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非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠全层视网膜血管参数的定量分析

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DOI：

10.3791/63126

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2022年3月12日

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1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department, Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

本文内容

摘要

本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色实验方法，适用于整体视网膜标本，以及用于定量测量在增殖性和非增殖性视网膜病变中常发生变化的血管参数所需的相关实验方案。

摘要

视网膜病变是一组影响眼部神经感觉组织的异质性疾病，其特征为神经变性、胶质增生 以及血管功能和结构的进行性改变。尽管视网膜病变的起始表现为视觉感知的细微障碍，但血管丛的改变是临床医生最早可检测到的体征。是否存在新生血管形成决定了视网膜病变被归类为非增殖性（NPDR）或增殖性（PDR）。为此，多种动物模型被用于模拟各个阶段特定的血管特征，以阐明内皮细胞异常、神经元死亡及其他视网膜内事件的潜在机制。本文将全面描述在出生后第17天（P17）的成年及早产小鼠中测量视网膜血管参数所需的操作步骤。我们将详细说明使用Isolectin GSA-IB4对视网膜整体铺片进行血管染色的实验方案，以便后续显微观察。同时提供利用Image J Fiji软件进行图像处理的关键步骤，使读者能够测量血管密度、管径和扭曲度、血管分支情况，以及无血管区和新生血管区域。这些方法对于评估和量化非增殖性与增殖性视网膜病变中的血管改变具有重要价值。

引言

眼睛由两套动静脉系统提供营养：脉络膜血管系统，即一种外部血管网络，为视网膜色素上皮和光感受器供血；以及神经视网膜血管系统，为视网膜的神经节细胞层和内核层供血1。视网膜血管系统是由血管组成的有序网络，负责向视网膜细胞输送营养物质和氧气，并清除代谢废物，以确保正常的视觉信号转导。该血管系统具有一些独特的特征，包括：缺乏自主神经支配、血管张力由视网膜内在机制调节，以及具有复杂的视网膜-血屏障2。因此，视网膜血管系统成为众多研究者关注的焦点，他们不仅深入研究了发育过程中的血管发生，还广泛探讨了这些血管在疾病状态下发生的结构改变及病理性血管生成3。在视网膜病变中常见的血管变化包括血管扩张、新生血管形成、血管分支结构丧失以及视网膜主干血管变形，使其形态更加曲折4,5,6。上述一种或多种改变是临床医生最早可检测到的体征。血管可视化技术提供了一种快速、无创且经济的筛查方法7。对血管树中观察到的异常改变进行深入研究，有助于判断视网膜病变属于非增殖性或增殖性，并指导后续治疗方案。非增殖性视网膜病变可表现为异常的血管形态、血管密度降低、无细胞毛细血管、周细胞死亡、黄斑水肿等。此外，增殖性视网膜病变还伴有血管通透性增加、细胞外基质重塑，以及向玻璃体腔方向形成易破裂或诱发视网膜脱离的血管簇8。

一旦发现，可通过视网膜血管的变化来监测视网膜病变9,10。通过观察血管的结构改变，可以追踪该疾病的进展，这些结构变化明确界定了疾病的不同阶段11。在这些模型中对血管改变进行定量分析，有助于将血管变化与神经元死亡相关联，并可在疾病的不同阶段对患者进行药物治疗的测试。

鉴于上述情况，我们认为在视网膜病变研究中，识别和量化血管改变至关重要。在本研究中，我们将展示如何测量不同的血管参数。为此，我们将采用两种动物模型。其中一种是氧诱导视网膜病变小鼠模型12，该模型可模拟早产儿视网膜病变以及增殖性糖尿病视网膜病变的某些特征13,14。在此模型中，我们将测量无血管区域、新生血管区域以及主血管的扩张程度和扭曲度。在我们实验室中，已建立一种代谢综合征（MetS）小鼠模型，可诱导非增殖性视网膜病变15。在此模型中，我们将评估血管密度和分支情况。

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方案

C57BL/6J小鼠的饲养和操作遵循ARVO《眼科与视觉研究中动物使用声明》的指导原则。实验方案由科尔多瓦国立大学化学学院机构动物护理与使用委员会（CICUAL）设计并批准（决议HCD 1216/18）。

1. 缓冲溶液和试剂的配制

  1. 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的制备：将8 g氯化钠（NaCl）、0.2 g氯化钾（KCl）、14.4 g二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）和0.24 g磷酸二氢钾（KH2PO4）加入800 mL蒸馏水中。搅拌溶液直至盐类完全溶解。用盐酸（HCl）调节pH至7.4，并用额外的蒸馏水定容至1 L。过滤溶液后于4 °C保存。
  2. 4%多聚甲醛（PFA）的制备：将40 g固体PFA加入800 mL新配制的PBS中。在恒温60 °C的加热板上搅拌溶液。逐滴加入1 M氢氧化钠（NaOH），直至PFA完全溶解，并确保pH维持在7.2–7.4范围内。用PBS补足体积至1,000 mL并混匀。关闭加热板，待溶液温度降至35 °C以下时进行过滤。溶液可在4 °C保存最多3天。
    警告：PFA若吞咽或吸入有害，可能具有致突变性。整个操作过程中需佩戴手套和口罩，并在安全柜内操作。
  3. 1×Tris缓冲盐水（TBS）的制备：将6.1 g Tris和9 g NaCl加入800 mL蒸馏水中。搅拌至盐类完全溶解。用HCl调节pH至7.4，并用蒸馏水定容至1 L。过滤溶液后于4 °C保存。
  4. TBS-0.1% Triton X-100的制备：将0.1 mL Triton X-100加入100 mL TBS中。轻轻混匀，4 °C保存最多1周。
    注意：由于Triton为高密度去垢剂，建议略微剪切移液枪头末端以便更顺畅地移液。
  5. TBS-5%牛血清白蛋白（BSA）-0.1% Triton X-100的制备：称取5 g BSA，加入TBS-0.1% Triton X-100溶液至终体积100 mL，轻轻搅拌。分装后于-20 °C保存，最多可保存2个月。
  6. 异凝集素GSA-IB4 Alexa Fluor-488偶联物（Isolectin GSA-IB4）的配制：称取36.75 mg二水合氯化钙（CaCl2·2H2O），加入500 mL新配制的PBS中，用磁力搅拌器搅拌溶解。用移液器吸取500 µL CaCl2/PBS溶液，加入含有500 µg冻干Isolectin GSA-IB4粉末的小瓶中。轻轻混匀后分装至0.5 mL离心管中。避光保存于-20 °C。
  7. 聚乙烯醇-甘油/Tris封片剂的制备：称取2.4 g聚乙烯醇（Poly(vinyl alcohol)），加入6 g甘油并轻轻搅拌。随后加入6 mL水，并在室温下持续搅拌数小时。加入12 mL预热的0.2 M Tris溶液（pH 8.5），在50 °C恒温加热10分钟，期间偶尔搅拌。最后，以5,000 × g离心15分钟以澄清溶液。
    ​注意：待溶液冷却至室温后分装，于-20 °C保存。

2. 荧光凝集素染色

  1. 通过吸入二氧化碳（CO2）处死小鼠后，使用剪刀摘除眼球16。用新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）在室温（RT）下固定摘除的眼球1小时。
    注意：也可将眼球在4°C条件下于4% PFA中过夜（ON）固定。小鼠处死遵循《ARVO眼科与视觉研究中动物使用声明》以及科尔多瓦国立大学化学科学学院机构动物护理与使用委员会（CICUAL）的指南（决议HCD 1216/18）。
  2. 在解剖显微镜下，用剪刀沿角膜缘剪除角膜，并完整剥离视网膜。弃去眼球前段组织，随后将视网膜从视网膜色素上皮层-脉络膜（RPE-Choroid）分离。
    注意：务必使用镊子清除视网膜上残留的碎片和玻璃体血管。
  3. 将视网膜置于200 µL离心管中。随后，在含有5%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Triton-X-100的100 µL Tris缓冲盐溶液（TBS）中，在4°C条件下轻轻振荡孵育6小时，以进行封闭和通透处理。
    注意：此步骤也可在室温下进行2小时。
  4. 然后将管子倒置，使视网膜附着于管盖内，用移液器吸除封闭液。
  5. 加入100 µL含有0.01 µg/µL Isolectin GSA-IB4（GSA-IB4）的溶液。用铝箔包裹离心管以避光。在4°C条件下过夜（ON）或在室温下轻轻振荡孵育2小时。
  6. 用含0.1% Triton-X-100的100 µL TBS溶液在振荡器上轻轻振荡洗涤视网膜20分钟。为确保充分洗涤，将管子倒置使视网膜位于管盖内；再将管子恢复直立位置，吸除容器中残留液体。重复该步骤三次。
  7. 将视网膜置于载玻片上，滴加一滴PBS。在解剖显微镜下，从视网膜边缘向视神经方向做四个等距切口。
  8. 使用镊子或小片滤纸展开视网膜瓣。确保感光细胞侧朝下。
  9. 用滤纸吸除载玻片上残留的PBS。然后加入封片介质（聚乙烯醇溶于甘油/Tris缓冲液），加盖盖玻片。在室温下干燥1小时。
  10. 将载玻片置于4°C避光保存。
    ​注意：视网膜也可在4°C条件下保存于PBS中，直至进行共聚焦显微镜观察。

3. 共聚焦显微镜观察与显微图像采集

  1. 成像前，将载玻片在避光条件下室温孵育 10 分钟。
  2. 在共聚焦显微镜上，将载玻片倒置于载物板上。
  3. 聚焦视网膜血管的浅层血管丛，并选择一个区域作为图像采集的起始点。
  4. 在软件中设置通用激光参数：波长：488 nm；激光强度；HV；偏移量（Offset）；增益（Gain）。
    注意：激光强度、PMT、偏移量和增益可能因实验条件和光源使用情况而异。最佳设置应提供清晰的血管图像，同时避免光电倍增管灵敏度饱和，以确保荧光信号的线性关系。
  5. 设置其他采集参数：模式；图像尺寸；物镜，不使用缩放；不启用卡尔曼滤波（No Kalman）；步进大小（Step Size）。
    注意：对照样本和实验样本的成像必须使用相同的采集条件。
  6. 设置 x 和 y 轴坐标：以 2 倍放大率聚焦扫描视网膜。若该区域可见血管，则通过双击该区域两次进行标记，以便后续图像采集。
    注意：建议沿视网膜上部血管丛选择成像区域，因为较大血管的荧光信号更强。
  7. 在网格中移动至相邻方格，聚焦视网膜并选择相应区域。重复此步骤，直至所选区域覆盖整个视网膜。
  8. 选择一个区域，并设置 z 轴坐标以定义扫描的厚度范围。操作方法为：以 2 倍放大率观察视网膜；使用显微测微尺移动至视网膜顶部，点击设置 作为起始位置（Start position）；然后移动至视网膜底部，点击设置 作为终止位置（End position）。
  9. 在网格中每个选定的区域重复步骤 3.8。
    注意：为验证深度扫描范围，可点击前往 起始位置。若仍可见血管，需通过调节显微测微尺重新定位，然后点击设置。终止位置同样需重复此过程。
  10. 启动自动扫描。
  11. 扫描完成后，打开图像。
  12. 选择序列 格式，将图像保存为拼接图像（Mosaic），并使用首选的文件扩展名保存。最终，拼接后的图像将显示在屏幕上。

4. 图像处理

  1. 在 ImageJ FIJI 软件中，进入 菜单栏，点击 文件 > 打开，选择要处理的图像。在 Bio-Formats 导入选项 窗口中，勾选 显示 OME-XML 元数据，然后点击 确定。
    注意：名称相似的图像应保存在不同的文件夹中。
  2. 在 OME 元数据 窗口中，查找像素尺寸信息，其名称为 PhysicalSizeX、PhysicalSizeY 和 PhysicalSizeZ。复制此数据。
  3. 进行图像校准时，进入 菜单栏，选择 图像 > 属性。将步骤 4.2 中的信息填入并点击 确定。图像将以包含多张照片的窗口形式打开，每张照片代表在 z 轴不同位置获取的显微图像。
  4. 为图像分配一个首选的 LUT（颜色查找表），以便为荧光标记赋予颜色。操作方法是进入 菜单栏，点击 LUT 图标。
  5. 要将所有图层堆栈合并为单张图像进行可视化，进入 菜单栏，选择 图像 > 堆栈 > Z 投影。
  6. 在弹出的 Z 投影窗口中，选择所有可观察到血管的图层堆栈。在“投影类型”中选择 平均强度，然后点击 确定。
    注意：堆栈叠加的结果将以新图像形式显示，命名为 AVG（图像名称）。
  7. 调整结果图像的亮度和对比度，以降低背景信号并突出血管结构。进入 菜单栏，点击 图像> 调整> 亮度/对比度。在亮度和对比度窗口中移动滑块，直至观察到更佳的信号强度。点击 应用 并保存更改。
  8. 复制所选的 亮度/对比度 参数；所有图像必须使用完全相同的参数设置。
  9. 在进行图像定量分析之前，需定义将要测量的参数。进入 菜单栏，选择 分析 > 设置测量。在本流程中，需要获取面积和周长（后者也可用于距离测量）。设置完成后点击 确定。
  10. 下载用于血管密度定量分析所需的插件17 ，并按照该插件提供的安装说明进行操作。
  11. 继续对特定的血管参数进行定量分析。

5. 无血管区域的定量分析

  1. 在菜单栏中选择魔棒工具，选中视网膜无血管区域。
    注意：可根据容差选择较大或较小的区域。如需调整容差，请双击魔棒工具图标。所用模式：Legacy。
  2. 在键盘上按下字母 T，将所选区域记录到 ROI 管理器中。对视网膜的所有无血管区域重复步骤 5.1 和 5.2。
  3. 在 ROI 管理器中点击测量以获取无血管区域的信息。程序将显示一个包含所需信息的新窗口。将数据复制到其他程序中或保存文件。
    注意：在某些图像中，用户可能更倾向于手动选择无血管区域。此时请选择多边形选区工具，在无血管区域周围绘制短距离线段，当开始绘制新线段时点击图像。通过点击第一个点来闭合所选区域。
  4. 重复步骤 5.1、5.2 和 5.3，以测量视网膜的总面积。
  5. 计算视网膜无血管区域的比例，即所有测得的无血管区域之和除以视网膜的总面积。

6. 新生血管区域的定量分析

  1. 在菜单栏中，选择 魔棒工具。
  2. 放大图像以更清晰地观察新生血管。使用魔棒工具逐一选择新生血管。
    注意：调整容差值不超过 20，以确保仅选中单个新生血管。在所有图像定量分析过程中，该容差水平必须保持不变。
  3. 按下键盘上的 T 键，将选定区域记录到 ROI 管理器中。对视网膜的所有新生血管区域重复执行步骤 6.1 和 6.2。
  4. 在 ROI 管理器中点击 测量 以获取面积数据。程序将显示一个包含所需信息的新窗口。将数据复制到其他程序中或保存文件。
  5. 重复步骤 6.1、6.2 和 6.3，以定量分析视网膜的总面积。
  6. 通过将所有测量得到的新生血管面积之和除以视网膜的总面积，计算视网膜新生血管面积比例。

7. 血管直径的定量分析

  1. 在菜单栏中，选择直线工具。
  2. 放大图像以更清晰地观察血管壁。在第一条分支之前，对主血管绘制三条垂直于血管走向的横线。操作时需从血管壁一侧边界画至对侧边界。
    注意：为避免定量误差，所画直线必须严格垂直于血管壁。
  3. 按下键盘上的 T 键，将选定区域记录到 ROI 管理器中。对所有需要定量分析的血管，重复执行步骤 7.1 和 7.2。
  4. 点击 ROI 管理器中的测量以获取距离数据。程序将弹出一个显示所需信息的新窗口。将数据复制到其他程序中或直接保存文件。

8. 血管扭曲度的定量分析

  1. 在菜单栏中，用鼠标右键单击直线工具图标，然后选择分段线或自由手绘线。沿血管走向，从视神经开始，在血管内绘制一条线，直至第一个血管分支部位，跟随 血管形态进行绘制。
    注意：为避免定量误差，所绘线条必须贴合血管的实际形态。
  2. 按下键盘上的 T 键，将选定区域记录到 ROI 管理器中。
  3. 在菜单栏中，选择直线工具。从视神经开始，绘制一条直线至第一个血管分支部位。
  4. 按下键盘上的 T 键，将选定区域记录到 ROI 管理器中。
  5. 在 ROI 管理器中点击测量，以获取距离数据。程序将显示一个包含所需信息的新窗口。将数据复制到其他程序中，或保存该文件。
  6. 按以下方式计算迂曲指数：使用分段线测得的距离除以使用直线测得的距离。

9. 血管分支的定量分析

  1. 使用菜单栏中的椭圆工具，定义一个适用于所有实验条件的区域。所选区域必须是以视神经为中心绘制的同心圆。
  2. 在键盘上按下字母 T，将选定区域记录到 ROI 管理器中。
    注意：在此情况下，建议保存 ROI，因为定量过程较慢，且所有图像中必须使用相同的 ROI。为此，在 ROI 管理器中点击更多 > 保存。
  3. 手动计数选择区域内主血管发出的初级分支数量。
  4. 在邻近区域重复步骤 9.2 和 9.3，保持视神经-周边区域的标准。

10. 血管密度的定量分析

  1. 将图像转换为8位模式。
  2. 在菜单栏中进入插件，选择血管分析 > 血管密度。
  3. 使用菜单栏中的方形工具定义需要测量血管密度的区域，然后点击确定。
  4. 程序将显示一个包含所需信息的新窗口。将数据复制到其他程序中，或保存文件。
  5. 在邻近区域重复步骤10.2、10.3和10.4，保持感兴趣区域（ROI）不变，但将其依次放置九次，覆盖整个视网膜的周边和中心区域。

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结果

如方案部分所述，通过一次荧光染色实验，即可获得血管形态，并对多个感兴趣的参数进行定量评估。具体需寻找的异常特征取决于所研究的视网膜病变类型。本文在增殖性视网膜病变的小鼠模型中评估了无血管区、新生血管区、血管扭曲度和扩张情况，而在代谢综合征（MetS）小鼠模型中分析了血管分支和血管密度，该模型可诱导非增殖性视网膜病变。

在第一个实验示例中，采用了氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型，该模型类似于早产儿视网膜病变以及糖尿病性视网膜病变增殖期的某些特征。在此模型中，幼鼠与其哺乳母鼠一起在高氧环境中饲养，从出生后第7天（P7）持续至P1218。在P12时进行玻璃体内注射，以评估某种药物作为抗血管生成剂的有效性（该条件称为治疗组）。小鼠在P17时被处死，此时为新生血管形成的峰值时间点19。注射溶剂的小鼠作为对照组。两组样本均固定后共同使用Isolectin GSA-IB4染色。共聚焦显微镜成像后，图像按照上述方法使用ImageJ FIJI软件进行分析。利用共聚焦显微镜内置的拼接模块，可将整个视网膜铺...

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讨论

视网膜病变的动物模型是研究血管发育、重塑或病理性血管生成的有力工具。该领域内这些研究的成功依赖于组织的易获取性，从而可开展多种技术操作，获得广泛的数据 体内 和 死后 小鼠26,27此外，已发现存在高度相关性 体内 研究与临床分析，为这些模型提供了可靠的可追溯性和稳健性28本文提供了一种简单且可靠的实验步骤，用于表征小鼠视网膜血管疾病模型中的血管网络。在现有文献中，读者可找到其他可测量的参数以及与本文所选方法并行的量化手段。本综述所汇集的实验方案相较于其他方法具有多项优势：其可重复性强，且仅需使用一款免费软件（Image J Fiji）即可完成数据分析。

此外，这些方案易于由对程序没有深入了解的学生操作，且大多数测量无需额外插件（血管密度除外）。

样品提取和荧光染色技术简单且快速

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

感谢阿根廷科尔多瓦（Córdoba, Argentina）科尔多瓦微纳中心（CEMINCO, CONICET-UNC）的Carlos Mas、María Pilar Crespo和Cecilia Sampedro在共聚焦显微镜方面的协助，感谢Soledad Miró和Victoria Blanco在动物护理方面的辛勤工作，以及Laura Gatica在组织学方面的技术支持。同时感谢FCQ机构传播副秘书Victor Diaz在视频制作与编辑方面的贡献，以及Paul Hobson对稿件的审阅和语言修改。

本文由科尔多瓦国立大学科学技术秘书处（SECyT-UNC）2018–2021年巩固项目、国家科学技术研究基金（FONCyT）科学与技术研究项目（PICT）2015年N° 1314（全部致M.C.S.）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝箔
牛血清白蛋白MerckA4503质量
二水合氯化钙MerckC3306
盐酸Biopack9632.08
共聚焦显微镜 FV1200OlympusFV1200带电动载物台
盖玻片Paul Marienfeld GmnH & Co.111520
解剖显微镜NIKONSMZ645
二水合磷酸氢二钠Merck119753
200 µL  管MerckZ316121
滤纸MerckWHA5201090
摇床培养箱 GyroMiniLabNet InternationalS0500
来自盾叶云实（Griffonia simplicifolia）的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor 488 标记物InvitrogenI21411
聚乙烯醇（Mowiol 4-88）Merck475904
多聚甲醛Merck158127
pH 计SANXINPHS-3D-03
氯化钾MerckP9541
磷酸二氢钾Merck1,04,873
载玻片Fisher Scientific12-550-15
氯化钠MerckS3014
氢氧化钠MerckS5881
TrisMerckGE17-1321-01
Triton X-100MerckX100-1GA
血管分析 Fiji 软件Mai Elfarnawanyhttps://imagej.net/Vessel_Analysis

参考文献

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