人类诱导多能干细胞及其神经和胶质分化衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

摘要

本研究报道了一种基于流式细胞术和两种荧光报告分子或抗体双重染色的新型方法，用于测量多种线粒体功能参数，以检测线粒体体积、线粒体膜电位、活性氧水平、线粒体呼吸链组成以及线粒体DNA的变化。

摘要

线粒体在多种神经退行性疾病的病理生理过程中具有重要作用。线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）、活性氧（ROS）的线粒体生成以及线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的变化，通常是这些过程的特征。本报告详细介绍了一种基于流式细胞术的新方法，用于在不同细胞类型（包括人诱导性多能干细胞（iPSCs）以及iPSC来源的神经细胞和胶质细胞）中同时检测多个线粒体参数。该基于流式细胞术的策略利用活细胞检测线粒体体积、MMP和ROS水平，同时利用固定细胞评估线粒体呼吸链（MRC）组分以及与mtDNA相关的蛋白（如线粒体转录因子A（TFAM））。

通过与荧光报告分子共染色，包括MitoTracker Green（MTG）、四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和MitoSox Red，可定量分析线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）以及线粒体活性氧（ROS）的变化，并将其与线粒体含量相关联。使用针对线粒体呼吸链（MRC）复合物亚基和外膜转位酶20（TOMM20）的抗体进行双重染色，可评估MRC亚基的表达水平。由于TFAM的含量与线粒体DNA（mtDNA）拷贝数成正比，因此通过测定单位TOMM20所对应的TFAM含量，可间接反映单位线粒体体积内的mtDNA含量。整个实验流程可在2–3小时内完成。重要的是，这些实验方案可通过流式细胞术，对线粒体参数在总体水平以及单位线粒体体积的特异性水平上进行定量检测。

引言

线粒体是几乎存在于所有真核细胞中的重要细胞器。线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP），为细胞提供能量，并作为生物合成和代谢过程中的代谢中间体。线粒体还深度参与多种其他重要的细胞过程，例如活性氧（ROS）的生成、细胞死亡以及细胞内 Ca²⁺ 的调节。线粒体功能障碍与多种神经退行性疾病相关，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）、弗里德赖希共济失调（FRDA）以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）¹。线粒体功能障碍加剧以及线粒体DNA（mtDNA）异常也被认为是人类衰老的重要促成因素^2,3。

神经退行性疾病中存在多种类型的线粒体功能障碍，线粒体体积改变、线粒体膜电位（MMP）去极化、活性氧（ROS）产生以及线粒体DNA拷贝数变化均较为常见^4,5,6,7。因此，在研究疾病机制和测试潜在治疗药物时，能够检测这些及其他线粒体功能指标具有重要意义。此外，鉴于目前尚缺乏能真实模拟人类神经退行性疾病的动物模型，建立能够在脑细胞中重现人....

方案

注意：本方案中使用的所有培养基和溶液的配方，请参见材料表和补充表 S1。

1. 将人iPSCs分化为NCSs、多巴胺能（DA）神经元和星形胶质细胞

1. 准备基质包被的培养板。
   1. 将一管5 mL的基质在冰上过夜解冻。用99 mL冷的高级DMEM/F12培养基（Advanced DMEM/F12）稀释1 mL基质（终浓度为1%）。分装成每份1 mL，于-20 °C保存。
   2. 在4 °C条件下解冻基质溶液（保持低温），并在6孔板中每孔加入1 mL，包被6个孔。
   3. 将包被好的培养板置于37 °C、含5% CO₂/95%空气的湿润化培养箱中孵育1小时。取出培养板，使其平衡至室温（RT）。
      ​注意：建议在包被后3天内使用该培养板。然而，包被后的培养板可在4 °C保存最多2周。使用前需提前取出并恢复至室温。对于长期储存，向包被板中加入1 mL iPSC培养基以防止基质干燥。
2. iPSC的解冻
   1. 将基质包被的培养板在室温或37 °C培养箱中预热20–30分钟。同时将所需量的iPSC培养基在室温下预热。
   2. 将6 mL预热的iPSC培养基与12 µL Y-27632 ROCK抑制剂....

结果

分化方法及流式细胞术策略的示意图见图3。人iPSCs被分化为神经玫瑰花结，随后转移至悬浮培养中进一步分化为神经球。神经球进一步分化并成熟为多巴胺能（DA）神经元。将神经球解离为单细胞，用于生成胶质星形胶质细胞，或以神经干细胞（NSCs）形式重铺为单层培养，再进一步分化为星形胶质细胞。本方案提供了通过流式细胞术获取和分析样本所需的方法，用于检测线粒体膜电位（MMP）、线粒体体积、线粒体活性氧（ROS）水平、MRC复合物亚基及TFAM（作为线粒体DNA拷贝数的间接指标）的表达水平。具体而言，采用荧光探针TMRE与MTG共染色，以检测和定量MMP及线粒体体积的变化；利用MitoSox Red与MTG共染色，可在活细胞中测量线粒体ROS的生成。使用针对MRC复合物亚基的抗体与TOMM20联合染色，可评估MRC的表达情况；而TFAM与TOMM20的染色则可用于间接评估mtDNA拷贝数。重要的是，MTG与TOMM20可用于基于单位线粒体体积的标准化测量，从而消除线粒体体积变化对这些参数的影响。

多巴胺能神经元通过双SMAD抑制法从诱导.......

讨论

本文提供了诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞的生成方法，以及利用流式细胞术评估线粒体功能多个方面的实验方案。这些方案可高效地将人iPSC定向分化为神经元和胶质源性星形胶质细胞，并对线粒体功能进行详细表征，主要在活细胞中完成。该方案还提供了一种基于共染色流式细胞术的策略，用于获取和分析多种线粒体功能参数，包括活细胞中的线粒体体积、线粒体膜电位（MMP）和线粒体活性氧（ROS） 水平，以及固定细胞中的线粒体呼吸链（MRC）复合物和线粒体转录因子A（TFAM）。具体而言，该方法可估算每单位线粒体体积内的总水平和特异性水平。尽管该策略已用于检测多巴胺能（DA）神经元和星形胶质细胞中已知线粒体疾病（POLG）的线粒体功能障碍，但这些技术适用于任何类型的细胞和疾病研究。此外，该方案具有良好的稳健性和可重复性。已有多个先前研究成功应用此方案分析成纤维细胞、iPSC、神经前体细胞（NSC）、DA神经元和星形胶质细胞中的线粒体变化^2,3,13.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗小鼠 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11005）。
抗-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	一抗；使用比例为1:50，20 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗小鼠 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11005）。
抗-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中； 二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗鸡 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11042）。
抗-S100β  偶联 Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	一抗；使用比例为1:400，2.5 μL 加入 1000 μL 染色液中；
抗-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗小鼠 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11005）。
抗-Synaptophysin	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）。
抗-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	一抗；使用比例为1:100，10 μL 加入 1000 μL 染色液中； 二抗使用 Alexa Fluor ® 594 标记山羊抗鸡 IgG（1:800，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11042）。
抗-TFAM 偶联 Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	一抗；使用比例为1:400，2.5 μL 加入 1000 μL 染色液中；使用小鼠单克隆 IgG2b  Alexa Fluor® 488 作为同型对照。
抗-TOMM20 偶联 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	货号 sc-17764 RRID:AB_628381	一抗；使用比例为1:400，2.5 μL 加入 1000 μL 染色液中；使用小鼠单克隆 IgG2a  Alexa Fluor® 488 作为同型对照。
抗-NDUFB10	Abcam	ab196019	一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中；二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）；使用兔单克隆 IgG 作为同型对照。
抗-SDHA	Abcam	ab137040	一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中； 二抗使用 Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗兔 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11008）；使用兔单克隆 IgG 作为同型对照。
抗-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	一抗；使用比例为1:1000，1 μL 加入 1000 μL 染色液中；使用  Alexa Fluor ® 488 标记山羊抗小鼠 IgG （1:400，Thermo Fisher Scientific，货号 # A-11001）作为二抗；使用小鼠单克隆 IgG 作为同型对照。
激活素 A	PeproTech	120-14E	星形胶质细胞分化培养基成分
ABM 基础培养基	Lonza	CC-3187	星形胶质细胞培养的基础培养基
AGM SingleQuots 补充剂套装	Lonza	CC-4123	星形胶质细胞培养补充剂
抗生素-抗真菌剂	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM 成分
高级 DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	稀释 Geltrex 的基础培养基
牛血清白蛋白	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	免疫染色实验中防止抗体非特异性结合的封闭剂，以及 CDM 成分
BDNF	PeproTech	450-02	多巴胺能神经元培养基成分
B-27 补充剂	Thermo Fisher Scientific	17504044	星形胶质细胞分化培养基成分
BD Accuri C6 Plus 流式细胞仪	BD Biosciences, 美国
化学成分确定脂质浓缩液	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM 成分
胶原酶 IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	温和解离人诱导多能干细胞（iPSCs）的试剂
CCD 显微镜相机 Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, 德国
Corning 未处理培养皿	Sigma-Aldrich	CLS430589	悬浮培养
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	用于多种细胞培养洗涤
DMEM/F-12，含 GlutaMAX 补充剂	Thermo Fisher Scientific	10565018	星形胶质细胞分化基础培养基
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	温和解离人 iPSCs 的试剂
Essential 8 基础培养基	Thermo Fisher Scientific	A1516901	iPSC 培养的基础培养基
Essential 8 补充剂（50X）	Thermo Fisher Scientific	A1517101	iPSC 培养补充剂
EGF 重组人蛋白	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	神经干细胞（NSC）培养补充剂
FGF-basic（AA 10–155）重组人蛋白	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	NSC 培养补充剂
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12103C	培养基成分
FGF-basic	PeproTech	100-18B	星形胶质细胞分化培养基成分
FCCP	Abcam	ab120081	消除线粒体膜电位及 TMRE 染色
液体抽吸系统 BVC 控制器	Vacuubrand, 德国
甲醛（PFA）16%	Thermo Fisher Scientific	28908	细胞固定
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	用于人 iPSCs 的贴壁与维持
GlutaMAX 补充剂	Thermo Fisher Scientific	35050061	NSC 培养补充剂
GDNF	Peprotech	450-10	多巴胺能神经元培养基成分
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898	用于封闭缓冲液
Ham's F-12 营养混合物	Thermo Fisher Scientific	31765027	CDM 的基础培养基
人 Heregulin beta-1	Sigma-Aldrich	SRP3055	星形胶质细胞分化培养基成分
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	共聚焦成像中用于细胞核染色
Heracell 150i CO2 培养箱	Fisher Scientific, 美国
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	CDM 的基础培养基
胰岛素	Roche	1376497	CDM 成分
InSolution AMPK 抑制剂	Sigma-Aldrich	171261	神经诱导培养基成分
胰岛素样生长因子-I 人源	Sigma-Aldrich	I3769	星形胶质细胞分化培养基成分
KnockOut DMEM/F-12 培养基	Thermo Fisher Scientific	12660012	NSC 培养的基础培养基
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	促进体外神经细胞的贴壁与生长
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜	Leica Microsystems, 德国
巯基甘油	Sigma-Aldrich	M6145	CDM 成分
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	用于线粒体体积指示
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	用于线粒体活性氧（ROS）指示
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A7250	神经诱导培养基成分
N-2 补充剂	Thermo Fisher Scientific	17502048	星形胶质细胞分化培养基成分
正常山羊血清	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	用于封闭缓冲液
轨道摇床 - SSM1	Stuart Equipment, 英国
多聚-L-鸟氨酸溶液	Sigma-Aldrich	P4957	促进体外神经细胞的贴壁与生长
多聚-D-赖氨酸盐酸盐	Sigma-Aldrich	P7405	促进体外神经细胞的贴壁与生长
普莫瑞胺	STEMCELL Technologies	72204	促进多巴胺能神经元分化
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36930	共聚焦成像中用于盖玻片封片
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	用于多种洗涤步骤
重组人/小鼠 FGF-8b 蛋白	R&D Systems	423-F8-025/CF	促进多巴胺能神经元分化
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	神经诱导培养基成分
StemPro 神经补充剂	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	NSC 培养补充剂
TrypLE Express 酶	Thermo Fisher Scientific	12604013	细胞解离试剂
转铁蛋白	Roche	652202	CDM 成分
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	用于免疫染色实验中细胞的通透处理
TMRE	Abcam	ab113852	用于线粒体膜电位染色
水浴锅 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, 美国