一种用于研究角膜伤口愈合的上皮擦伤模型

摘要

本文描述了一种使用环钻和钝性高尔夫球棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤伤口的实验方案。该角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，目前正被用于评估在疾病背景下受损的角膜伤口愈合情况。

摘要

角膜对视觉至关重要，约占眼球屈光力的三分之二。角膜在视觉功能中发挥关键作用，其透明性尤为关键。然而，由于角膜位于眼球表面，极易受到多种损伤，这些损伤可导致角膜透明性丧失，最终引发失明。针对这些损伤，有效的角膜伤口愈合对于维持角膜稳态、保持角膜透明性和屈光能力至关重要。当角膜伤口愈合受损时，角膜易发生感染、溃疡和瘢痕形成。鉴于角膜伤口愈合在维持角膜透明性和视力方面具有根本重要性，深入了解正常角膜伤口愈合过程是理解与感染和疾病相关的角膜愈合障碍的前提。为此，小鼠角膜损伤模型已被证明有助于进一步阐明在正常生理条件下角膜伤口愈合的机制。本文描述了一种使用环钻和钝性高尔夫棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤的实验方案。在此模型中，将直径为2 mm的圆形环钻置于角膜中央，用于界定伤口区域。谨慎使用高尔夫棒状刮匙去除上皮组织，形成一个圆形伤口，同时不损伤角膜上皮基底膜。随后发生的炎症反应表现为一系列特征明确的细胞和分子事件级联，这些事件对有效伤口愈合至关重要。这一简单的角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，已有大量文献报道，目前正被用于评估在疾病背景下受损的角膜伤口愈合情况。

引言

角膜是眼球前部透明的三分之一部分。角膜具有多种功能，包括保护眼球内部结构，以及形成一道结构屏障，防止眼部感染¹。更重要的是，角膜对视觉至关重要，提供了眼球约三分之二的屈光力^2,3。角膜在视觉中发挥关键作用的关键在于其透明性。然而，由于角膜位于眼球表面，日常容易遭受多种损伤，可能导致其屏障功能受损、透明度丧失，最终导致失明。角膜透明性的丧失是全球范围内视力障碍的主要原因之一^4,5。角膜擦伤是急诊科（ER）就诊的常见原因，占所有与眼部相关急诊病例的一半⁶。据估计，美国每年有超过100万人遭受与眼部相关的损伤⁷。针对这些损伤，有效的角膜伤口愈合对于维持角膜稳态及其透明性和屈光功能至关重要。当角膜伤口愈合受损时，角膜易发生感染、溃疡和瘢痕形成^8,9。此外，屈光手术日益普及也给角膜带来了独特的创伤性挑战¹⁰。鉴于角膜伤口愈合在维持角膜透明性和视力方面具有根本重要性，深入了解正常的角膜伤口愈合过程是理解与感....

方案

所有动物实验方案均经休斯顿大学和贝勒医学院机构动物照护与使用委员会批准。在小鼠的饲养与使用过程中，遵循了视力与眼科研究协会（ARVO）关于动物在视力与眼科研究中使用声明中所列的指导原则。

1. 准备

1. 荧光素溶液的制备
   1. 通过将10 mg荧光素钠盐溶解于1 mL无菌生理盐水或无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制1%的荧光素溶液。
      注意：为避免微生物污染，应在使用当天或使用前一天配制荧光素钠溶液。若提前一天配制，需将荧光素溶液避光保存于4 °C。用铝箔包裹试管以防止光漂白。
   2. 将溶液分装成适合单次实验使用的等份。每只小鼠每个时间点使用1–1.5 µL荧光素溶液。使用以下公式计算单次实验所需分装体积：
      
      注意：例如，若单次实验中研究6只小鼠，且在5个时间点监测伤口大小，则该实验所需的分装体积为：
      

结果

图3 显示了使用钝头高尔夫球杆尖端工具制造的角膜伤口的透射电子显微照片，证明了上皮基底膜在损伤后确实保持完整。

图3：角膜擦伤后上皮基底膜保持完整。 使用钝性高尔夫球杆头制造的角膜伤口的透射电子显微镜图像。箭头指示位于伤口周围残留上皮下方的基底膜，而箭头则指示脱失区域中的基底膜。该图像显示了从未擦伤区域到擦伤区域角膜基底膜的连续性，表明清创术后基底膜仍保持完整。

讨论

本方法学论文的目的是描述一种使用环钻和钝性高尔夫球棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤创面的实验方案。该小鼠模型已被用于研究角膜炎症及其在伤口愈合过程中的作用。此类模型可用于在正常生理条件以及病理状态下研究角膜伤口愈合的机制^{17,28,29,41,42}。已有研究证明，该模型可用于病理条件下的角膜伤口愈合研究，例如在饮食诱导肥胖小鼠模型中观察到的角膜伤口愈合受损现象¹⁷。该模型的一个显著优势在于，它能够产生精确（2 mm）且可重复的上皮损伤范围，并准确定位于角膜中央，同时不破坏基底膜。这种角膜损伤模型操作简便、快速。除了钝性高尔夫球棒状刮匙^29,39

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD31抗体	BD Bioscience, Pharmingen	550274
抗CD41抗体	BD Bioscience, Pharmingen	553847
抗Ly6G抗体	BD Bioscience, Pharmingen	551459
牛血清白蛋白（BSA）	ThermoFisher Scientific	B14
C57BL/6小鼠	Jackson Laboratories	664
DAPI	Sigma Aldrich	D8417
DeltaVision宽场去卷积荧光显微镜	GE Life Sciences
解剖显微镜	Leica Microsystems
电子台秤（称重仪）	Fisher Scientific
乙醇	ThermoFisher Scientific	T038181000CS
高尔夫球杆形刮匙	Stephens Instruments	S2-1135
虹膜弯剪	Fisher Scientific	31212
异氟烷	Patterson Veterinary	07-893-1389
氯胺酮	Patterson Veterinary	07-890-8598
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	AM9624
荧光素钠盐	Sigma Aldrich	46970
手术刀片（手术刀刀片）	Fine Science Tools	10022-00
环钻	Integra Miltex	33-31
吐温X-100	Fisher Scientific	50-295-34
镊子	Fine Science Tools	11923-13
赛拉嗪	Patterson Veterinary	07-808-1947