方法文章

人类诱导多能干细胞及其神经和胶质分化衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

DOI：

10.3791/63116

⸱

2021年11月8日

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本研究报道了一种基于流式细胞术和两种荧光报告分子或抗体双重染色的新型方法，用于测量多种线粒体功能参数，以检测线粒体体积、线粒体膜电位、活性氧水平、线粒体呼吸链组成以及线粒体DNA的变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体在多种神经退行性疾病的病理生理过程中具有重要作用。线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）、活性氧（ROS）的线粒体生成以及线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的变化，通常是这些过程的特征。本报告详细介绍了一种基于流式细胞术的新方法，用于在不同细胞类型（包括人诱导性多能干细胞（iPSCs）以及iPSC来源的神经细胞和胶质细胞）中同时检测多个线粒体参数。该基于流式细胞术的策略利用活细胞检测线粒体体积、MMP和ROS水平，同时利用固定细胞评估线粒体呼吸链（MRC）组分以及与mtDNA相关的蛋白（如线粒体转录因子A（TFAM））。

通过与荧光报告分子共染色，包括MitoTracker Green（MTG）、四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和MitoSox Red，可定量分析线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）以及线粒体活性氧（ROS）的变化，并将其与线粒体含量相关联。使用针对线粒体呼吸链（MRC）复合物亚基和外膜转位酶20（TOMM20）的抗体进行双重染色，可评估MRC亚基的表达水平。由于TFAM的含量与线粒体DNA（mtDNA）拷贝数成正比，因此通过测定单位TOMM20所对应的TFAM含量，可间接反映单位线粒体体积内的mtDNA含量。整个实验流程可在2–3小时内完成。重要的是，这些实验方案可通过流式细胞术，对线粒体参数在总体水平以及单位线粒体体积的特异性水平上进行定量检测。

引言

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线粒体是几乎存在于所有真核细胞中的重要细胞器。线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP），为细胞提供能量，并作为生物合成和代谢过程中的代谢中间体。线粒体还深度参与多种其他重要的细胞过程，例如活性氧（ROS）的生成、细胞死亡以及细胞内 Ca2+ 的调节。线粒体功能障碍与多种神经退行性疾病相关，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）、弗里德赖希共济失调（FRDA）以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）1。线粒体功能障碍加剧以及线粒体DNA（mtDNA）异常也被认为是人类衰老的重要促成因素2,3。

神经退行性疾病中存在多种类型的线粒体功能障碍，线粒体体积改变、线粒体膜电位（MMP）去极化、活性氧（ROS）产生以及线粒体DNA拷贝数变化均较为常见4,5,6,7。因此，在研究疾病机制和测试潜在治疗药物时，能够检测这些及其他线粒体功能指标具有重要意义。此外，鉴于目前尚缺乏能真实模拟人类神经退行性疾病的动物模型，建立能够在脑细胞中重现人类疾病特征的合适体外（in vitro）模型系统，是深入理解这些疾病并开发新疗法的重要步骤2,3,8,9。

人类诱导多能干细胞可用于生成多种脑细胞，包括神经元和非神经元细胞（即胶质细胞），且在两类细胞中均发现与神经退行性疾病相关的线粒体损伤3,10,11,12,13. 存在将iPSC分化为神经和胶质细胞谱系的适当方法14,15,16这些细胞为人类/患者提供了一个独特的研究平台 体外 疾病建模与药物筛选。此外，由于这些细胞来源于患者，由诱导多能干细胞（iPSC）分化而来的神经元和胶质细胞能够更准确地反映人体内实际发生的疾病状况。

迄今为止，可用于测量诱导多能干细胞（iPSCs）中多个线粒体功能参数的便捷且可靠的方法仍然较少，尤其是在活神经元和胶质细胞中的应用。流式细胞术为科研人员提供了一种强大的工具，可用于在单细胞水平上检测包括线粒体功能在内的多种生物学参数。本实验方案详细介绍了如何从iPSCs诱导生成多种类型的脑细胞，包括神经干细胞（NSCs）、神经元以及胶质星形细胞，并介绍了基于流式细胞术的新型方法，用于在不同细胞类型（包括iPSCs及其衍生的神经细胞和胶质细胞）中同时检测多个线粒体功能参数。该方案还提供了一种共染色策略，可通过流式细胞术检测线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）、线粒体活性氧（ROS）水平、线粒体呼吸链（MRC）复合物以及线粒体转录因子A（TFAM）。通过引入线粒体体积或质量的测量，这些方法还可分别评估线粒体功能参数的总量水平以及单位线粒体的特异性水平。

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方案

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注意：本方案中使用的所有培养基和溶液的配方，请参见材料表和补充表 S1。

1. 将人iPSCs分化为NCSs、多巴胺能（DA）神经元和星形胶质细胞

  1. 准备基质包被的培养板。
    1. 将一管5 mL的基质在冰上过夜解冻。用99 mL冷的高级DMEM/F12培养基（Advanced DMEM/F12）稀释1 mL基质（终浓度为1%）。分装成每份1 mL，于-20 °C保存。
    2. 在4 °C条件下解冻基质溶液（保持低温），并在6孔板中每孔加入1 mL，包被6个孔。
    3. 将包被好的培养板置于37 °C、含5% CO2/95%空气的湿润化培养箱中孵育1小时。取出培养板，使其平衡至室温（RT）。
      ​注意：建议在包被后3天内使用该培养板。然而，包被后的培养板可在4 °C保存最多2周。使用前需提前取出并恢复至室温。对于长期储存，向包被板中加入1 mL iPSC培养基以防止基质干燥。
  2. iPSC的解冻
    1. 将基质包被的培养板在室温或37 °C培养箱中预热20–30分钟。同时将所需量的iPSC培养基在室温下预热。
    2. 将6 mL预热的iPSC培养基与12 µL Y-27632 ROCK抑制剂混合，获得终浓度为10 µM的溶液。
    3. 将冻存的iPSC冻存管在37 °C水浴中部分解冻，直至管中仅剩少量冰晶。
    4. 缓慢地将含12 µL ROCK抑制剂的1 mL预热iPSC培养基逐滴加入细胞中。使用5 mL移液器将冻存管中的液体内容物逐滴转移至6孔预包被培养板的一个孔中。
    5. 将培养板沿垂直方向轻轻晃动以混匀孔内液体，然后放回培养箱。24小时后更换iPSC培养基，更换前用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）（1×）（无Ca2+/Mg2+）洗涤（每孔4 mL，6孔板）。
      注意：后续换液时不再添加ROCK抑制剂。iPSC培养基需每日更换。
  3. iPSC的传代培养
    1. 将基质包被的培养板在室温或37 °C培养箱中预热20–30分钟。将所需量的iPSC培养基在室温下预热。
    2. 吸除含细胞的培养板中的培养基。用DPBS（1×）（无Ca2+/Mg2+）（每孔4 mL，6孔板）冲洗iPSC。
    3. 每孔加入EDTA（0.5 mM）（每孔1 mL，6孔板）。将培养板在37 °C孵育，直至克隆边缘开始从孔底脱离（通常为3–5分钟）。吸除EDTA溶液。
    4. 加入预热的iPSC培养基（每孔4 mL，6孔板），使用10 mL无菌移液器用力吹打一次，使iPSC克隆脱落。避免反复吹打，以免将细胞团块打散为单细胞。
    5. 将每孔内容物转移至两个独立的基质包被6孔板孔中（每孔2 mL，6孔板），并在37 °C孵育。移液过程中避免产生气泡。
      注意：放入培养箱前轻轻摇晃培养板。传代比例可为1:2（一孔传至两个新孔）至1:4（一孔传至四个新孔）。
    6. 每日更换培养基，直至克隆达到60%汇合度，并具有良好的大小和连接性。
  4. 神经诱导与神经前体细胞生成
    1. 准备500 mL化学成分确定培养基（CDM）、500 mL神经诱导培养基（NIM）和500 mL神经干细胞无血清培养基（NSC SF medium）。
    2. 用DPBS（1×）（无Ca2+/Mg2+）（每孔4 mL，6孔板）冲洗细胞，每孔加入NIM（3 mL，6孔板）。设定为第0天。
    3. 在第1、3、4天更换NIM（每孔3 mL，6孔板），并每日在显微镜下观察。
    4. 第5天，将神经玫瑰花环结构解离为悬浮培养，具体步骤如下：
      1. 用DPBS（1×）（无Ca2+/Mg2+）（每孔4 mL，6孔板）轻柔洗涤一次。每孔加入胶原酶IV（1 mL，6孔板），在培养箱中孵育1分钟。吸除胶原酶IV，并用DPBS（1×）（每孔4 mL，6孔板）轻柔洗涤一次。
      2. 向6孔板每孔加入2 mL NSC SF培养基。使用200 µL移液器枪头在孔底划网格的方式刮取细胞，使其脱落。
      3. 将6孔板中的细胞悬液收集至10 cm非黏附培养皿中。用NSC SF培养基补足体积至12 mL。
      4. 将非黏附培养皿置于培养箱内的旋转摇床上，以65–85 rpm速度摇动，防止细胞聚集。
  5. 多巴胺能神经元分化
    1. 第7天，加入含100 ng/mL成纤维细胞生长因子-8b（FGF-8b）的12 mL CDM，并将培养皿置于培养箱内的旋转摇床上。
    2. 第8–13天，每2天更换一次培养基，并每日在显微镜下观察。
    3. 第14天，加入含100 ng/mL FGF-8b和1 µM purmorphamine（PM）的12 mL CDM，并将培养皿置于培养箱内的旋转摇床上。
    4. 第15–20天，每2天更换一次培养基，并每日在显微镜下观察细胞。
    5. 使用1000 µL枪头机械传代球状体，将较大的球体打碎。
      注意：传代比例可为1:2（一个培养皿传至两个新培养皿）。
  6. 终止分化
    1. 使用多聚-L-鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白包被6孔板或盖玻片，步骤如下：
      1. 每孔加入1 mL PLO包被6孔板，在37 °C孵育20分钟。吸除PLO溶液。
      2. 将培养板置于紫外线下灭菌20分钟。用DPBS（1×）（每孔4 mL，6孔板）冲洗孔两次。
      3. 向每孔加入5 µg/mL层粘连蛋白溶液（每孔1 mL，6孔板），在37 °C孵育2小时。吸除层粘连蛋白溶液，接种前用DPBS（1×）（每孔4 mL，6孔板）快速洗涤一次。
    2. 将所有球状体（来自步骤1.5.5）收集至50 mL离心管中，并用DPBS（1×）补足体积。在300 × g条件下离心5分钟。吸除上清液。
    3. 加入2 mL细胞解离试剂（见材料表），在37 °C水浴中孵育10分钟，随后用200 µL移液器轻柔吹打20–50次（根据球体大小调整次数，避免产生气泡）。
    4. 用含10%胎牛血清（FBS）的2 mL DMEM中和细胞解离试剂，将含细胞的50 mL离心管在室温下以300 × g离心5分钟。吸除上清液。
    5. 加入1 mL含10 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）和10 ng/mL胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）的CDM，通过轻柔吹打重悬细胞沉淀，获得单细胞悬液。
    6. 吸除培养板中的层粘连蛋白溶液（步骤1.6.1.3），用DPBS（1×）（每孔4 mL，6孔板）快速洗涤一次，然后将细胞（来自步骤1.6.5）接种至预包被的培养板或盖玻片中，使用含10 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF的3 mL CDM。每4天换液一次。
      注意：分化培养物可维持数周至3个月。通常在终止分化后2周出现神经元形态，此后可用于下游分析。对于长期维持培养（最长2个月），BDNF和GDNF并非必需。
  7. NSC的生成
    1. 包被基质培养板。
    2. 将所有神经球（来自步骤1.4）收集至50 mL离心管中，并用DPBS（1×）（无Ca2+/Mg2+）补足体积。在300 × g条件下离心5分钟。吸除上清液。
    3. 将细胞沉淀与2 mL细胞解离试剂在37 °C水浴中孵育10分钟，随后用200 µL移液器轻柔吹打20–50次（根据球体大小调整次数，避免产生气泡）。
    4. 用含10% FBS的2 mL DMEM中和，将含细胞的50 mL离心管在室温下以300 × g离心5分钟。吸除上清液。通过轻柔吹打重悬细胞沉淀，获得单细胞悬液。
    5. 吸除预包被板中的基质溶液 ，将细胞接种至预包被板中，使用NSC SF培养基（每孔3 mL，6孔板）。每2–3天换液一次，细胞汇合时进行传代。
      注意：从此阶段起，NSC可进行扩增和冻存。
  8. 胶质星形细胞分化
    1. NSC向星形细胞分化
      1. 准备500 mL星形细胞分化培养基。
      2. 将NSC接种于多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养板/盖玻片上，使用NSC SF培养基。 
      3. 次日，用DPBS（1×）（无Ca2+/Mg2+）（每孔4 mL，6孔板）冲洗细胞，每孔加入星形细胞分化培养基（3 mL，6孔板）。设定为第0天。
      4. 每日在显微镜下观察NSC，并从第1天至第27天每2天更换一次星形细胞分化培养基（每孔3 mL，6孔板）。
    2. 星形细胞成熟
      1. 准备星形细胞成熟培养基。
      2. 第28天，用DPBS（1×）（每孔4 mL，6孔板）冲洗细胞，每孔加入星形细胞成熟培养基（3 mL，6孔板）。
      3. 从第29天起，每日在显微镜下观察细胞，并每2天更换一次星形细胞成熟培养基（每孔3 mL，6孔板）。
      4. 成熟一个月后，从此阶段起可对细胞进行扩增和冷冻保存。
        ​注意：在此阶段，细胞数量将增加。传代时，培养过程中无需使用PDL包被的盖玻片。

2. 通过免疫细胞化学和免疫荧光染色对细胞进行表征

  1. 培养期结束后，将带有细胞的盖玻片转移至12孔板中。
    用磷酸盐缓冲液（PBS）（1×）清洗细胞两次，每次清洗后在室温下用4%多聚甲醛（PFA）（每孔0.5 mL）孵育10分钟。
    注意：固定后的样品可覆盖2 mL PBS（1×），于4 °C保存，待后续进行免疫染色时使用。PFA具有毒性，可能致癌。避免皮肤和眼睛接触，并在通风橱中操作。
  2. 用封闭液对细胞进行封闭和通透处理，封闭液含PBS（1×）、0.3% Triton X-100和10%正常山羊血清，室温孵育1小时。
  3. 加入一抗溶液，在4 °C孵育过夜：使用抗八聚体结合转录因子4（Oct4）和抗阶段特异性胚胎抗原4（SSEA4）染色iPSCs；使用抗Y染色体性别决定区蛋白2（Sox2）和抗Nestin染色NSCs；使用抗配对盒蛋白6（Pax6）和抗Nestin染色神经球；使用抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和抗S100钙结合蛋白β（S100β）染色星形胶质细胞；使用抗酪氨酸羟化酶（TH）、抗β III微管蛋白（Tuj 1）、抗突触素（Synaptophysin）和抗突触后密度蛋白95（PSD-95）染色多巴胺能神经元（每孔加入0.5 mL一抗溶液，置于12孔板中；具体信息见材料表）。
  4. 用PBS（1×）洗涤样品三次，每次10分钟，轻轻振荡。
  5. 加入二抗溶液（按1:800比例稀释于封闭液中，每孔0.5 mL Alexa Fluor标记二抗溶液，置于12孔板中），室温避光孵育1小时，轻轻振荡。
  6. 加入Hoechst 33342（1:5,000，每孔0.5 mL）溶于PBS（1×）中，室温孵育15分钟，以标记细胞核。
  7. 用封片剂封片，室温避光干燥过夜，随后在荧光显微镜下成像。显微镜设置与参数详见补充图S1。

3. 活细胞中线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）及线粒体活性氧的流式细胞术检测

  1. 将细胞分别接种至6孔板中的4个孔内，培养至细胞融合度达到50%–60%。将这四个孔分别标记为#1、#2、#3和#4。
  2. 培养结束后，配制5种不同的染色液（每孔500 µL，用于6孔板）：#1仅含培养基（加入含细胞的#1孔，作为对照）；#2-1含FCCP（100 µM）；#2-2含FCCP（100 µM）、TMRE（100 nM）和MTG（150 nM）的培养基；#3含TMRE（100 nM）和MTG（150 nM）的培养基；#4含MitoSox Red（10 µM）和MTG（150 nM）的PBS（1×）溶液（含10% FBS）。有关这些化合物及流式细胞仪设置的详细信息，请参见图1A、补充表S2和材料表。
    注意：使用培养基配制染色液。使用前将培养基和PBS（1×）恢复至室温。FCCP具有毒性，避免接触皮肤和眼睛，应在化学通风橱中操作。
  3. 吸除#2孔中的培养基，加入#2-1溶液（仅含FCCP）。37 °C孵育10分钟。
  4. 吸除#2和#3孔中的培养基，向#2孔加入#2-2溶液（FCCP + TMRE + MTG），向#3孔加入#3溶液（TMRE + MTG）。37 °C孵育45分钟。
  5. 吸除#4孔中的培养基，加入#4溶液（MitoSox Red + MTG）。37 °C孵育15分钟。
  6. 吸除所有孔中的培养基，用PBS（1×）洗涤（每孔4 mL，用于6孔板）。加入1 mL细胞解离试剂（每孔1 mL，用于6孔板），37 °C作用5分钟使细胞脱落。加入含10% FBS的DMEM培养基1 mL（每孔共2 mL，用于6孔板）以中和细胞解离试剂。
  7. 将各孔中的细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中。300 × g离心5分钟。沉淀用PBS（1×）洗涤一次或两次。
  8. 吸除上清液，每管中残留约100 µL液体。将细胞沉淀重悬于300 µL PBS（1×）中，转移至1.5 mL微量离心管中。避光，室温保存。
  9. 使用配备3个蓝色激光和1个红色激光的流式细胞仪分析细胞。通过530/30带通滤光片在滤光通道1（FL1）检测MTG，通过585/40带通滤光片在滤光通道2（FL2）检测TMRE，通过510/580带通滤光片在滤光通道3（FL3）检测MitoSox Red。

4. 固定细胞中MRC复合物亚基和TFAM的流式细胞术检测

  1. 培养期结束后，加入细胞解离试剂使细胞脱落（约106个），然后在15 mL离心管中离心收集细胞。用PBS（1×）洗涤细胞，300 × g离心5分钟，重复两次。
  2. 在室温下用1.6%多聚甲醛（PFA）（15 mL离心管中加入1 mL 1.6% PFA）固定细胞10分钟。 用PBS（1×）洗涤细胞，300 × g离心5分钟，重复两次。
  3. 加入预冷的90%甲醇（15 mL离心管中加入1 mL 90%甲醇），在-20 °C条件下透化细胞20分钟。
  4. 用封闭缓冲液（含0.3 M甘氨酸、5%山羊血清和1%牛血清白蛋白（BSA）-第五组分的PBS（1×）溶液）在15 mL离心管中加入1 mL封闭缓冲液进行封闭。用PBS（1×）洗涤细胞两次（同步骤3.7）。
  5. 加入以下一抗溶液，孵育30分钟：用于检测复合物I亚基的抗NDUFB10抗体（1:1,000）、用于检测复合物II亚基的抗琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基A（SDHA，1:1,000）抗体、用于检测复合物IV亚基的抗COX IV抗体（1:1,000），以及与Alexa Fluor 488偶联的抗TFAM抗体（1:400）。另取相同数量的细胞，单独加入与Alexa Fluor 488偶联的抗TOMM20抗体（1:400），同样孵育30分钟（15 mL离心管中加入1 mL一抗溶液；有关抗体详细信息，请参见材料表）。
  6. 用PBS（1×）洗涤细胞一次，300 × g离心5分钟。向NDUFB10、SDHA和COX IV对应的离心管中加入二抗（1:400），孵育细胞30分钟。
  7. 用PBS（1×）洗涤细胞一次，300 × g离心5分钟。吸除上清液，每管中残留约100 µL。将细胞沉淀重悬于300 µL PBS（1×）中，转移至置于冰上避光保存的1.5 mL微量离心管中。
  8. 使用流式细胞仪（配备3个蓝色激光和1个红色激光）进行检测。使用530/30带通滤光片在滤光通道1（FL1）中检测信号。有关显微镜设置和参数，请参见补充图S2。

5. 流式细胞术数据采集与分析

  1. 使用未染色的对照管，根据所分析细胞群体的大小和复杂性，设置前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）散点图。显微镜设置和参数详见补充图S2。
    注意：为不同细胞类型分别设置未染色对照。
  2. 使用未染色对照管确定阳性门控范围，并使用单色对照管对多色流式细胞术中MTG（荧光染料1 [FL-1]）与TMRE（FL-2）之间的荧光光谱重叠进行补偿。使用同型对照作为阴性对照，以监测MRC和TFAM样本中的背景染色。使用FCCP处理的样本管作为TMRE染色的去极化对照。
  3. 通过前向散射和侧向散射图（图2A）设门排除外来碎片，选择活细胞及主要细胞群。利用前向散射高度（FSC-H）与前向散射面积（FSC-A）的密度图设门排除双联体，并构建侧向散射高度（SSC-H）与侧向散射面积（SSC-A）的散点图（图2A）。
  4. 数据采集（流式细胞仪）
    1. 以未染色或同型对照样本作为阴性对照，在观察SSC-A及各荧光通道（FL1、FL2、FL3、FL4）时，于单细胞事件主群体上方创建设门（图1B和图2B）。
  5. 数据分析（CFlow软件）
    1. 将设门位置复制到染色细胞样本上，记录阳性染色细胞的比例。
    2. 针对每个细胞亚群，选择直方图并分析不同荧光通道（FL1、FL2、FL3、FL4）（x轴）的中位荧光强度（MFI）。
      1. 通过从#3 TMRE染色样本的FL2通道MFI中减去#2 FCCP处理细胞的FL2通道MFI，计算TMRE水平，如以下公式（1）所示。
        ​TMRE水平 = #3 TMRE染色样本的FL2通道MFI - #2 FCCP处理细胞的FL2通道MFI（1）
      2. 通过TMRE或MitoSox Red的MFI计算线粒体膜电位（MMP）和线粒体活性氧（ROS）的特异性值，并除以线粒体体积指示剂MTG。
      3. 通过复合体亚基或TFAM表达的MFI计算其特异性值，并除以线粒体体积指示剂TOMM20。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分化方法及流式细胞术策略的示意图见图3。人iPSCs首先分化为神经玫瑰花环结构，随后被转移至悬浮培养中以进一步分化为神经球。神经球进一步分化并成熟为多巴胺能（DA）神经元。将神经球解离为单细胞，用于生成胶质星形胶质细胞，或重新接种为单层培养的神经干细胞（NSCs），再进一步分化为星形胶质细胞。本方案提供了通过流式细胞术获取和分析样本的策略，用于检测线粒体膜电位（MMP）、线粒体体积、线粒体活性氧（ROS）水平、MRC复合物亚基及TFAM（作为线粒体DNA拷贝数的间接指标）的表达水平。具体而言，使用荧光探针TMRE与MTG共染色，以检测和定量MMP及线粒体体积的变化；利用MitoSox Red与MTG共染色，可在活细胞中测量线粒体ROS的生成。通过针对MRC复合物亚基的抗体与TOMM20联合染色，可评估MRC的表达水平；而TFAM与TOMM20的染色则可用于间接评估mtDNA拷贝数。重要的是，MTG与TOMM20可实现基于单位线粒体体积的测量，从而消除线粒体体积对这些参数的影响。

多巴胺能神经元通过双SMAD抑制从诱导多能干...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞的生成方法，以及利用流式细胞术评估线粒体功能多个方面的实验方案。这些方案可高效地将人iPSC定向分化为神经元和胶质源性星形胶质细胞，并对线粒体功能进行详细表征，主要在活细胞中完成。该方案还提供了一种基于共染色流式细胞术的策略，用于获取和分析多种线粒体功能参数，包括活细胞中的线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）和线粒体活性氧（ROS） 水平，以及固定细胞中的线粒体呼吸链（MRC）复合物和线粒体转录因子A（TFAM）。具体而言，该方法可估算每单位线粒体体积内的总水平和特异性水平。尽管该策略已用于检测多巴胺能（DA）神经元和星形胶质细胞中已知线粒体疾病（POLG）的线粒体功能障碍，但这些技术适用于任何类型的细胞和疾病研究。此外，该方案具有良好的稳健性和可重复性。已有多个先前研究成功应用此方案分析成纤维细胞、iPSC、神经前体细胞（NSC）、DA神经元和星形胶质细胞中的线粒体变化2,3,13...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们谨向挪威卑尔根大学分子影像中心和流式细胞术核心设施表示感谢。本工作获得了挪威研究理事会（资助编号：229652）、Rakel og Otto Kr. Bruuns 奖学金以及中国国家留学基金管理委员会（项目编号：201906220275）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗小鼠 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11005）。
抗-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994一抗；使用比例为1:50，20 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗小鼠 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11005）。
抗-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中； 二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗鸡 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11042）。
抗-S100β  偶联 Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596一抗；使用比例为1:400，2.5 μL 加入 1000 μL 染色液中；
抗-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗小鼠 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11005）。
抗-SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中； 二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗鸡 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11042）。
抗-TFAM 偶联 Alexa Fluor 488Abcamab198308一抗；使用比例为1:400，2.5 μL 加入 1000 μL 染色液中；使用小鼠单克隆 IgG2b  Alexa Fluor® 488 作为同型对照。
抗-TOMM20 偶联 Alexa Fluor 488Santa Cruz Biotechnology货号 sc-17764 RRID:AB_628381一抗；使用比例为1:400，2.5 μL 加入 1000 μL 染色液中；使用小鼠单克隆 IgG2a  Alexa Fluor® 488 作为同型对照。
抗-NDUFB10Abcamab196019一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）；使用兔单克隆 IgG 作为同型对照。
抗-SDHAAbcamab137040一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中； 二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）；使用兔单克隆 IgG 作为同型对照。
抗-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中；使用  Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗小鼠 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11001）作为二抗；使用小鼠单克隆 IgG 作为同型对照。
激活素 APeproTech120-14E星形胶质细胞分化培养基成分
ABM 基础培养基LonzaCC-3187星形胶质细胞培养的基础培养基
AGM SingleQuots 补充剂套装LonzaCC-4123星形胶质细胞培养补充剂
抗生素-抗真菌剂Thermo Fisher Scientific15240062CDM 成分
高级 DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010稀释 Geltrex 的基础培养基
牛血清白蛋白Europa BioproductsEQBAH62-1000免疫染色实验中防止抗体非特异性结合的封闭剂，以及 CDM 成分
BDNFPeproTech450-02多巴胺能神经元培养基成分
B-27 补充剂Thermo Fisher Scientific17504044星形胶质细胞分化培养基成分
BD Accuri C6 Plus 流式细胞仪BD Biosciences, 美国
化学成分确定脂质浓缩液Thermo Fisher Scientific11905031CDM 成分
胶原酶 IVThermo Fisher Scientific17104019温和解离人诱导多能干细胞（iPSCs）的试剂
CCD 显微镜相机 Leica DFC3000 GLeica Microsystems, 德国
Corning 未处理培养皿Sigma-AldrichCLS430589悬浮培养
DPBSThermo Fisher Scientific14190250用于多种细胞培养洗涤
DMEM/F-12，含 GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher Scientific10565018星形胶质细胞分化基础培养基
EDTAThermo Fisher Scientific15575020温和解离人 iPSCs 的试剂
Essential 8 基础培养基Thermo Fisher ScientificA1516901iPSC 培养的基础培养基
Essential 8 补充剂（50X）Thermo Fisher ScientificA1517101iPSC 培养补充剂
EGF 重组人蛋白Thermo Fisher ScientificPHG0314神经干细胞（NSC）培养补充剂
FGF-basic（AA 10–155）重组人蛋白Thermo Fisher ScientificPHG0024NSC 培养补充剂
胎牛血清Sigma-Aldrich12103C培养基成分
FGF-basicPeproTech100-18B星形胶质细胞分化培养基成分
FCCPAbcamab120081消除线粒体膜电位及 TMRE 染色
液体抽吸系统 BVC 控制器Vacuubrand, 德国
甲醛（PFA）16%Thermo Fisher Scientific28908细胞固定
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302用于人 iPSCs 的贴壁与维持
GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher Scientific35050061NSC 培养补充剂
GDNFPeprotech450-10多巴胺能神经元培养基成分
甘氨酸Sigma-AldrichG8898用于封闭缓冲液
Ham's F-12 营养混合物Thermo Fisher Scientific31765027CDM 的基础培养基
人 Heregulin beta-1Sigma-AldrichSRP3055星形胶质细胞分化培养基成分
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399共聚焦成像中用于细胞核染色
Heracell 150i CO2 培养箱Fisher Scientific, 美国
IMDMThermo Fisher Scientific21980032CDM 的基础培养基
胰岛素Roche1376497CDM 成分
InSolution AMPK 抑制剂Sigma-Aldrich171261神经诱导培养基成分
胰岛素样生长因子-I 人源Sigma-AldrichI3769星形胶质细胞分化培养基成分
KnockOut DMEM/F-12 培养基Thermo Fisher Scientific12660012NSC 培养的基础培养基
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020促进体外神经细胞的贴壁与生长
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜Leica Microsystems, 德国
巯基甘油Sigma-AldrichM6145CDM 成分
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514用于线粒体体积指示
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008用于线粒体活性氧（ROS）指示
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma-AldrichA7250神经诱导培养基成分
N-2 补充剂Thermo Fisher Scientific17502048星形胶质细胞分化培养基成分
正常山羊血清Thermo Fisher ScientificPCN5000用于封闭缓冲液
轨道摇床 - SSM1Stuart Equipment, 英国
多聚-L-鸟氨酸溶液Sigma-AldrichP4957促进体外神经细胞的贴壁与生长
多聚-D-赖氨酸盐酸盐Sigma-AldrichP7405促进体外神经细胞的贴壁与生长
普莫瑞胺STEMCELL Technologies72204促进多巴胺能神经元分化
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36930共聚焦成像中用于盖玻片封片
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014用于多种洗涤步骤
重组人/小鼠 FGF-8b 蛋白R&D Systems423-F8-025/CF促进多巴胺能神经元分化
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMP神经诱导培养基成分
StemPro 神经补充剂Thermo Fisher ScientificA10508-01NSC 培养补充剂
TrypLE Express 酶Thermo Fisher Scientific12604013细胞解离试剂
转铁蛋白Roche652202CDM 成分
TRITON X-100VWR International9002-93-1用于免疫染色实验中细胞的通透处理
TMREAbcamab113852用于线粒体膜电位染色
水浴锅 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, 美国

参考文献

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