从小鼠中分离和培养骨髓衍生树突状细胞的经济有效的方案

摘要

在这里，我们提出了一种经济有效的方法，在用10 ng / mL GM-CSF / IL-4培养7天后从小鼠中分离和产生高纯度骨髓来源的树突状细胞。

摘要

随着免疫学研究的进展，对树突状细胞（DC）的需求正在逐渐增加。然而，DC在所有组织中都很少见。分离DC的传统方法主要涉及通过注射大剂量（>10 ng / mL）的粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子/ 白细胞介素-4（GM-CSF / IL-4）来诱导骨髓（BM）分化为DC，使该过程复杂且昂贵。在该方案中，使用在10ng / mL GM-CSF / IL-4培养基中培养的所有BM细胞，经过3-4次半培养交换后，每只小鼠（两个股骨）收获高达2.7 x 10⁷ CD11c ⁺ 细胞（DC），纯度为80%-95%。培养10天后，CD11c，CD80和MHC II的表达增加，而细胞数量减少。培养7天后细胞数量达到峰值。此外，该方法仅需10分钟即可收获所有骨髓细胞，并且在培养1周后获得大量DC。

引言

树突状细胞（DC）是最强大的抗原呈递细胞（APC），用于激活幼稚的T细胞并诱导针对传染病，过敏性疾病和肿瘤细胞的特定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应^1，2，3。DC是先天免疫和适应性免疫之间的主要纽带，在免疫防御和维持免疫耐受性方面起着至关重要的作用。在过去的40年中，许多研究人员试图定义DC的亚群及其在炎症和免疫中的功能。根据这些研究，DC从骨髓细胞沿着骨髓和淋巴系发展。近年来，肿瘤疫苗取得了重大的里程碑，并拥有光明的未来。在机械上，肿瘤疫苗通过使用肿瘤抗原激活细胞毒性T淋巴细胞来调节免疫反应并防止肿瘤生长。基于DC的疫苗在肿瘤免疫治疗中起着重要作用，已被确定为最有前途的抗肿瘤疗法之一^1，4。此外，DC已广泛应用于新型分子靶向药物和免疫检查点抑制剂的检测⁵.

研究人员迫切需要大量的高纯度DC来进一步研究DC的作用。然而，DC在各种组织和血液中很少见，仅占人类和动物血细胞的1%。骨髓树突状细胞（BMDC）的 体外 培养是获得大量DC细胞的重要方法。同时，用于从骨髓中生成DC的Lutz协议已被研究人员广泛使用

方案

所有程序均经南京医科大学动物保育使用委员会批准。

1. 骨髓分离和BM细胞的制备

1. 通过CO 2窒息处死C57BL / 6小鼠（_18-22g ，6-8周龄）。将鼠标固定在鼠标操作台上。用70%乙醇消毒表面。
2. 切开腿部皮肤以暴露肌肉和股动脉。用两个镊子夹住并撕下股动脉，然后将近端拉向腹部。
   注意:不要直接切除股动脉。否则，会导致出血过多，污染视野。
3. 切除股骨周围的所有肌肉。
4. 慢慢地将小鼠的下肢向外伸展，直到听到髋关节脱位的声音并且可以看到股骨头脱垂。
5. 用剪刀沿着股骨头内侧将下肢与身体分开。
6. 从膝关节末端切开后腿，以获得自由和完整的股骨。
7. 使用纱布去除附着在股骨上的肌肉。
   注意:不要直接撕裂肌肉。小鼠的股骨是脆弱的，必须保持其完整性。
8. 将股骨浸入75%酒精中2-5分钟。

2. BMDC的诱导培养

1. 用PBS冲洗残留的酒精。使用止血镊子夹住股骨的中部和下部，另一套钳夹住股骨的下端。止血钳横向施加到股骨，股骨与骨骺线分离。
   注意:骨骺线在股骨骨折之前不易看到。这一步和后续步骤都是在无菌环境中进行的。
2. 使用 1 mL 注....

结果

从两个股骨中提取1 x 10 7-1.7 x^{10 7}个细胞，并在种植在6孔板中之前重新悬浮在24mL培养基中（图1A）。2天后，通过完全改变培养基去除非贴壁细胞。在更换培养基之前，观察到大量悬浮细胞（图1B）。培养3天后，小细胞集落开始形成。第六天，菌落的大小和数量显著增加。在第七天，细胞数量达到峰值（22 x 10 6-27 x 10⁶），然后逐渐下降（图2A）。DC细胞的表面变得粗糙，具有较长的假足，表现出典型的成熟DC细胞形态（图2B）。流式细胞术分析显示，CD11c阳性与总细胞的比例在第六天为71%，而在第十天该比率增加到96.1%（图2C，2D）。

为了评价.......

讨论

人类和小鼠具有不同的DC亚群，包括经典DC（cDC，包括cDC1和cDC2s），浆细胞样DC（pDC）和单核细胞衍生DC（MoDC）^9，10，11。人们普遍认为，cDC1s调节细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对细胞内病原体和癌症的反应，cDC2调节对细胞外病原体，寄生虫和过敏原的免疫反应¹²。在GM-CSF和IL-4^6，13，14的存在下，可以在小鼠的BM祖细胞体外产生大量^DC。DC的纯度和数量在DC免疫疗法的成功中起着关键作用。研究人员已经表明，两剂1 x 10⁵至1 x 10⁶ DC可以在异种移植模型^1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
&β;-巯基乙醇	Solarbio	M8211
6 孔板	康宁	3516
APC-MHC II	Biolegend	116417
FBS	Gibco	10100
PE-CD80	Biolegend	104707
青霉素-链霉素	Solarbio	P1400
Percp/cy5.5-CD11c	117327
PRMI-1640	Thermo	11875093
重组小鼠 GM-CSF	Solarbio	P00184
重组小鼠 IL-4	Solarbio	P00196
TruStain Fc PLUS （抗小鼠 CD16/32） 抗体	Biolegend	156603