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方法文章

一种用于研究角膜伤口愈合的上皮擦伤模型

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DOI：

10.3791/63112

⸱

2021年12月29日

 ,  ,  ,  , 
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

本文内容

摘要

本文描述了一种使用环钻和钝性高尔夫球棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤伤口的实验方案。该角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，目前正被用于评估在疾病背景下受损的角膜伤口愈合情况。

摘要

角膜对视觉至关重要，约占眼球屈光力的三分之二。角膜在视觉功能中发挥关键作用，其透明性尤为关键。然而，由于角膜位于眼球表面，极易受到多种损伤，这些损伤可导致角膜透明性丧失，最终引发失明。针对这些损伤，有效的角膜伤口愈合对于维持角膜稳态、保持角膜透明性和屈光能力至关重要。当角膜伤口愈合受损时，角膜易发生感染、溃疡和瘢痕形成。鉴于角膜伤口愈合在维持角膜透明性和视力方面具有根本重要性，深入了解正常角膜伤口愈合过程是理解与感染和疾病相关的角膜愈合障碍的前提。为此，小鼠角膜损伤模型已被证明有助于进一步阐明在正常生理条件下角膜伤口愈合的机制。本文描述了一种使用环钻和钝性高尔夫棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤的实验方案。在此模型中，将直径为2 mm的圆形环钻置于角膜中央，用于界定伤口区域。谨慎使用高尔夫棒状刮匙去除上皮组织，形成一个圆形伤口，同时不损伤角膜上皮基底膜。随后发生的炎症反应表现为一系列特征明确的细胞和分子事件级联，这些事件对有效伤口愈合至关重要。这一简单的角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，已有大量文献报道，目前正被用于评估在疾病背景下受损的角膜伤口愈合情况。

引言

角膜是眼球前部透明的三分之一部分。角膜具有多种功能，包括保护眼球内部结构，以及形成一道结构屏障，防止眼部感染1。更重要的是，角膜对视觉至关重要，提供了眼球约三分之二的屈光力2,3。角膜在视觉中发挥关键作用的关键在于其透明性。然而，由于角膜位于眼球表面，日常容易遭受多种损伤，可能导致其屏障功能受损、透明度丧失，最终导致失明。角膜透明性的丧失是全球范围内视力障碍的主要原因之一4,5。角膜擦伤是急诊科（ER）就诊的常见原因，占所有与眼部相关急诊病例的一半6。据估计，美国每年有超过100万人遭受与眼部相关的损伤7。针对这些损伤，有效的角膜伤口愈合对于维持角膜稳态及其透明性和屈光功能至关重要。当角膜伤口愈合受损时，角膜易发生感染、溃疡和瘢痕形成8,9。此外，屈光手术日益普及也给角膜带来了独特的创伤性挑战10。鉴于角膜伤口愈合在维持角膜透明性和视力方面具有根本重要性，深入了解正常的角膜伤口愈合过程是理解与感染和疾病相关的角膜愈合障碍的前提。

为此，已开发出多种角膜伤口愈合的动物模型11,12,13,14,15。小鼠角膜伤口愈合模型已被证明有助于加深我们对正常生理条件下角膜伤口愈合机制的理解。在角膜伤口愈合研究中已采用多种不同类型的角膜伤口，每种模型均适用于探究伤口愈合过程的不同方面。角膜伤口愈合研究中最常见的伤口模型为机械性伤口模型和化学性伤口模型。化学性角膜伤口通常涉及在角膜上造成碱烧伤，适用于研究角膜溃疡、混浊和新生血管形成13。机械性角膜伤口则包括清创（擦伤）伤口和角膜切除伤口14,15,16。完整或破损的角膜上皮基底膜分别定义了清创伤口和角膜切除伤口。在清创伤口中，上皮基底膜保持完整；而在角膜切除伤口中，基底膜被破坏，穿透通常达到角膜前基质层。清创伤口最适用于研究角膜损伤后的再上皮化、上皮细胞增殖、免疫反应以及神经再生。而角膜切除伤口则最适用于研究角膜瘢痕形成14,15。

本文描述了一种使用环钻和钝性高尔夫球棒形刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤伤口的实验方案。这种简单的角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，已有大量文献报道，目前正被用于评估在疾病背景下受损的角膜伤口愈合能力17。

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方案

所有动物实验方案均经休斯顿大学和贝勒医学院机构动物照护与使用委员会批准。在小鼠的饲养与使用过程中，遵循了视力与眼科研究协会（ARVO）关于动物在视力与眼科研究中使用声明中所列的指导原则。

1. 准备

  1. 荧光素溶液的制备
    1. 通过将10 mg荧光素钠盐溶解于1 mL无菌生理盐水或无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制1%的荧光素溶液。
      注意：为避免微生物污染，应在使用当天或使用前一天配制荧光素钠溶液。若提前一天配制，需将荧光素溶液避光保存于4 °C。用铝箔包裹试管以防止光漂白。
    2. 将溶液分装成适合单次实验使用的等份。每只小鼠每个时间点使用1–1.5 µL荧光素溶液。使用以下公式计算单次实验所需分装体积：
      分装体积计算公式；公式包含小鼠数量、时间点；研究方法。
      注意：例如，若单次实验中研究6只小鼠，且在5个时间点监测伤口大小，则该实验所需的分装体积为：
      体积计算公式，1.5 × 6 × 5 = 45μL，用于稀释分析。
  2. 小鼠麻醉用氯胺酮/赛拉嗪混合液的配制。
    1. 配制10 mL混合液时，将2.0 mL氯胺酮（100 mg/mL）与1.0 mL赛拉嗪（20 mg/mL）混合，再加入7.0 mL无菌PBS。可在手术当天或前一天配制氯胺酮/赛拉嗪混合液。
      注意：除非特别说明，所有溶液均应在室温下使用。

2. 麻醉

  1. 称重小鼠（8-12周龄C57BL/6野生型小鼠），以确定所需麻醉剂的合适剂量。使用双手固定法固定和操作小鼠，以便注射麻醉剂18。腹腔内注射（i.p.）氯胺酮/赛拉嗪混合液，终浓度为每千克体重80 mg氯胺酮和8 mg赛拉嗪。
  2. 在对小鼠进行角膜损伤操作前，需等待其完全麻醉。通过轻捏脚趾后观察足底反射来评估麻醉深度。当达到充分麻醉时，轻捏脚趾不应引起小鼠移动。
    ​注意：由于小鼠在麻醉期间会迅速丧失体温，因此提供热源以防止低体温至关重要。在麻醉及恢复期间，应将小鼠置于加热装置（加热垫）上。

3. 角膜伤口的制备

  1. 仅损伤右眼或左眼。在不同小鼠之间操作时，应保持所选眼睛（左眼或右眼）的一致性。
    注意：由于角膜擦伤会损伤角膜神经并降低视力，双侧眼损伤可能导致显著的不适和视觉障碍。由于镇痛药物可能抑制炎症反应，在研究角膜炎症机制的某些实验中使用镇痛剂可能会引入混杂因素。本机构动物护理与使用委员会（IACUC）已批准在角膜损伤实验中避免使用镇痛药物。
  2. 创建角膜上皮损伤
    1. 在解剖显微镜下，使用直径为2 mm的角膜环钻（见图1）标记角膜中央区域，用拇指和食指拉开眼睑以保持眼睛充分睁开。轻轻旋转环钻，在角膜上皮表面留下压痕。
      注意：使用环钻时需避免施加过大压力，否则可能导致角膜穿孔。同时应注意将环钻置于中央位置，可利用瞳孔作为解剖标志来确定角膜中心。
    2. 在解剖显微镜下，将钝性高尔夫球棒状刮刀（见图1）以约45°角置于环钻标记区域内的角膜表面。在标记区域内，小心且连续地用刮刀刮除上皮组织，以完成上皮清创。
      注意：清创过程中切勿施加过大力量，以免导致角膜穿孔。小鼠眼睛在操作过程中可能变干，增加清创难度。此时可在眼球表面滴加无菌PBS，以维持角膜的最佳湿润状态。

手术器械：2.0 mm 钻孔器和钝性高尔夫棒，显示清创设备。
图 1：2 mm 钻孔器和钝性高尔夫棒。 钻孔器用于在角膜中央标记一个圆形区域，高尔夫棒用于去除标记区域内的上皮组织。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 伤口闭合与再上皮化的监测

  1. 用移液器将 1-1.5 µL 的 1% 荧光素溶液滴加至损伤表面，并使用配备蓝光光源的数码显微镜对角膜成像。
  2. 在加入荧光素溶液后的第一分钟内获取图像，以避免溶液扩散至周围上皮组织，导致伤口面积被高估。在特定时间点（即 0 h、12 h、18 h、24 h 和 30 h）对受损角膜进行成像。
    注意：在所有时间点，成像均在麻醉条件下进行；造伤时使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉，后续时间点则使用异氟烷麻醉。在伤口愈合监测期间，小鼠需单独饲养于不同笼中。若将小鼠同笼饲养，它们倾向于舔舐同窝小鼠的眼睛，该行为已被证明会影响多种组织的伤口愈合19,20。
  3. 分析所采集的图像，使用图像分析软件勾画并测量伤口面积。各时间点的伤口面积以 0 h 时原始伤口面积的百分比表示。

5. 免疫荧光成像与分析

  1. 在损伤后的预定时间点，采用经IACUC批准的方法（本实验中为过量二氧化碳安乐死，随后行颈椎脱位）处死小鼠。
  2. 用虹膜弯剪轻轻按压外眦部，使眼球突出，将剪刀伸至眼球后方，牢固夹住视神经并剪断，从而完整摘除眼球。
  3. 将每个眼球置于含1 mL 1×PBS和2%多聚甲醛的溶液中，室温固定1小时，随后用1 mL 1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
  4. 在解剖显微镜下，使用手术刀在距角膜缘约500 µm的巩膜处做切口，并切开眼球壁。用镊子轻轻将虹膜组织从角膜上分离，然后小心修剪去除巩膜组织，注意保留角膜缘结构完整。
  5. 从角膜周边向中心做四个部分径向切口，每个切口长约1 mm，但不贯穿中心，以便角膜展平。
  6. 将角膜置于含1 mL 1×PBS、2%牛血清白蛋白（BSA）和0.01% Triton X-100的溶液中，室温透化和封闭15分钟，随后在含2% BSA的1×PBS中继续封闭45分钟。
  7. 将角膜在4 °C下与直接标记的特异性荧光染料偶联抗体混合液（溶于含2% BSA的1×PBS中）孵育过夜。
    注：抗体用于标记特定细胞和组织。例如，内皮细胞、中性粒细胞和血小板分别使用抗CD3121,22、抗Ly-6G23,24和抗CD4125,26抗体进行标记。在抗体混合液中加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）以显示细胞核。
  8. 孵育结束后，用1×PBS洗涤角膜3次，每次15分钟。
  9. 将角膜置于载玻片上的抗荧光淬灭封片液滴中，加盖盖玻片，使用荧光显微镜以所需放大倍数（4×至100×物镜）进行成像。按照图2A所示区域，采集角膜不同部位的全层图像。
    注：图2A所示的显微分析模式用于评估炎症反应和细胞分裂的区域性变化。DAPI和Ly-6G染色联合使用可识别血管外中性粒细胞。DAPI染色下，球形中性粒细胞的细胞核呈明显的马蹄形或环形（图2B）。

角膜区域示意图与显微镜荧光图像；细胞结构及断面分析。
图 2：中央刮伤后角膜成像策略及中性粒细胞浸润情况。 （A）角膜全层铺片的示意图，显示跨越角膜直径的九个显微视野。灰色区域代表原始伤口区域。每个区域的宽度为 500 µm。（B）注意经 DAPI 染色后中性粒细胞核呈现明显的马蹄形或环形结构。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

图3 显示了使用钝头高尔夫球杆尖端工具制造的角膜伤口的透射电子显微照片，证明了上皮基底膜在损伤后确实保持完整。

细胞膜结构，电子显微镜图像显示在5 µm尺度下的层状结构和微绒毛。
图3：角膜擦伤后上皮基底膜保持完整。 使用钝性高尔夫球杆头制造的角膜伤口的透射电子显微镜图像。箭头指示位于伤口周围残留上皮下方的基底膜，而箭头则指示脱失区域中的基底膜。该图像显示了从未擦伤区域到擦伤区域角膜基底膜的连续性，表明清创术后基底膜仍保持完整。

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讨论

本方法学论文的目的是描述一种使用环钻和钝性高尔夫球棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤创面的实验方案。该小鼠模型已被用于研究角膜炎症及其在伤口愈合过程中的作用。此类模型可用于在正常生理条件以及病理状态下研究角膜伤口愈合的机制17,28,29,41,42。已有研究证明，该模型可用于病理条件下的角膜伤口愈合研究，例如在饮食诱导肥胖小鼠模型中观察到的角膜伤口愈合受损现象17。该模型的一个显著优势在于，它能够产生精确（2 mm）且可重复的上皮损伤范围，并准确定位于角膜中央，同时不破坏基底膜。这种角膜损伤模型操作简便、快速。除了钝性高尔夫球棒状刮匙29,39

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

基金支持：由美国国立卫生研究院（NIH）EY018239（A.R.B.、C.W.S. 和 R.E.R.）、P30EY007551（A.R.B.）以及Sigma Xi研究援助基金（P.K.A.）资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或Sigma Xi的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗CD31抗体BD Bioscience, Pharmingen550274
抗CD41抗体BD Bioscience, Pharmingen553847
抗Ly6G抗体BD Bioscience, Pharmingen551459
牛血清白蛋白（BSA）ThermoFisher ScientificB14
C57BL/6小鼠Jackson Laboratories664
DAPISigma AldrichD8417
DeltaVision宽场去卷积荧光显微镜GE Life Sciences
解剖显微镜Leica Microsystems
电子台秤（称重仪）Fisher Scientific
乙醇ThermoFisher ScientificT038181000CS
高尔夫球杆形刮匙Stephens InstrumentsS2-1135
虹膜弯剪Fisher Scientific31212
异氟烷Patterson Veterinary07-893-1389
氯胺酮Patterson Veterinary07-890-8598
磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisher ScientificAM9624
荧光素钠盐Sigma Aldrich46970
手术刀片（手术刀刀片）Fine Science Tools10022-00
环钻Integra Miltex33-31
吐温X-100Fisher Scientific50-295-34
镊子Fine Science Tools11923-13
赛拉嗪Patterson Veterinary07-808-1947

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