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方法文章

从小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞用于单细胞多组学实验

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⸱

DOI：

10.3791/63128

⸱

2021年10月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

我们介绍一种方法，用于从暴露于稳定或扰动血流条件的小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞和细胞核，以进行单细胞组学实验。

摘要

动脉粥样硬化是一种影响暴露于紊乱血流（d-flow）动脉区域的炎症性疾病。d-flow 在转录组和表观基因组水平上调控内皮细胞中基因的表达，从而引发促动脉粥样硬化反应。近期，研究人员利用小鼠颈动脉部分结扎（PCL）模型，开展了单细胞RNA测序（scRNAseq）和单细胞转座酶可及染色质测序（scATACseq）研究，以在单细胞分辨率下解析转录组变化及染色质可及性的改变。由于内皮细胞（ECs）仅占动脉壁总细胞群体的一小部分，因此采用管腔消化法获取富含内皮细胞的单细胞悬液。在本研究中，通过对小鼠实施PCL手术，诱导其左侧颈动脉（LCA）产生d-flow，同时以右侧颈动脉（RCA）作为对照。在PCL手术后两天或两周时取出颈动脉，对每侧颈动脉管腔进行胶原酶消化，获得富含内皮细胞的单细胞或单细胞核悬液。随后使用10x Genomics微流控系统对这些单细胞和单细胞核进行条形码标记。条形码标记后的单细胞和单细胞核被用于RNA提取、文库构建，并在高通量DNA测序仪上进行测序。经过生物信息学分析后，scRNAseq和scATACseq数据集鉴定了来自管腔消化样本的多种细胞类型，主要为ECs，同时也包含平滑肌细胞、成纤维细胞和免疫细胞。这种内皮细胞富集方法有助于深入理解血流对内皮细胞的影响，而这一目标若采用全动脉消化法则难以实现。该内皮细胞富集的单细胞制备方法可用于在内皮细胞特异性基因敲除或转基因小鼠中开展单细胞组学研究，以探索尚未被研究过的基因在血流作用下的功能。更重要的是，该技术可被改进用于从人动脉离体组织中分离富含内皮细胞的单细胞，从而开展类似的机制性研究。

引言

本实验室先前已证实，d-flow 的诱导可导致高脂血症小鼠快速且稳定地发展动脉粥样硬化1,2。利用部分颈动脉结扎（PCL）手术，成功建立了新型的 d-flow 诱导型小鼠动脉粥样硬化模型3。PCL 手术可在结扎侧左颈动脉（LCA）中诱导形成低流量且振荡的血流状态，即 d-flow；而对侧右颈动脉（RCA）则持续承受稳定的层流（s-flow）。此前，为了研究 d-flow 对内皮细胞的影响，在部分结扎手术后将颈动脉解剖取出，并使用含酚和硫氰酸胍的裂解液冲洗血管腔（腔内 RNA/DNA 冲洗法）2,4，从而获得富含内皮细胞的"混合总量" RNA 或 DNA。这些混合总量 RNA 或 DNA 随后分别用于转录组分析或表观基因组 DNA 甲基化组研究4,5,6。这些研究帮助发现了多个对血流敏感的基因和微小 RNA，其在内皮细胞生物学及动脉粥样硬化中的作用已得到广泛深入的研究4,6,7。

然而，尽管进行了内皮细胞富集，这些批量RNA/DNA研究仍无法区分动脉壁中每种细胞类型在d-flow诱导的动脉粥样硬化中的特定作用。为了克服这一局限性，开展了内皮细胞富集的单细胞（sc）分离以及 单细胞RNA测序（scRNA）和单细胞ATAC测序（scATAC）研究8。为此，对C57Bl6小鼠实施PCL手术，以在左颈总动脉（LCA）中诱导d-flow，同时以暴露于s-flow的右颈总动脉（RCA）作为对照。PCL手术后2天或2周，处死小鼠并解剖分离颈动脉并进行清理。用胶原酶灌注双侧LCA和RCA的管腔，收集含有内皮细胞（ECs）作为主要成分及其他动脉细胞的管腔胶原酶消化液。制备单细胞悬液（用于scRNAseq）或单细胞核悬液（用于scATACseq），并使用10x Genomics系统为每个细胞或细胞核添加唯一的条形码标识。随后对RNA进行cDNA文库构建并测序。

scRNAseq 和 scATACseq 数据集使用 Cell Ranger 单细胞软件进行处理，并通过 Seurat 和 Signac R 软件包进一步分析9,10。根据标志基因和独特的基因表达模式，将每个细胞和细胞核分配至相应的细胞类型并进行聚类。scRNAseq 和 scATACseq 的结果表明，这些单细胞样本中富含内皮细胞（ECs），同时也包含平滑肌细胞（SMCs）、成纤维细胞和免疫细胞。

进一步分析表明，管腔消化获得的内皮细胞（EC）群体具有高度异质性和可塑性（包含8种不同的EC亚群），并且对血流具有响应性。最重要的是，这些结果证明，d-flow 可将内皮细胞从抗动脉粥样硬化保护性的抗炎表型重编程为促动脉粥样硬化表型，包括促炎表型、内皮-间充质转化表型、内皮干细胞/前体细胞转化表型，而最令人意外的是，还出现了内皮细胞向类免疫细胞转化的表型。此外，单细胞ATAC测序（scATACseq）数据以全基因组方式揭示了新的依赖于血流的染色质可及性变化及转录因子结合位点，为多个新假说的提出提供了基础。以下详细描述了从小鼠颈动脉获取单个内皮细胞用于单细胞多组学研究的实验方法与操作流程。

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方案

以下所述的所有动物实验程序均经埃默里大学机构动物护理和使用委员会批准。采用非高胆固醇血症、年龄和性别相匹配的C57BL/6小鼠，以减少性别依赖性差异，并排除高胆固醇血症条件可能带来的任何干扰。

1. 颈动脉部分结扎（PCL）手术

注意：左侧颈总动脉的部分结扎操作按照先前描述并展示的方法进行3。

  1. 在整个手术过程中，使用异氟烷蒸发器通过吸入异氟烷（诱导时为5%异氟烷混合氧气，之后维持在1.5%）对小鼠进行麻醉。将小鼠仰卧于Deltaphase等温垫上，以防止术中体温流失。
  2. 涂抹眼药膏以预防暴露性角膜炎，并通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。
  3. 皮下注射布托啡诺0.05 mg/kg，以预先控制疼痛。对脱毛区域使用聚维酮碘和异丙醇溶液进行三次擦拭消毒。确保聚维酮碘为最后一步，从中心向外周进行手术区域灭菌。
  4. 采用无菌技术，在颈部区域做腹侧正中切口（约1 cm），并通过钝性分离暴露左颈总动脉（LCA）分支点。
  5. 使用6-0丝线结扎左侧颈内动脉、颈外动脉和枕动脉；保留甲状腺上动脉不结扎。
  6. 对合皮肤，并使用组织胶和/或缝线关闭切口。
  7. 将小鼠转移至预热的恢复笼（维持在37 °C），并将其置于干净毛巾上最多1小时，以避免术后低体温。
    注意：根据我们的经验，术前单次给予布托啡诺（0.05 mg/kg）通常足以控制术后疼痛。若动物在术后24小时后仍表现出痛苦，可再次给药。若操作正确，该手术无相关死亡率，且小鼠术后应激极小。术后小鼠返回各自笼具，并在术后每日进行监测。
  8. 准备灌注装置。
    1. 使用含有10 U/mL肝素的0.9% NaCl（生理盐水）静脉输液袋。将输液袋悬挂于距地面244–274 cm（8–9英尺）处，或比解剖板高约122–152 cm（4–5英尺）。将蝶形针连接至盐水管道末端，并排出输液管中的所有气泡。

2. 处死后颈动脉的分离

  1. 根据机构IACUC规程，通过吸入CO2处死小鼠。
  2. 用70%乙醇喷洒小鼠皮肤，并将其仰卧位放置在含有吸水纸巾的解剖板上。使用胶带或21 G针头将小鼠的四肢固定在解剖板的吸水纸巾上。
  3. 使用一把无菌剪刀，从腹部开始沿体表向上剪至胸腔顶部，去除小鼠皮肤。
  4. 用剪刀在肋骨下方钝性分离，切开腹壁。
  5. 用剪刀沿膈肌长度方向小心剪开，并继续向胸腔两侧肋骨剪开，直至胸骨可被抬起。用镊子轻轻抬起胸骨；随后移除肋骨以暴露心脏。
  6. 小心移除覆盖在心脏上的胸腺及所有结缔组织，以清晰观察主要血管。
  7. 用剪刀切断下腔静脉，使血液从闭合循环系统中流出。
  8. 将连接输液管的21 G蝶形针从心尖插入左心室，用室温生理盐水逆行灌注2–3分钟。通过将生理盐水袋悬挂于距地面8–9英尺的高度，确保生理盐水保持恒定流速。
    注意：肺和肝脏变为苍白，提示灌注充分。每只小鼠约使用20 mL灌注缓冲液。
  9. 去除颈部区域的皮肤，并清除所有脂肪、肌肉和结缔组织，以暴露颈总动脉（图1A）。
    注意：后续操作均在解剖显微镜下进行。
  10. 调整视野以定位结扎部位。使用10 mm显微解剖剪刀，在左颈总动脉（LCA）结扎点下方做一小切口，以便灌注。
  11. 再次经左心室灌注额外1分钟，确保左颈总动脉充分灌注且无可见血液残留。
  12. 在颈总动脉仍连接于身体的状态下，使用尖头镊子和小型弹簧剪刀小心去除血管周围外膜组织。
    注意：在此清洁步骤中务必极其小心，避免挤压或牵拉颈总动脉，否则可能导致非活细胞数量增加。若操作得当，最终细胞悬液中的细胞活力通常>93%。

3. 小鼠颈动脉内皮细胞富集的单细胞分离

注意：以下试剂可预先配制，并在 4 °C 下保存至使用前：含 表 1 所列试剂的 1× 和 0.1× 单细胞核裂解缓冲液；含 表 1 所列试剂的单细胞核洗涤缓冲液；含 表 1 所列试剂的单细胞核 Nuclei 缓冲液配方。这些缓冲液的工作液应按照制造商的说明书进行配制。消化缓冲液成分：在含 0.5% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入胶原酶 II 型（600 U/mL）和 DNase I（60 U/mL）。

  1. 颈动脉仍附着时，用生理盐水冲洗颈动脉外表面，以清除残留的血液痕迹。
  2. 使用装有29 G针头的胰岛素注射器，向左侧颈动脉远端管腔内注入约50 µL消化缓冲液。当消化缓冲液开始充满颈动脉时，用微型夹夹闭颈动脉近端（图1B）。再向管腔内注入额外15–20 µL消化缓冲液，并夹闭远端以防止消化缓冲液泄漏。
  3. 小心地将颈动脉从小鼠体内取出（图1B、C），并将其置于含有温热（37 °C）HEPES缓冲盐溶液的35 mm培养皿中。
    注意：确保两个夹子均牢固固定。如果夹子松动，消化液可能从管腔泄漏，影响获得的细胞数量。若发生泄漏，应通过颈动脉开放端使用装有29 G针头的胰岛素注射器补充额外的酶溶液，并重新固定夹子（图1D）。如果酶缓冲液再次泄漏，可能是由于取材过程中颈动脉被切断。此时应丢弃该颈动脉，并将样本排除在研究之外。反复粗暴操作会降低细胞活力和单细胞制备质量。务必注意识别并正确标记左侧和右侧颈动脉。
  4. 将取出的颈动脉在37 °C条件下孵育45分钟，并间歇性轻轻摇动。

4. 冲洗颈动脉

  1. 完成管腔内酶消化后，将颈动脉连同夹子一起从35 mm培养皿中取出。小心移除每个夹子，注意避免消化缓冲液泄漏。
  2. 用精细镊子轻轻夹住颈动脉的一端，置于1.5 mL微量离心管上方。另一只手将连接胰岛素注射器（内含100 µL预热至37 °C的消化缓冲液）的29 G针头插入血管腔内（图1D）。
  3. 迅速将颈动脉管腔内容物冲洗至微量离心管中。向1.5 mL离心管中加入0.3 mL胎牛血清（FBS），以终止酶反应。将离心管置于冰上。
    注意：冲洗液中含有管腔内酶消化所得的细胞。加入FBS并降低温度可停止酶消化过程。若细胞悬液中细胞数量较多且含有碎片或脂肪组织，强烈建议使用50或70 µm细胞筛过滤去除不需要的组织碎片。为提高单细胞得率，建议多次冲洗多根颈动脉并合并收集。本实验中，为获得至少5,000个细胞，共冲洗并合并10–12根颈动脉作为一份样本。
  4. 使用配备固定角度转子的离心机，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟（参见材料表）。
  5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含细胞解离试剂的消化缓冲液中（参见材料表），在37 °C孵育5分钟，使所有细胞充分解离为单细胞状态。
    注意：若细胞数量较少，可将离心速度提高至2,000–3,000 × g以确保细胞完全沉淀。此外，使用0.5 mL离心管有助于更清晰地观察管底的细胞沉淀。
  6. 向0.5 mL离心管中加入0.15 mL FBS，终止酶反应。
  7. 如同步骤4.4所述，使用配备固定角度转子的离心机，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟，对单细胞悬液进行离心。
  8. 弃去上清液，将细胞重悬于0.2 mL微量离心管中的100 µL冰上预冷的含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液中。
    注意：使用0.2 mL离心管可增强对管底单细胞沉淀的可视化观察。

5. 单细胞和单细胞核分析

  1. 重悬单细胞样品并提交进行单细胞 RNA 测序（scRNAseq）。
    1. 用 100 µL 冰上预冷的含 1% BSA 的 PBS 溶液重悬单细胞沉淀，置于 0.2 mL 离心管中。
    2. 完成单细胞重悬后，立即使用基于微流控的单细胞分选与条形码标记系统进行单细胞封装和条形码标记（参见材料表）。
    3. 在将样品提交至基因组核心实验室之前，需对单细胞悬液进行计数和检查，确保无细胞聚集体。
      ​注意：可通过将 BSA 浓度提高至 2% 进一步减少细胞聚集现象。
  2. 重悬单细胞样品并提交进行单细胞 ATAC 测序（scATACseq）。
    1. 用 100 µL 冰上预冷的含 0.04% BSA 的 1× PBS 溶液重悬细胞沉淀，并在 4 °C 条件下以 500 × g 离心单细胞悬液。
    2. 用冰上预冷的 0.1× 裂解缓冲液（表 1）裂解单细胞悬液，在冰上孵育 5 分钟。
    3. 用 P-20 移液器吹打裂解物 10 次，并继续在冰上孵育 10 分钟。
    4. 向裂解后的细胞中加入 500 µL 预冷的洗涤缓冲液（表 1），用移液器吹打混合 5 次。
      注意：使用 70 µm 细胞滤网过滤细胞悬液中的碎片，并将滤液转移至 2 mL 离心管中。
    5. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心裂解物 5 分钟，弃去上清液，将细胞核沉淀重悬于稀释后的细胞核缓冲液（150 µL）中（参见材料表和表 1）。使用血细胞计数板对单细胞核悬液进行计数和检查11。
    6. 将单细胞核样品提交至基因组核心实验室，进行单细胞核转座、细胞核分选、文库构建及测序。
      注意：若起始细胞数量较少，常可在细胞核周围观察到碎片。因此建议从较高的细胞起始数量开始实验。

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结果

对44只小鼠进行了颈动脉部分结扎手术，并在术后第一天通过超声成像验证了左侧颈动脉（LCA）中d-flow的形成。成功的部分结扎手术会导致LCA中的血流速度降低并引起血流方向逆转（紊乱血流）3。在结扎术后两天或两周时，分别解剖取出颈动脉。对每侧颈动脉管腔进行胶原酶消化，制备富含内皮细胞的单细胞或单细胞核悬液。为提高细胞产量，将来自10只右侧颈动脉（RCA）和左侧颈动脉（LCA）的单细胞悬液合并。所制备的细胞/细胞核随后进行条形码标记并测序。在单细胞RNA测序（sc-RNAseq）研究中，获得的单细胞数量约为9,700个。4个样本的细胞分布情况见Table 2。

同样，在scATACseq研究中，从制备的12个RCAs和LCAs中分离单细胞，经过转座酶处理、加条形码标记后进行测序。测序共获得18,324个单细胞核，分别来自1,291个（2天RCA [2D-R]）、5,351个（2天LCA [2D-L]）、5,826个（2周RCA [2W-R]）和5,856个（2周LCA [2W-L]）样...

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讨论

本文提供了一种从鼠颈动脉分离单细胞悬液的详细方案。若正确实施颈外动脉部分结扎（PCL）手术，则可准确研究扰动血流（d-flow）对内皮细胞的影响。正确识别颈总动脉的分支至关重要，这些分支包括颈外动脉、颈内动脉、枕动脉和甲状腺上动脉。通过超声成像对血流模式进行验证，可进一步确认扰动血流（d-flow）条件的成功建立。尽管PCL手术可在不同年龄的小鼠上实施，但推荐使用10 ± 2周龄的小鼠。年老小鼠以及具有高胆固醇血症背景的小鼠通常伴有更多的外膜周围脂肪和更僵硬的皮肤。

必须仔细分离颈动脉内皮细胞富集的单细胞制备物，避免混入周围组织和外膜周围脂肪。颈动脉管腔必须充分灌注，以防止单细胞制备物中污染血液细胞。组织识别和标记不当可能导致标准差显著升高。本实验方案需要周密的规划和时间管理。一位熟练的外科医生和操作人员完成一次PCL手术约需15至20分钟。每只小鼠的处死、颈动脉分离及管腔内酶消化过程还需额外35至40分钟。从内皮细胞冲洗到完成单细胞/单细胞核制备的实操处理时间还需额外2小时。强烈建议进行细致的规划并开展团队协作。

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披露

HJ 是 FloKines Pharma 的创始人。其他作者无任何利益冲突需要声明。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目HL119798、HL095070和HL139757对HJ的资助。HJ还获得了华莱士·H·科尔特杰出教职讲席教授职位的支持。埃默里整合基因组学核心（EIGC）所提供的服务由埃默里大学医学院提供部分补贴，并由美国国立卫生研究院资助的佐治亚临床与转化科学联盟（项目编号：UL1TR002378）提供部分支持。上述内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>化学品、多肽和重组蛋白
1× PBS（细胞培养级）康宁21040CMX12
1.5 mL 蛋白质防吸附微量离心管Eppendorf022-43-108-1
15 mL 离心管 - 泡沫架，无菌FablabFL4022
50 mL SuperClear 离心管Labcon3191-335-028
6-0 丝线缝合线 无菌Covidiens-1172 c2
70 µm 细胞滤筛，白色，无菌，独立包装赛默飞世尔科技08-771-2
Accutase 溶液，经无菌过滤Sigma-AldrichA6964-100ML或同等产品
ATAC缓冲液（转座反应体系组分I）10x Genomics2000122
ATAC酶（转座反应混合液组分II）10x Genomics2000123/ 2000138
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-500G
布托啡诺Med-Vet 国际RXBUPRENOR5-V
铬控制器 & Next GEM 附加试剂盒10X Genomics1000204
Chromium Next GEM 单细胞 3' 试剂盒 v3.110X Genomics1000121
Chromium Next GEM 单细胞ATAC试剂盒 v1.110X Genomics1000175
胶原酶IIMP Biomedicals2100502.5
DigitoninSigma-AldrichD141-100MG
解剖镊Roboz 外科器械公司RS-5005
Dnase1New England Biolabs 公司M0303S
离心机（台式型号 # 5425）Eppendorf22620444230VR
胎牛血清 - 优选级R&D 系统S11550
固定角转子EppendorfFA-45-24-11-Kit 转子
HEPES 缓冲盐水Millipore Sigma51558
胰岛素注射器（3/10 mL 29 G 注射器）BD305932
异氟烷帕特森兽医789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainer（100 µm) Miltenyi Biotec130-098-463
生理盐水（0.9% 氯化钠）Baxter International Inc2B1323
细胞核缓冲液（20倍浓缩）10x GenomicsPN 2000153/2000207
PBS（10倍浓度），pH 7.4赛默飞世尔科技70011-044
小剪刀Roboz外科器械公司RS-5675
带锁不锈钢微型夹持镊Roboz外科器械公司RS-5480或类似物
Tissue Mend II韦伯斯特兽医学07-856-7946
II型胶原酶MP生物医学2100502.1
<强>已沉积数据
scATACseq FastQ 文件NCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject 登录号 PRJNA646233
scRNAseq FastQ 文件NCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject 登录号 # PRJNA646233
<强>软件与算法
Cell Ranger 3.1.010X Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-exp
奇切罗Pliner 等，2018https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
ggplot2 v3.2.1Hadley Wickhamhttps://cran.r-project.org
和谐Korsunsky 等，2019https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ施耐德等人，2012https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0邱等人，2017https://github.com/cole-trapnell-lab/monocle-release
R 版本 3.6.2R 基金会https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3Stuart 等，2019https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5Stuart 等，2019https://github.com/timoast/signac

参考文献

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  3. Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).
  4. Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 6/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally

to:

Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally

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内皮细胞分离颈动脉单细胞组学管腔消化紊乱血流单细胞RNA测序单核测序胶原酶消化小鼠模型染色质可及性
从小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞用于单细胞多组学实验
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