Method Article

人诱导多能干细胞及其神经和神经胶质衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究报道了一种基于流式细胞术和两种荧光报告基因或抗体双重染色测量多种线粒体功能参数的新方法，以检测线粒体体积、线粒体膜电位、活性氧水平、线粒体呼吸链组成和线粒体 DNA 的变化。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体在许多神经退行性疾病的病理生理学中很重要。线粒体体积、线粒体膜电位 （MMP）、线粒体活性氧产生 （ROS） 和线粒体 DNA （mtDNA） 拷贝数的变化通常是这些过程的特征。本报告详细介绍了一种基于流式细胞术的新型方法，用于测量不同细胞类型中的多种线粒体参数，包括人诱导多能干细胞（iPSC）和iPSC来源的神经和神经胶质细胞。这种基于流动的策略使用活细胞来测量线粒体体积、MMP 和 ROS 水平，并使用固定细胞来估计线粒体呼吸链 （MRC） 和 mtDNA 相关蛋白质（如线粒体转录因子 A （TFAM））的成分。

通过与荧光报告基因（包括 MitoTracker Green （MTG）、四甲基罗丹明乙酯 （TMRE） 和 MitoSox Red 共同染色，可以量化线粒体体积、MMP 和线粒体 ROS 的变化，并与线粒体含量相关。用针对MRC复合物亚基和线粒体外膜20转位酶（TOMM20）的抗体进行双重染色，可以评估MRC亚基的表达。由于TFAM的量与mtDNA拷贝数成正比，因此每个TOMM20的TFAM测量可以间接测量每个线粒体体积的mtDNA。整个协议可以在2-3小时内进行。重要的是，这些协议允许使用流式细胞术测量线粒体参数，包括总水平和每线粒体体积的特定水平。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体是存在于几乎所有真核细胞中的必需细胞器。线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）来负责能量供应，并作为生物合成和代谢的代谢中介。线粒体深入参与许多其他重要的细胞过程，如ROS生成、细胞死亡和细胞内Ca2+ 调节。线粒体功能障碍与各种神经退行性疾病有关，包括帕金森病 （PD）、阿尔茨海默病 （AD）、亨廷顿病 （HD）、弗里德赖希共济失调 （FRDA） 和肌萎缩侧索硬化症 （ALS）1。线粒体功能障碍和mtDNA异常的增加也被认为有助于人类衰老2，3。

神经退行性疾病中会出现各种类型的线粒体功能障碍，线粒体体积的变化、MMP去极化、ROS的产生和mtDNA拷贝数的改变是常见的4，5，6，7。因此，在研究疾病机制和测试潜在治疗剂时，测量这些和其他线粒体功能的能力非常重要。此外，鉴于缺乏忠实复制人类神经退行性疾病的动物模型，建立合适的体外模型系统来概括脑细胞中的人类疾病是朝着更好地了解这些疾病和开发新疗法迈出的重要一步2，3，8，9。

人iPSCs可用于产生各种脑细胞，包括神经元和非神经元细胞（即神经胶质细胞），并且在两种细胞类型中都发现了与神经退行性疾病相关的线粒体损伤3，10，11，12，13。iPSC分化为神经和神经胶质谱系的适当方法可用14，15，16。这些细胞为体外疾病建模和药物筛选提供了独特的人/患者平台。此外，由于这些来自患者，iPSC衍生的神经元和神经胶质细胞提供了更准确地反映人类正在发生的事情的疾病模型。

迄今为止，很少有方便可靠的方法来测量iPSCs中的多个线粒体功能参数，特别是活神经元和神经胶质细胞。流式细胞术的使用为科学家提供了一种强大的工具来测量单细胞中的生物学参数，包括线粒体功能。该协议提供了生成不同类型的脑细胞的详细信息，包括来自 iPSC 的神经干细胞 （NSC）、神经元和神经胶质星形胶质细胞，以及基于流式细胞术的新型方法，用于测量不同细胞类型中的多个线粒体参数，包括 iPSC 和 iPSC 衍生的神经和神经胶质细胞。该协议还提供了使用流式细胞术测量线粒体体积、MMP、线粒体 ROS 水平、MRC 复合物和 TFAM 的共染色策略。通过结合线粒体体积或质量的测量，这些协议还允许测量每个线粒体单位的总水平和特定水平。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意:请参阅 材料 表和 补充表S1 ，了解本协议中使用的所有培养基和溶液的配方。

1. 人 iPSC 分化为 NCS、多巴胺能 （DA） 神经元和星形胶质细胞

  1. 准备基质包被的板。
    1. 将一瓶 5 mL 基质在冰上解冻过夜。用 99 mL 冷的高级杜尔贝克改良鹰培养基/火腿的 F-12（高级 DMEM/F12）（1% 终浓度）稀释 1 mL 基质。制作1mL等分试样并将其储存在-20°C。
    2. 在4°C下解冻基质溶液（保持低温）并涂覆6孔（6孔板中每孔1mL）。
    3. 将基质包被的板置于37°C的加湿的5%CO2 / 95%空气培养箱中1小时。将板从培养箱中取出，使其平衡至室温（RT）。
      注意:建议在涂层后 3 天内使用板。但是，涂层板可以在4°C下储存长达2周。 只需记住在使用前将其取出并使其预热至 RT。对于长期储存，向包被板中加入 1 mL iPSC 培养基，以避免基质干燥。
  2. 解冻 iPSC
    1. 在室温下或在37°C的培养箱中预热基质包被的板20-30分钟。在室温下预热所需量的iPSC培养基。
    2. 将 6 mL 预热的 iPSC 培养基与 12 μL Y-27632 ROCK 抑制剂混合，以获得 10 μM 的终浓度。
    3. 在水浴中以37°C部分解冻iPSCs冷冻小瓶，直到剩下一小块冰。
    4. 将 1 mL 预热的 iPSC 培养基和 12 μL ROCK 抑制剂滴加到细胞中。使用 5 mL 移液管将装有 iPSC 的小瓶中的液体内容物滴入 6 孔预包被板的一个孔中。
    5. 垂直方向移动板以混合孔内容物并将板放回培养箱。用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（1x）（Ca 2 + / Mg2 +-free）（6孔板中每孔4mL）洗涤24小时后更换iPSC培养基。
      注意:不要在随后的喂食中添加 ROCK 抑制剂。每天更换iPSC培养基。
  3. iPSC的传代
    1. 在室温下或在37°C的培养箱中预热基质包被的板20-30分钟。在室温下预热所需量的iPSC培养基。
    2. 从含有细胞的平板中吸出培养基。用DPBS（1x）（不含Ca 2 + / Mg2 +）（6孔板中每孔4 mL）冲洗iPSC。
    3. 加入EDTA （0.5 mM）（6孔板中每孔1 mL）。在37°C下孵育板，直到菌落的边缘开始从孔中抬起（通常为3-5分钟）。吸出EDTA。
    4. 加入预热的iPSC培养基（6孔板中每孔4 mL），并使用10 mL无菌移液管强行分离iPSC菌落一次。不要上下移液，因为这可能会将细胞团块分解成单个细胞。
    5. 将每个孔的内容物转移到基质包被的6孔板中的两个单独的孔中（6孔板中每孔2mL），并在37°C下孵育。 移液时不要在悬浮液中产生气泡。
      注意:在将其保存在培养箱中之前，轻轻摇动板。分流比可以是1:2（一口井进入2口新井）到1:4（一口井进入4口新井）。
    6. 每天更换培养基，直到菌落达到60%汇合，尺寸和连接良好。
  4. 神经诱导和神经祖细胞生成
    1. 制备 500 mL 化学成分确定培养基 （CDM）、500 mL 神经诱导培养基 （NIM） 和 500 mL 无神经干细胞血清 （NSC SF） 培养基。
    2. 用DPBS（1x）（不含Ca 2 + / Mg2 +）（6孔板中每孔4mL）冲洗细胞并加入NIM（6孔板中每孔3mL）。设置为第 0 天。
    3. 在第 1 天、第 3 天和第 4 天更换 NIM（6 孔板中每孔 3 mL），并每天在显微镜下观察。
    4. 在第 5 天，将神经玫瑰花结分离到悬浮培养物中，如下所述。
      1. 用DPBS（1x）（不含Ca 2 + / Mg2 +）（在6孔板中每孔4 mL）轻轻洗涤一次。加入胶原酶IV（6孔板中每孔1mL），并在培养箱中保持1分钟。吸出 IV 胶原酶并用 DPBS （1x）（6 孔板中每孔 4 mL）轻轻洗涤一次。
      2. 每孔向 6 孔板中加入 2 mL NSC SF 培养基。通过使用 200 μL 移液器吸头绘制网格来刮孔底部来分离细胞。
      3. 将细胞悬液从6孔板收集到10cm非粘附培养皿中。用 NSC SF 培养基将体积补足至 12 mL。
      4. 在培养箱中的轨道振荡器上以65-85rpm的速度摇动非粘附培养皿以防止聚集。
  5. DA神经元分化
    1. 在第 7 天，加入 12 mL 补充有 100 ng/mL 成纤维细胞生长因子-8b （FGF-8b） 的 CDM，并将培养皿放在培养箱的轨道振荡器上。
    2. 在第8-13天，每2天更换一次培养基，并每天在显微镜下观察。
    3. 在第 14 天，加入 12 mL CDM，补充有 100 ng/mL FGF-8b 和 1 μM 紫吗啡胺 （PM）。将培养皿放在培养箱中的轨道振荡器上。
    4. 在第15-20天，每2天更换一次培养基，并每天观察显微镜下的细胞。
    5. 通过使用 1000 μL 吸头以机械方式通过球体来分解较大的球体。
      注意:比例可以是1:2（一道菜变成2道新菜）。
  6. 分化的终止
    1. 如下所述，用聚-L-鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白涂覆6孔板或盖玻片。
      1. 用每孔1mL的PLO涂覆6孔板，并将板在37°C孵育20分钟。吸出PLO溶液。
      2. 在紫外线下对板进行消毒20分钟。用DPBS（1x）（在6孔板中每孔4mL）冲洗孔两次。
      3. 向孔中加入5μg/ mL层粘连蛋白溶液（6孔板中每孔1mL），并在37°C下孵育2小时。吸出层粘连蛋白并在接种前用DPBS（1x）（6孔板中每孔4mL）短暂洗涤孔一次。
    2. 将所有球体（来自步骤1.5.5）收集在50 mL管中，并加满DPBS（1x）。以 300 × g 旋转 5 分钟。吸出上清液。
    3. 用2mL细胞解离试剂（参见 材料表）在37°C的水浴中孵育10分钟，然后用200μL移液管轻轻研磨（20-50次，取决于球体的大小，避免形成气泡）。
    4. 用 2 mL Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 和 10% 胎牛血清 （FBS） 中和细胞解离试剂，并在室温下以 300 × g 离心含有细胞的 50 mL 锥形管 5 分钟。 吸出上清液。
    5. 加入 1 mL CDM，补充有 10 ng/mL 脑源性神经营养因子 （BDNF） 和 10 ng/mL 神经胶质细胞系来源神经营养因子 （GDNF），通过轻轻上下移液来重悬细胞沉淀以获得单细胞悬浮液。
    6. 从板中吸出层粘连蛋白溶液（步骤1.6.1.3），用DPBS（1x）（6孔板中每孔4mL）短暂洗涤，并将细胞（来自步骤1.6.5）接种在预包被板或盖玻片中，接种在补充有10ng / mL BDNF和10 ng / mL GDNF的3 mL CDM中。每4天喂一次细胞。
      注意:分化培养物可以维持数周至3个月。神经形态通常在终止2周后出现，并可用于从该点开始的下游分析。BDNF和GDNF对于长期维护（长达2个月）的培养不是必需的。
  7. NSC 生成
    1. 涂覆基质板。
    2. 在 50 mL 管中收集所有神经球（从步骤 1.4 生成），并用 DPBS （1x）（不含Ca 2+/Mg2+）加满。以 300 × g 旋转 5 分钟。吸出上清液。
    3. 将沉淀与2mL细胞解离试剂在37°C的水浴中孵育10分钟，然后用200μL移液管轻轻研磨（20-50次，取决于球体的大小，避免形成气泡）。
    4. 用 2 mL DMEM 和 10% FBS 中和，并在室温下以 300 × g 离心含有细胞的 50 mL 锥形管 5 分钟。 吸出上清液。通过轻轻上下移液重悬细胞沉淀以获得单细胞悬浮液。
    5. 从预包被板中吸出基质溶液，并将细胞接种在NSC SF培养基中（6孔板中每孔3 mL）。每2-3天喂一次细胞，并在汇合时分裂细胞。
      注意:从此阶段开始，可以扩展和冻结 NSC。
  8. 胶质星形胶质细胞分化
    1. 来自 NSC 的星形胶质细胞分化
      1. 准备 500 mL 星形胶质细胞分化培养基。
      2. 用NSC SF培养基在聚-D-赖氨酸（PDL）包被的平板/盖玻片上播种NSC。
      3. 第二天，用DPBS（1x）（Ca 2 + / Mg2 +-free）（6孔板中每孔4mL）冲洗细胞，并加入星形胶质细胞分化培养基（6孔板中每孔3mL）。设置为第 0 天。
      4. 每天在显微镜下观察NSC，并从第1天到第27天每2天更换星形胶质细胞分化培养基（6孔板中每孔3mL）。
    2. 星形胶质细胞成熟
      1. 准备星形胶质细胞成熟培养基。
      2. 在第28天，用DPBS（1x）（6孔板中每孔4mL）冲洗细胞，并加入星形胶质细胞成熟培养基（6孔板中每孔3mL）。
      3. 在第29天及以后，每天在显微镜下观察细胞，并每2天更换星形胶质细胞成熟培养基（6孔板中每孔3mL）。
      4. 成熟一个月后，从这个阶段开始扩增细胞并冷冻保存它们。
        注意:在此阶段，单元格数量将增加。分裂细胞时，不需要PDL包被的盖玻片进行培养。

2. 通过免疫细胞化学和免疫荧光染色进行细胞表征

  1. 在培养期结束时，将带有细胞的盖玻片转移到12孔板中。
    用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1x）冲洗细胞两次，并在室温下在4%多聚甲醛（PFA）（12孔板中每孔0.5mL）中孵育10分钟。
    注意:固定样品可以用2mL PBS（1x）覆盖，并储存在4°C直至需要免疫染色。PFA有毒，被怀疑会导致癌症。防止皮肤和眼睛暴露，并在化学通风橱下工作。
  2. 封闭并透化细胞，并与含有PBS（1x），0.3%Triton X-100和10%正常山羊血清的封闭缓冲液在室温下孵育1小时。
  3. 在封闭缓冲液中与一抗在4°C孵育过夜:具有抗八聚体结合转录因子4（Oct4）和抗阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA4）的染色iPSC，具有抗性别决定区Y框-2（Sox2）和抗Nestin的NSC，具有反配对盒-6（Pax6）和抗Nestin的神经球，具有抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和抗S100钙结合蛋白β（S100β）的星形胶质细胞，以及具有抗酪氨酸羟化酶（TH）的DA神经元， 抗 β III 微管蛋白 （Tuj 1）、抗突触素和抗 PSD-95（12 孔板中每孔 0.5 mL 一抗溶液;详见 材料表 ）。
  4. 用PBS（1x）洗涤样品三次，每次10分钟，轻轻摇动。
  5. 与二抗溶液（封闭缓冲液中的1:800，12孔板中每孔0.5mL Alexa Fluor二抗溶液）在室温下轻轻摇动孵育1小时。
  6. 用Hoechst 33342（1:5，000，12孔板中每孔0.5mL）在PBS（1x）中孵育细胞15分钟以标记细胞核。
  7. 用封片剂安装细胞并在室温下干燥过夜，以便在黑暗中在荧光显微镜下成像。有关显微镜设置和参数，请参见 补充图S1 。

3. 活细胞中线粒体体积、MMP和线粒体ROS的流式细胞术测量

  1. 将细胞分别接种到6孔板中的4个孔中，直到细胞达到50%-60%汇合度。将这四个孔标记为 #1、#2、#3 和 #4。
  2. 在培养期结束时，准备5个单独的染色溶液（6孔板中每孔500μL），如下所示:#1仅培养基（至仅包含用于对照的细胞的孔#1）;#2-1含有FCCP（100μM）;#2-2在培养基中含有FCCP（100μM）+ TMRE（100nM）+ MTG（150nM）;#3在培养基中含有TMRE（100nM）+ MTG（150nM）;#4 含有 MitoSox 红 （10 μM） + MTG （150 nM） 在 PBS （1x） 中含有 10% FBS。有关这些化合物和流式细胞术设置的详细信息，请参见 图1A、 补充表S2和 材料表 。
    注意:使用培养基制备染色溶液。使用前在室温下预热培养基和 PBS （1x）。FCCP 有毒;防止皮肤和眼睛暴露，并在化学通风橱下工作。
  3. 从#2孔中吸出培养基并加入#2-1溶液（仅限FCCP）。将细胞在37°C孵育10分钟。
  4. 从#2和#3孔中吸出培养基，并在#2孔中加入#2-2溶液（FCCP + TMRE + MTG）和#3中的#3溶液（TMRE + MTG）。将细胞在37°C孵育45分钟。
  5. 从#4孔中吸出培养基并加入#4溶液（MitoSox Red + MTG）。将细胞在37°C孵育15分钟。
  6. 从所有孔中吸出培养基。用PBS（1x）（6孔板中每孔4mL）洗涤。使用1mL细胞解离试剂（6孔板中每孔1mL）在37°C下分离细胞5分钟。用 10% FBS（6 孔板中每孔 2 mL）中和 1 mL DMEM 中的细胞解离试剂。
  7. 将所有孔的内容物收集在 15 mL 锥形管中。将试管以300× g 离心5分钟。用PBS（1x）清洗颗粒一次或两次。
  8. 吸出上清液，但在管中留下约 100 μL。将细胞沉淀重悬于 300 μL PBS （1x） 中。将细胞转移到 1.5 mL 微量离心管中。在室温下将试管保持在黑暗中。
  9. 使用流式细胞仪（具有3个蓝色和1个红色激光配置）分析细胞。使用 530/30 带通滤光片检测滤光片 1 （FL1） 中的 MTG，使用带通滤光片 585/40 检测滤光片 2 （FL2） 中的 TMRE，使用 510/580 带通滤光片检测滤光片 3 （FL3） 中的 MitoSox Red。

4. 固定细胞中MRC复合亚基和TFAM的流式细胞术测量

  1. 在培养期结束时，通过加入细胞解离试剂分离细胞（~106）;然后，沉淀并将细胞收集在 15 mL 管中。通过用PBS（1x）离心两次，以300×g离心5分钟来洗涤细胞。
  2. 将细胞固定在室温下 1.6% PFA（1 mL 管中的 1.6% PFA）中 10 分钟。通过用PBS（1x）离心两次，以300×g离心5分钟来洗涤细胞。
  3. 用冰冷的90%甲醇（15mL管中的1mL90%甲醇）在-20°C下透化细胞20分钟。
  4. 封闭缓冲液中含有 0.3 M 甘氨酸、5% 山羊血清和 1% 牛血清白蛋白 （BSA） - PBS （1x） 中的级分 V（15 mL 管中的封闭缓冲液）。通过用PBS（1x）离心两次（如步骤3.7）洗涤细胞。
  5. 用以下一抗孵育细胞30分钟:抗NDUFB10（1:1，000）用于测量复合物I亚基，抗琥珀酸脱氢酶复合黄素蛋白亚基A（SDHA，1:1，000）用于测量复合物II亚基和抗COX IV（1:1，000）用于测量复合物IV亚基，以及与Alexa Fluor 488偶联的抗TFAM抗体（1:400）。用Alexa Fluor 488（1:400）偶联的抗TOMM20抗体分别染色相同数量的细胞30分钟（15 mL管中的1 mL一抗溶液;有关抗体的详细信息，请参阅 材料表 ）。
  6. 用PBS（1x）洗涤细胞一次，以300× g 离心5分钟。将二抗（1:400）加入NDUFB10，SDHA和COX IV管中，并用这些溶液孵育细胞30分钟。
  7. 用PBS（1x）洗涤细胞一次，以300× g 离心5分钟。吸出上清液，在管中留下约 100 μL。将细胞沉淀重悬于 300 μL PBS （1x） 中。将细胞转移到冰上黑暗保存的 1.5 mL 微量离心管中。
  8. 分析流式细胞仪上的细胞（使用3蓝色和1红色激光配置）。使用 530/30 带通滤波器检测滤波器 1 （FL1） 中的信号。有关显微镜设置和参数，请参见 补充图S2 。

5. 流式细胞术采集与分析

  1. 使用未染色的对照管根据所分析细胞群的大小和复杂性设置前向散射区域 （FSC-A） 和侧向散射区域 （SSC-A） 散点图。有关显微镜设置和参数，请参见 补充图S2 。
    注意:为单个细胞类型设置非染色对照。
  2. 使用非染色对照管选择阳性门，并使用单色对照管补偿多色流式细胞术中MTG（荧光团-1 [FL-1]）和TMRE（FL-2）之间的荧光光谱重叠。使用阴性对照的同种型对照来监测MRC和TFAM样品中的背景染色。使用 FCCP 管作为 TMRE 染色的去极化对照。
  3. 从前向和侧向散射图中剔除外来碎片以选择活细胞和主门控（图2A）。使用前向散射高度 （FSC-H） 与（相对于）FSC-A 密度图来排除双峰，并构建侧向散射高度 （SSC-H） 与 SSC-A 图（图 2A）。
  4. 数据采集（流式细胞仪）
    1. 使用未染色或同种型样品作为阴性对照，在观察SSC-A和各种过滤器（FL1，FL2，FL3，FL4）的同时，在单细胞事件的主要群体上方创建一个门（图1B和图2B）。
  5. 数据分析（CFlow 软件）
    1. 将栅极的位置复制到染色的细胞样品上，并记录阳性染色的阳性染色细胞量。
    2. 对于每个细胞亚群，选择直方图并分析不同过滤通道（FL1，FL2，FL3，FL4）（x轴）的中位荧光强度（MFI）。
      1. 通过在直方图中从 #3 TMRE 染色样品中减去 FL2 的 MFI 中减去 #2 FCCP 处理细胞的 FL3 的 MFI 来计算 TMRE 水平，如下面的方程 （1） 所示。
        TMRE 水平 = 来自 #3 TMRE 染色样品的 FL2 的 MFI - #2 FCCP 处理细胞的 FL2 MFI （1）
      2. 通过TMRE或MitoSox Red中的MFI计算MMP和线粒体ROS的特定值，除以线粒体体积指示器MTG。
      3. 通过在复合表达或TFAM中使用MFI计算复合亚基和TFAM的特定值，除以线粒体体积指示器TOMM20。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分化方法和流式细胞术策略的示意图如图 3所示。将人iPSC分化为神经花环，然后提升到悬浮培养物中分化为神经球体。神经球进一步分化并成熟为DA神经元。神经球被解离成单细胞以产生神经胶质星形胶质细胞，作为NSC重新铺在单层中，然后分化成星形胶质细胞。该协议提供了通过流式细胞术获取和分析样品所需的策略，以测量MMP，线粒体体积，线粒体ROS水平，MRC复合物亚基的表达水平和TFAM（相对mtDNA拷贝数的间接测量）。具体而言，与荧光报告基因TMRE和MTG共染色用于检测和量化MMP和线粒体体积的变化。与MitoSox Red和MTG共染色可以测量活细胞中线粒体ROS的产生。用针对MRC复合物亚基的抗体与TOMM20一起染色可以评估MRC，并对TFAM和TOMM20进行染色，以间接评估mtDNA拷贝数。重要的是，MTG和TOMM20允许测量每个线粒体体积，抵消线粒体体积对这些参数的影响。

DA神经元通过双重SMAD抑制从iPSC产生，并暴露于FGF-8b和声波刺猬（SHH）激动剂PM，如图...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以下是用于生成iPSC衍生的神经元和星形胶质细胞以及使用流式细胞术评估线粒体功能的多个方面的协议。这些方案允许将人iPSCs有效地转化为神经元和神经胶质星形胶质细胞，并详细表征线粒体功能，主要是在活细胞中。该协议还提供了基于共染色流式细胞术的策略，用于获取和分析多种线粒体功能，包括活细胞中的体积、MMP 和线粒体 ROS 水平以及固定细胞中的 MRC 复合物和 TFAM。具体来说，这些协议允许估计每个线粒体体积的总水平和特定水平。虽然该策略检测DA神经元和星形胶质细胞中已知线粒体疾病（POLG）中的线粒体功能障碍，但这些技术适用于任何类型的细胞和疾病。此外，该协议稳健且可重复。以前的几项研究已成功应用该协议来分析成纤维细胞，iPSC，NSC，DA神经元和星形胶质细胞的线粒体变化2，3，13，17。

执行此协议时需要考虑一些关键点...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们衷心感谢挪威卑尔根大学的分子成像中心和流式细胞术核心设施。这项工作得到了挪威研究委员会（资助号:229652），Rakel og Otto Kr.Bruuns legat和中国国家留学基金委（项目编号:201906220275）的资助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗 Oct4Abcamab19857，RRID：AB_445175一抗;以 1：100、10 和 μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®488 山羊抗兔 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗。
抗 SSEA4Abcamab16287，RRID：AB_778073一抗;以 1：100、10 和 μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®594 只山羊抗小鼠 IgG（1：800，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11005）作为二抗。
抗 Sox2Abcamab97959，RRID：AB_2341193一抗;以 1：100、10 和 μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®488 山羊抗兔 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗。
抗 Pax6Abcamab5790，RRID：AB_305110一抗;用作 1：100、10 和 μ;L in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®488 山羊抗兔 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗。
抗 NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927，RRID：AB_627994一抗;以 1：50、20 和 μ 使用;L in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®594 只山羊抗小鼠 IgG（1：800，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11005）作为二抗。
抗 GFAP抗体 Abcamab4674，RRID：AB_304558一抗;以 1：100、10 和 μ 使用;L in 1000 μL 染色液; 使用 Alexa Fluor ®594 山羊抗鸡 IgG（1：800，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11042）作为二抗。
抗 S100β 与 Alexa Fluor 488Abcamab196442， RRID：AB_2722596一抗偶联;以 1：400， 2.5 &μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液;
抗 THAbcamab75875，RRID：AB_1310786一抗;以 1：100、10 和 μ 使用;L in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®488 山羊抗兔 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗。
抗 Tuj 1Abcamab78078，RRID：AB_2256751一抗;用量为 1：1000,1 μL in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®594 只山羊抗小鼠 IgG（1：800，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11005）作为二抗。
抗突触素Abcamab32127， RRID：AB_2286949Primary Antibody;用本品为 1：100， 10 μL in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®488 山羊抗兔 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗。
抗 PSD-95Abcamab2723，RRID：AB_303248一抗;以 1：100、10 和 μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液; 使用 Alexa Fluor ®594 山羊抗鸡 IgG（1：800，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11042）作为二抗。
与 Alexa Fluor 488Abcamab198308;以 1：400、2.5 和 μ 为单位使用;L in 1000 μL 染色液;使用小鼠单克隆 IgG2b Alexa Fluor 注册488 作为同种型对照。
与 Alexa Fluor 488 偶联的抗 TOMM20Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID：AB_628381一抗;以 1：400、2.5 和 μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液;使用小鼠单克隆 IgG2a Alexa Fluor 注册488 作为同种型对照。
抗 NDUFB10Abcamab196019一抗;以 1：1000、1 和 μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液;使用 Alexa Fluor ®488 山羊抗兔 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗;使用兔单克隆 IgG 作为同种型对照。
anti-SDHAAbcamab137040一抗;以 1：1000、1 和 μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液; 使用 Alexa Fluor ®488 山羊抗兔 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11008）作为二抗;使用兔单克隆 IgG 作为同种型对照。
抗 COX IVAbcamab14744，RRID：AB_301443一抗;以 1：1000、1 &μ 的形式使用;L in 1000 μL 染色液;用途 Alexa Fluor >488 只山羊抗小鼠 IgG （1：400，Thermo Fisher Scientific，目录 # A-11001）作为二抗;使用小鼠单克隆 IgG 作为同种型对照。
Activin APeproTech120-14E星形胶质细胞分化培养基成分
ABM 基础培养基LonzaCC-3187星形胶质细胞培养基础培养基
AGM SingleQuots 补充包LonzaCC-4123星形胶质细胞培养补充剂
抗生素-抗真菌剂Thermo Fisher Scientific15240062CDM 成分
高级DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010用于稀释 Geltrex
牛血清白蛋白欧洲生物制品的基础培养基 EQBAH62-1000免疫染色测定中抗体的非特异性结合的封闭剂和 CDM 成分
BDNFPeproTech450-02DA 神经元培养基成分
B-27 补充剂Thermo Fisher Scientific17504044星形胶质细胞分化培养基成分
BD Accuri C6 Plus 流式细胞仪BD Biosciences，美国
成分确定的脂质浓缩Thermo Fisher Scientific11905031CDM 成分
胶原酶 IVThermo Fisher Scientific17104019用于温和解离人 iPSC 的试剂
CCD 显微镜 相机 Leica DFC3000 GLeicaMicrosystems， 德国
康宁 未处理的培养皿Sigma-AldrichCLS430589悬浮培养
DPBSThermo Fisher Scientific14190250用于各种细胞培养洗涤
DMEM/F-12、GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher Scientific10565018星形胶质细胞分化基础培养基
EDTAThermo Fisher用于温和解离人 iPSC15575020
Essential 8 基础培养基Thermo Fisher ScientificA1516901用于 iPSC 培养的基础培养基
Essential 8 添加剂 （50X）Thermo Fisher ScientificA1517101添加剂，用于 iPSC 培养
EGF 重组人蛋白Thermo Fisher ScientificPHG0314添加剂，用于 NSC 培养
FGF 碱性 （AA 10–155） 重组人蛋白Thermo Fisher ScientificPHG0024NSC 培养
胎牛血清Sigma-Aldrich12103C培养基成分
FGF-碱性PeproTech100-18B星形胶质细胞分化培养基成分
FCCPAbcamab120081消除线粒体膜电位和 TMRE 染色
液体抽吸系统 BVC 对照德国 Vacuubrand
甲醛 （PFA） 16%Thermo Fisher Scientific28908细胞固定
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302用于附着和维持人 iPSC
GlutaMAX 添加剂Thermo Fisher Scientific35050061添加剂，用于 NSC 培养
GDNFPeprotech450-10DA 神经元培养基成分
氨酸Sigma-AldrichG8898用于封闭缓冲液
Ham's F-12 营养混合物Thermo Fisher Scientific31765027CDM 基础培养基
Heregulin β-1 人Sigma-AldrichSRP3055星形胶质细胞分化培养基成分
Hoechst 33342Thermo Fisher科学H1399对细胞核进行染色以获得共聚焦图像
Heracell 150i CO2 培养箱Fisher Scientific，美国
IMDM ThermoFisher Scientific21980032用于 CDM 的基础培养基
胰岛素Roche1376497CDM 成分
InSolution AMPK 抑制剂Sigma-Aldrich171261神经诱导培养基成分
胰岛素样生长因子-I 人Sigma-AldrichI3769星形胶质细胞分化培养基成分
KnockOut DMEM/F-12 培养基Thermo Fisher Scientific12660012用于 NSC 培养的基础培养基
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020促进神经细胞的体外附着和生长
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜Leica Microsystems，德国
单硫甘油Sigma-AldrichM6145CDM 成分
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514用于线粒体体积指示剂
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008用于线粒体 ROS 指示剂
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma-AldrichA7250神经诱导培养基成分
N-2 补充剂Thermo Fisher Scientific17502048星形胶质细胞分化培养基成分
正常山羊血清Thermo Fisher ScientificPCN5000用于封闭缓冲液
轨道摇床 - SSM1Stuart Equipment，英国
Poly-L-鸟氨酸溶液Sigma-AldrichP4957在体外促进神经细胞的附着和生长
Poly-D-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-AldrichP7405在体外促进神经细胞的附着和生长
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204促进 DA 神经元分化
ProLong Gold 抗淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36930安装用于共聚焦成像
的盖玻片PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014用于各种洗涤
重组人/小鼠 FGF-8b 蛋白R&D Systems423-F8-025/CF促进 DA 神经元分化
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMP神经诱导培养基成分
StemPro 神经补充剂Thermo Fisher ScientificA10508-01NSC 培养补充剂
TrypLE Express 酶Thermo Fisher Scientific12604013细胞解离试剂
转铁蛋白罗氏652202CDM 成分
TRITON X-100VWR International9002-93-1用于免疫染色测定中的细胞透化
TMREAbcamab113852用于线粒体膜电位染色
水浴 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments，美国
一抗偶联的抗 TFAM 防止化学物 的 Scientific 试剂补充剂 甘

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