本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL GM-CSF/IL-4的培养条件下培养7天，从小鼠中分离并获得高纯度的骨髓来源树突状细胞。
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本文内容
摘要
摘要
随着免疫学研究的进展，对树突状细胞（DCs）的需求逐渐增加。然而，树突状细胞在所有组织中均十分稀少。传统的树突状细胞分离方法主要依赖于通过注射大剂量（>10 ng/mL）粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-4（GM-CSF/IL-4）诱导骨髓（BM）细胞向树突状细胞分化，该方法操作复杂且成本较高。在本实验方案中，将全部骨髓细胞在含10 ng/mL GM-CSF/IL-4的培养基中培养，经过3–4次半量换液后，每只小鼠（两根股骨）可收获高达2.7 × 107 个CD11c+细胞 （即树突状细胞），纯度达80%–95%。培养10天后，CD11c、CD80和MHC II的表达水平升高，但细胞数量有所下降；细胞数量在培养第7天时达到峰值。此外，该方法仅需10分钟即可完成全部骨髓细胞的采集，且在培养1周后即可获得大量树突状细胞。
引言
树突状细胞（DCs）是激活初始T细胞以及诱导针对感染性疾病、过敏性疾病和肿瘤细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应的最强大的抗原呈递细胞（APCs）1,2,3。DCs是连接先天免疫与适应性免疫的主要桥梁，在免疫防御和维持免疫耐受中发挥关键作用。在过去40年中，许多研究人员致力于定义DCs的不同亚群及其在炎症与免疫中的功能。根据这些研究，DCs来源于骨髓细胞，沿髓系和淋巴系发育。近年来，肿瘤疫苗取得了重要进展，具有广阔的应用前景。从机制上讲，肿瘤疫苗通过肿瘤抗原激活细胞毒性T淋巴细胞，从而调节免疫反应并抑制肿瘤生长。基于DCs的疫苗在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用，已被认为是最具前景的抗肿瘤疗法之一1,4。此外，DCs还被广泛应用于新型分子靶向药物和免疫检查点抑制剂的测试中5。
研究人员迫切需要大量高纯度的树突状细胞（DCs）以进一步研究其功能。然而，树突状细胞在各种组织和血液中极为稀少，在人类和动物中仅占血细胞总数的1%。体外培养骨髓来源的树突状细胞（BMDC）是获得大量DC细胞的重要方法。同时，Lutz实验室建立的从骨髓诱导生成树突状细胞的方案已被研究人员广泛采用6。尽管该方案在获取DC细胞方面效果显著，但操作复杂且成本较高，需添加高浓度的细胞因子并进行红细胞裂解。
本研究中，我们报道了一种从小鼠骨髓（BM）中分离几乎全部骨髓细胞的方法，并在培养7-9天后诱导其分化为骨髓来源的树突状细胞（BMDC）。 体外，使用较低浓度的GM-CSF和IL-4。该方法仅需10分钟即可收获几乎全部骨髓细胞并将其悬浮于完全培养基中。简言之，本研究提供了一种高效且经济的BMDC培养方法。
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方案
所有实验程序均经南京医科大学动物护理与使用委员会批准。
1. 骨髓的分离与骨髓细胞的制备
- 通过 CO2 窒息法处死 C57BL/6 小鼠（18–22 g，6–8 周龄）。将小鼠固定于小鼠手术台上，并用 70% 乙醇消毒表面。
- 切开腿部皮肤以暴露肌肉和股动脉。使用两把镊子夹住并撕下股动脉，然后将近端向腹部方向牵拉。
注意：切勿直接剪断股动脉，否则会导致大量出血并污染视野。 - 切断股骨周围的所有肌肉。
- 缓慢向外牵拉小鼠的下肢，直至听到髋关节脱位的声音，并可见股骨头脱出。
- 沿股骨头内侧用剪刀将下肢与身体分离。
- 从膝关节末端处切断后肢，以获得游离且完整的股骨。
- 使用纱布去除附着在股骨上的肌肉。
注意：切勿直接撕扯肌肉。小鼠股骨较为脆弱，必须保持其完整性。 - 将股骨浸入 75% 酒精中 2–5 分钟。
2. BMDC 的诱导培养
- 用 PBS 冲洗残留的酒精。使用止血钳夹住股骨的中下部，另取一把止血钳夹住股骨远端。止血钳从股骨外侧施加，将股骨从骨骺线处分离。
注意：在股骨发生骨折前，骨骺线不易观察。此步骤及后续步骤均需在无菌环境中进行。 - 使用 1 mL 注射器（针头：0.6 mm × 25 mm）从骨骺线断裂处穿入骨髓腔，旋转针头以穿透股骨头并贯穿整个骨髓腔。用含 GM-CSF/IL-4 的完全培养基 1 mL 反复冲洗骨髓腔，直至骨骼变白。
注意：完全培养基配方：10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素、55 µM β-巯基乙醇、10 ng/mL GM-CSF 和 10 ng/mL IL-4。 - 将所有细胞重悬于 24 mL 完全培养基中（约 5 × 105 个细胞/mL）。混匀后，每孔加入 4 mL 培养基接种至 6 孔板中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 2 天。
注意：无需裂解红细胞。 - 培养 2 天后，更换全部培养基为含 GM-CSF/IL-4 的新鲜培养基7。在第 4、6、8 天时，更换一半培养基为含 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 的完全培养基。
注意：此步骤可去除悬浮细胞，如红细胞和淋巴细胞。 - 每天拍照记录细胞生长情况。从第 6 天开始，每天收集一孔细胞，计数细胞数量，并检测 CD11c、CD80 和 MHC II 的表达水平6,7。
3. 流式细胞术检测CD11c、CD80和MHC II的表达
- 用 PBS 洗涤树突状细胞后，将 1 × 106 个细胞重悬于 100 µL FACS 缓冲液中，加入 0.5 µg 抗小鼠 CD16/32 抗体，冰上孵育 10 分钟，以阻断非特异性抗原结合位点。
- 加入 1 µg Percp/cy5.5-CD11c、0.5 µg PE-CD80 和 0.04 µg APC-MHC II 抗体，冰上孵育 30 分钟。
- 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 3 分钟，弃上清，加入 1 mL 4% 多聚甲醛，在 4 °C 固定 30 分钟，然后重悬于 300 µL FACS 缓冲液中。
- 进行流式细胞术分析。
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结果
从两根股骨中提取出 1 × 107–1.7 × 107 个细胞，并重悬于 24 mL 培养基中，随后接种至 6 孔板中（图 1A）。培养 2 天后，通过完全更换培养基去除未贴壁细胞。在换液前，可观察到大量悬浮细胞（图 1B）。培养 3 天后，开始出现小的细胞克隆。第 6 天时，克隆的数量和尺寸显著增加。第 7 天时，细胞数量达到峰值（22 × 106–27 × 106），随后逐渐下降（图 2A）。树突状细胞（DC）表面变得粗糙，伪足延长，呈现出典型的成熟 DC 细胞形态（图 2B）。流式细胞术分析显示，第 6 天 CD11c 阳性细胞占总细胞的比例为 71%，到第 10 天该比例上升至 96.1%（图 2C、2D）。
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讨论
人类和小鼠具有不同的树突状细胞亚群，包括经典树突状细胞（cDCs，包含cDC1和cDC2）、浆细胞样树突状细胞（pDCs）以及单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）9,10,11通常认为，cDC1细胞调控针对细胞内病原体和癌症的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，而cDC2细胞则调控针对细胞外病原体、寄生虫和过敏原的免疫应答。12可产生大量树突状细胞 体外 从小鼠骨髓祖细胞在GM-CSF和IL-4存在条件下6,13,14. 树突状细胞（DC）的纯度和数量在成功的DC免疫治疗中起着关键作用。研究人员已证实，两次剂量的1 x 105 至 1 × 106 树突状细胞（...
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披露
所有作者声明不存在利益冲突，且无任何需要披露的内容。
致谢
本工作由天津市科学技术计划项目（20JCQNJC00550）和天津市卫生健康科技项目（TJWJ202021QN033 和 TJWJ202021QN034）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β-巯基乙醇 | Solarbio | M8211 | |
| 6 孔板 | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| 重组小鼠 GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| 重组小鼠 IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS（抗小鼠 CD16/32）抗体 | Biolegend | 156603 |
参考文献
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重印与许可
