plana处做一小切口。沿角膜全周剪开，分离眼球前部杯状结构。用镊子轻轻取出晶状体并弃去，剪断视神经。
   3. 使用弯头显微剪刀沿视盘纵向将后部眼杯切成两半。将组织置于包埋盒底部，盖紧盒盖，确保组织不受扰动。在包埋盒上标注组织样本名称和日期。
3. 组织脱水、透明与石蜡浸润
   1. 将修整后的组织逐步转移至80 mL的50%、70%、90%和100%乙醇中进行脱水。每次转移包埋盒时，需在洁净的纸巾上轻蘸，以减少污染。
      注意：每次浓度下组织需静置30分钟（重复两次）。此步骤总耗时约4小时。
   2. 脱水完成后，将包埋盒转移至80 mL二甲苯中，每次30分钟，共两次，以置换组织中的乙醇。
      注意：经二甲苯孵育后，组织将变得半透明。
      警告：二甲苯为含苯环的芳香族化合物，对眼睛和黏膜具有刺激性，可能引起中枢神经系统抑制。
   3. 最后，使用60 °C预热的石蜡浸润组织，以置换组织中的二甲苯。将包埋盒在纸巾上多次轻蘸以减少残留二甲苯，然后置于200 mL液态石蜡（60 °C）中浸润2小时（1小时×2次）。
      ​警告：避免吸入熔化石蜡，因其会产生微小脂滴，可能引起呼吸道不适。
4. 石蜡包埋
   1. 使用前至少提前1小时开启石蜡包埋机，使石蜡熔化并让各工作站达到设定温度。将钢制模具置于加热板上，加入熔化石蜡，然后依次从石蜡容器中取出包埋盒。
   2. 将钢制模具从加热板移至低温表面（4 °C），此时模具内石蜡开始凝固。在完全凝固前，用镊子将组织放入石蜡中，并调整方向，使后部眼杯的视盘部分朝向模具底部。
      注意：确保组织位置固定且方向正确。若未达到理想状态，可将模具重新放回加热板，待石蜡完全液化后，重复步骤1.4.2。
   3. 当模具内石蜡开始凝固时，立即将包埋盒底座压在模具上方。小心地在包埋盒上缘以上补充石蜡，然后缓慢转移至低温表面（约-20 °C）以加速凝固。在凝固期间，重复步骤1.4.2处理其他包埋盒。
   4. 待所有模具完全凝固后，将钢制模具与包埋盒分离。若难以分离，可稍等片刻再尝试（切勿强行剥离）。完全凝固后分离更易进行。此时包埋盒成为石蜡块的基底，供切片机切片时固定使用。
      注意：此石蜡块可在室温下保存以备后续使用。此步骤完成后可暂停操作，后续再继续。
5. 切片
   1. 将一次性切片刀安装至刀架中。去除包埋盒周围的多余石蜡，使石蜡块上下表面与刀刃保持平行。将石蜡块安装至切片机的包埋盒夹持器上。
   2. 松开手轮，推进切片机直至石蜡块表面接触刀刃。修剪多余石蜡，直至组织在石蜡块表面可见。设定切片厚度为5 µm，连续切取5至6张切片形成切片带。
   3. 用镊子将切片带轻轻转移至预热的水浴表面（约50 °C），使其展开。用涂有梅氏明胶的载玻片从下方托起切片，轻轻提起后将载玻片水平放置，在37 °C下过夜干燥。
      ​注意：载玻片可在干燥盒中室温保存数月。此步骤完成后可暂停操作，后续再继续。
6. 染色
   1. 将待染色的载玻片置于60 °C恒温烘箱中加热1小时，使石蜡熔化，随后按照表1所述步骤进行染色。
      警告：苏木精和伊红染料在吸入或摄入时具有毒性，已被报道具有致癌性。

试剂	静置时间	重复次数（次数）
Xylene	5 min	2
100% Ethanol	5 min	2
90% Ethanol	5 min	2
70% Ethanol	5 min	2
50% Ethanol	5 min	2
Water	5 min	2
Hematoxylin	4 min	1
水洗
1% Acid alcohol in 70% Ethanol	30 s	1
水洗
Scott's water	1 min	1
水洗
50% Ethanol	1 min	1
95% Ethanol	1 min	1
0.25% Eosin	5 s	1
水洗
Water	2 min	1
95% Ethanol	1 min	1
100% Ethanol	1 min	1
Xylene	5 min	2
封片剂和盖玻片

表1. 苏木精和伊红染色步骤

2. 血脑屏障破坏检测

1. 血液和玻璃体液的采集
   1. 使用氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）对一只2至3月龄的糖尿病雄性Wistar大鼠以及年龄匹配的对照组大鼠（14至15周龄）进行麻醉。通过足底回缩反射（脚趾夹捏）确认麻醉状态。立即通过心脏穿刺采集1 mL血液至乙二胺四乙酸（EDTA）涂层管中，以从全血中分离血浆。
   2. 通过腹腔注射戊巴比妥高剂量（150 mg/kg）处死大鼠。2-5分钟内无法检测到心跳即确认死亡。摘除眼球并立即置于干冰上。
   3. 将眼球置于干冰上方的洁净培养皿中（推荐），并按照步骤1.2.2所述开始解剖眼球。
   4. 移除晶状体，使用显微镊子小心从后部杯状结构中取出玻璃体，并将其放入含有三到四个玻璃珠（2-4 mm）的匀浆管中。
      ​注意：推荐在干冰上进行解剖，因为在冷冻条件下移除晶状体和玻璃体会更加容易。
2. 样品制备
   1. 在珠磨匀浆器中以中等速度匀浆玻璃体液，持续10秒。
   2. 将血液（1 mL）和玻璃体样品（10-20 µL）转移至微量离心管中，在4 °C条件下以5200 x g 离心10分钟。
      ​注意：若匀浆成功，离心后玻璃体会呈现均匀一致的质地；若玻璃体质地不均，需从步骤2.2.1重复操作，并延长匀浆时间。
   3. 收集两个样品的上清液，并分别用PBS将玻璃体液和血浆样品按1:10和1:20的比例稀释。
3. 蛋白质定量及玻璃体-血浆蛋白比值
   1. 为测定玻璃体液和血浆样品中的蛋白质浓度，将5 µL稀释后的样品加入250 µL考马斯亮蓝试剂中，充分混匀，并在40分钟内于590 nm处读取吸光度。
      注意：若样品吸光度值超过1.0，则需进一步稀释样品，并从步骤2.2.3重复实验流程。
   2. 将同一动物的玻璃体蛋白水平归一化至其血浆蛋白水平，并比较健康大鼠与糖尿病大鼠之间的倍数差异。

3. 荧光血管造影

1. 注射 FITC-葡聚糖₇₀₀₀₀ 染料
   1. 使用 3% 异氟烷麻醉一只 2 至 3 月龄的糖尿病雄性 Wistar 大鼠，同时麻醉年龄匹配的对照组大鼠（14 至 15 周），并通过足底回缩反射（脚趾夹捏）确认麻醉效果。将大鼠尾巴浸入盛有温水（37–40 °C）的烧杯中。注射染料前用 70% 乙醇清洁尾巴。定位尾巴侧静脉，并在尾巴下部标记注射位置。
      注意：若针头插入失败，可尝试在当前位置上方的另一位置插入（从尾尖向尾根方向）。但建议仅注射一次，反复穿刺可能导致大鼠产生应激反应，从而引起血管收缩。
   2. 通过尾静脉注射 1 mL 浓度为 50 mg/mL 的 FITC-葡聚糖₇₀₀₀₀ 染料溶液，使染料循环 5 分钟。通过腹腔注射高剂量戊巴比妥（150 mg/kg）处死大鼠。2–5 分钟内无法检测到心跳即确认死亡。按照步骤 1.1.1 所述摘除眼球。
      注意：如有需要，可将眼球置于 4% 甲醛溶液中固定，但时间不得超过 30 分钟。
2. 平铺标本制备
   1. 制备平铺标本时，准备好解剖工具、载玻片和盖玻片。将眼球置于盛有冷 PBS 的培养皿中，并按照步骤 1.2.2 所述开始解剖眼球。
   2. 将尖头镊子的尖端插入巩膜与视网膜之间。沿杯状结构边缘轻轻移动，确保视网膜与巩膜在任何位置均无粘连。若存在阻碍，使用弯头显微剪刀沿边缘缓慢剪开该部分组织。
   3. 确认视网膜完全脱离巩膜后，在视盘附近剪开一小孔，使视网膜彻底与巩膜分离。缓慢将视网膜推入 PBS 溶液中，并借助刮铲或镊子将其转移至洁净的平载玻片上。
   4. 使用显微剪刀或手术刀片在视网膜组织上做轻微切口，将其分为四个象限。切口应距离中央视盘留下的孔洞至少 2 mm，如图 1 所示。
   5. 使用 0.2 mL 吸头从组织边缘吸除多余 PBS，注意不要扰动平铺标本。
   6. 在平铺标本上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂（50 µL 至 100 µL），加盖盖玻片，并立即在共聚焦显微镜下观察。
      注意：整个操作过程中应保持最低光照条件。
3. 平铺标本观察
   1. 在共聚焦显微镜下使用 10 倍物镜观察平铺标本。进行拼图扫描以将整个平铺标本作为单张图像采集。拼图数量取决于视网膜平铺标本的大小。同时进行 Z 轴层扫，以在不同焦平面上观察静脉和动脉（Z 轴层扫步长推荐为 5 µm，具体步数根据此设置而变化）。
   2. 分别将 PMT 和 HyD 探测器的增益百分比设置为 700–900 和 100–150。为 FITC-葡聚糖染料选择 510–530 nm 的发射波长范围。

结果

视网膜组织学
在糖尿病性视网膜中，视网膜细胞会发生变性。此外，由于水肿，视网膜各层的厚度会增加²²。通过苏木精和伊红染色后获得的图像可用于细胞计数以及测量不同视网膜层的厚度，如图2中使用ImageJ所示。

血-视网膜屏障破坏检测
由于糖尿病大鼠的血-视网膜屏障（BRB）受到破坏，屏障通透性显著增加，导致血浆中的生物分子渗漏至视网膜和玻璃体。在糖尿病大鼠中，血浆向玻璃体的蛋白质渗漏量约为健康大鼠的三倍（图3）。蛋白质含量可采用任意试剂盒方法进行测定，例如Lowry法、双辛可宁酸（BCA）法或Bradford法（本文第2.3节中提及）。建议新鲜解剖眼球，因为处理延迟可能导致玻璃体与视网膜之间发生强烈黏连，从而难以分离。若玻璃体与视网膜分离不当，可能导致假阳性结果。

荧...

讨论

组织学
视网膜组织学用于观察视网膜细胞和各层结构的形态学变化。多个步骤需要优化，包括固定液的选择、固定时间、脱水以及石蜡浸润。组织大小不应超过3 mm，否则固定液渗透速度会变慢。常用的4%多聚甲醛由于其渗透压相对房水和玻璃体较高，即使在健康眼内也可能导致视网膜脱离，从而产生假阳性结果²³。该溶液的高渗透压会导致体积收缩，引起组织皱缩。本方案所用的固定液为含1.25%戊二醛的1%甲醛溶液，其渗透压相对较低，可减少组织变形，最小化视网膜与视网膜色素上皮层之间的脱离，并更好地保持组织的天然结构。另一种可选的固定液是含有甲醛的乙酸和乙醇混合液。酸性环境有助于组织快速固定，而乙醇则可增强固定液的渗透能力。然而，乙醇与乙酸的比例必须优化，因为浓度过高可能分别导致组织皱缩或肿胀²⁴。评估组织固定效果的关键参数包括是否存在视网膜脱离、视网膜各层是否完整以及组织是否发生收缩。固定过程中另一个关键因素是固定液的体积，应至少为眼球体积的20至25倍，以确保充分固定²⁵。此...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织学
试剂
异氟烷	Abbott		麻醉剂
盐酸氯胺酮	Troikaa Pharmaceuticals		麻醉剂
赛拉嗪	Indian Immunologicals Limited		麻醉剂
戊巴比妥钠	Zora Pharma		安乐死试剂
固定液（1% 甲醛，1.25% 戊二醛）	HiMedia, Avra	MB059, ASG2529	自行配制
乙醇	Hayman	F204325	脱水
二甲苯	HiMedia	MB-180	乙醇或石蜡的透明化
石蜡	HiMedia	GRM10702	用于组织包埋
甘油	HiMedia	TC503	用于制备白蛋白包被载玻片。甘油与蛋清白蛋白按1:1比例混合后涂于载玻片
盐酸	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	用于配制1%酸性乙醇
乙酸	HiMedia	AS119	用于配制伊红染液
Scott水	Leica	3802900	蓝化试剂
Papanicolaou溶液1b 苏木精溶液	Sigma	1.09254.0500	细胞核染色
伊红	HiMedia	GRM115	细胞质染色，0.25%溶液为自行配制
DPX封片介质	Sigma	6522	视网膜切片的观察与保护
仪器设备
玻璃器皿	Borosil
角膜镊	Stephens Instruments	S5-1200	解剖
Colibri镊	Stephens Instruments	S5-1135	解剖
弯头显微剪	Stephens Instruments	S7-1311	解剖
Vannas剪	Stephens Instruments	S7-1387	解剖
虹膜剪	Stephens Instruments	S7-1015	解剖
包埋盒	HiMedia	PW1292	组织在组织学处理过程中用于固定组织
水浴锅	GT Sonic	GT Sonic-D9	温度维持
石蜡包埋工作站	Myr	EC 350	石蜡块制备
切片机	Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.	YD-335A	切片
刀片	Leica	Leica 818	切片
载玻片	HiMedia	BG005	承载石蜡-组织切片
盖玻片	HiMedia	BG014C	加入封片介质后覆盖组织
血-视网膜屏障破坏
试剂
异氟烷	Abbott	B506	麻醉
干冰	不适用	不适用	解剖
Bradford试剂	Sigma	B6916	蛋白质定量
仪器设备
角膜镊	Stephens Instruments	S5-1200	解剖
Colibri镊	Stephens Instruments	S5-1135	解剖
弯头显微剪	Stephens Instruments	S7-1311	解剖
Vannas剪	Stephens Instruments	S7-1387	解剖
虹膜剪	Stephens Instruments	S7-1015	解剖
玻璃器皿	Borosil	不适用
EDTA抗凝管	J.K Diagnostics	不适用	从全血中分离血浆
匀浆管	MP Biomedicals	SKU: 115076200-CF	玻璃体匀浆
匀浆管帽	MP Biomedicals	SKU: 115063002-CF	玻璃体匀浆
玻璃珠	MP Biomedicals	SKU: 116914801	玻璃体匀浆
匀浆仪	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	玻璃体匀浆
96孔板 - 透明	Grenier	GN655101	蛋白质定量
酶标仪	Molecular devices	SpectrMax M4	吸光度测定
离心机	REMI	CPR240 Plus	离心
荧光血管造影
试剂
异氟烷	Abbott	B506	麻醉
FITC-葡聚糖 70 kD（FITC、葡聚糖、二丁基二月桂酸锡、DMSO）	FITC、葡聚糖和二丁基二月桂酸锡来自Sigma；DMSO来自HiMedia	FITC-F3651, Dextran-31390, Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185	自行配制
Fluoroshield	Sigma	F6182	抗荧光淬灭封片介质
仪器设备
角膜镊	Stephens Instruments	S5-1200	解剖
Colibri镊	Stephens Instruments	S5-1135	解剖
弯头显微剪	Stephens Instruments	S7-1311	解剖
Vannas剪	Stephens Instruments	S7-1387	解剖
虹膜剪	Stephens Instruments	S7-1015	解剖
玻璃器皿	Borosil	不适用
载玻片	HiMedia	BG005	平铺标本制备
盖玻片	HiMedia	BG014C	加入封片介质后覆盖组织
共聚焦显微镜	Leica	DMi8	平铺标本的观察