方法文章

Drosophila melanogaster 幼虫注射方案

DOI：

10.3791/63144

⸱

2021年10月19日

 ,  , 
1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

本文内容

摘要

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Drosophila melanogaster 成年果蝇被广泛用作模式生物，以研究宿主抗微生物先天免疫反应及微生物感染策略背后的分子机制。为了推动D. melanogaster 幼虫阶段成为另一种或可替代的模型系统，本文介绍了一种幼虫注射技术。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用非传统模型研究先天免疫和病原体毒力，为成本高昂且可能引发伦理问题的哺乳动物模型提供了有价值的替代方案。非传统模型通常价格低廉、易于操作和培养，且占用空间小。它们具有良好的遗传可操作性，并拥有完整的基因组序列，其使用不会引发伦理方面的顾虑。例如，果蝇Drosophila melanogaster在行为、发育、代谢和免疫研究等多个领域均提供了重要见解。更具体而言，D. melanogaster的成虫和幼虫具有多种与脊椎动物共有的先天防御反应。调控免疫应答的机制主要通过在D. melanogaster模型中开展的遗传学和分子生物学研究得以揭示。本文介绍了一种新型的幼虫注射技术，该技术将进一步推动对D. melanogaster幼虫先天免疫过程的研究，并有助于探索多种微生物感染的致病机制。

引言

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Drosophila melanogaster 在过去几十年中被广泛应用于生物学和生物医学研究，因为针对其遗传学和分子生物学研究的复杂工具不断得到发展，可用于分析多种研究课题1,2,3,4。D. melanogaster 在发育、稳态和先天免疫方面具有进化上保守的特征，使其成为研究多种人类和昆虫疾病的重要模式生物5,6。值得注意的是，D. melanogaster 模型在免疫研究中的基础性作用主要体现在成蝇的研究中。然而，对 D. melanogaster 幼虫的研究也丰富了当前的认知，尤其在探索通过昆虫体壁发生的寄生蜂和线虫感染所引发的细胞免疫应答方面7,8,9,10。Drosophila melanogaster 幼虫具有三种不同类型的血细胞，统称为血细胞（hemocytes）：浆细胞样血细胞（plasmatocytes）、晶体细胞（crystal cells）和成鞘血细胞（lamellocytes）11,12,13。当 D. melanogaster 幼虫受到细菌、真菌、病毒和寄生虫等病原体感染时，这些细胞可启动多种免疫应答14,15,16。细胞免疫应答包括对小分子或细菌的直接吞噬（吞噬作用）、黑化反应、对较大病原体（如寄生性卵）的包囊作用，以及活性氧（ROS）和一氧化氮合酶（NOS）的产生17,18,19。

相比之下，利用 D. melanogaster 幼虫模型分析体液免疫反应的研究报道较少。这主要是因为通常采用饲喂法对 D. melanogaster 幼虫进行口服感染，而在对幼虫进行显微注射时则面临诸多技术挑战，包括幼虫的精确操作以及显微针的正确使用，尤其是在穿刺过程中20,21。因此，人们对幼虫感染过程了解有限，加之技术上的困难（例如高死亡率），使得 D. melanogaster 幼虫模型的应用常常受到限制。建立幼虫模型将有助于发现新的分子机制，从而进一步揭示宿主与病原体之间的相互作用，以及针对病原体感染所诱导的特异性宿主先天免疫反应。

一种简单高效的注射方案 D. melanogaster 详细描述了用各种病原体（如细菌）感染幼虫的方法。特别是 D. melanogaster 幼虫用于注射人类病原体 Photorhabdus asymbiotica 非致病性细菌 大肠杆菌该方法可用于操控和分析 黑腹果蝇的 对各种微生物感染的免疫应答

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 果蝇培养

注意：D. melanogaster 的生命周期分为四个阶段：胚胎、幼虫、蛹和成虫。在实验室最佳培养条件下（约 25 °C、60% 湿度和充足食物），从受精卵发育到羽化成虫的世代时间约为 10 天。雌性果蝇每天产卵约 100 个，胚胎发育持续约 24 小时22。幼虫经历三个发育阶段（龄期；L1-L3），历时约 4 天（L1 和 L2：各 24 小时，L3：48 小时）。一龄幼虫孵化后立即在培养基表面开始取食。二龄幼虫钻入培养基内部，而三龄幼虫则离开培养基，在培养瓶壁上爬行，寻找合适位置化蛹，此过程持续 24–48 小时。本实验方案所使用的 D. melanogaster 品系为 Oregon R（FBsn0000276）。

  1. 将含有玉米粉-大豆基础饲料的干燥食物加入到一个窄口聚苯乙烯小瓶（25 mm × 95 mm）中，加至小瓶体积的1/5至2/5。然后加入9 mL水，静置1分钟，直至饲料完全水合。
  2. 向小瓶中加入约10粒干燥的酿酒酵母颗粒，并放入至少20只新羽化的雄性和雌性成虫果蝇混合群体。
  3. 将小瓶置于25 °C、12小时光照:12小时黑暗的光周期条件下培养。
  4. 为确保生活史进程正常进行，每天检查果蝇小瓶，并记录初始发育阶段。

2. 感染用幼虫的选择

  1. 在感染当天，当幼虫发育至游走型三龄幼虫阶段时，使用精细的画笔（最好为骆驼毛制）挑选幼虫（图1）。
  2. 将选好的幼虫从原始小瓶中取出后，置于小型培养皿（60 mm × 15 mm）中，用任氏液（100 mM NaCl、1.8 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM HEPES，pH 6.9）清洗23。
  3. 将幼虫放置于直径为150 mm的滤纸上，滤纸预先用约5 mL任氏液轻微润湿，并置于培养皿（100 mm × 15 mm）中（图2A）。
  4. 根据需要每日向滤纸上添加约1 mL任氏液，以防止滤纸干燥及幼虫脱水。

3. 细菌制备

  1. 在28 °C条件下，将P. asymbiotica细菌接种于Luria Bertani（LB）琼脂培养基中培养48小时。
  2. 在生物安全二级操作台中，挑取单个P. asymbiotica菌落，接种至10 mL LB液体培养基中。
  3. 将P. asymbiotica液体培养物置于28 °C、220 rpm的摇床中过夜培养。
  4. 以类似方法培养E. coli细菌，但初始菌落生长及液体培养均在37 °C条件下过夜进行。
  5. 将每种过夜培养的细菌培养物在4 °C、13,000 × g条件下离心3分钟。
  6. 弃去上清液，并用10 mL无菌PBS将所得菌体沉淀洗涤三次。
  7. 再次在4 °C、13,000 × g条件下离心3分钟，收集菌体沉淀。
  8. 用无菌PBS重悬各菌体沉淀，使用分光光度计调整菌液浓度，使P. asymbiotica的光密度（600 nm）为0.25，E. coli为0.015，该浓度分别对应每只幼虫接种物中含有100–300个菌落形成单位。

4. 注射器准备

  1. 使用 3.5″ 玻璃毛细管和微电极拉制仪制备毛细管。仪器参数设置如下：加热温度：580；拉力：143；速度：25；延迟：1；压力：500。
  2. 使用直型锯齿状中号尖头镊子将玻璃毛细管开口调整至适当程度，以确保能够输送实验处理物，同时对幼虫造成最小损伤（图 2B）。在练习注射过程中优化此操作时，可使用台盼蓝溶液（将 0.4% 原液用 PBS 稀释至 0.2%）以便在注射时清晰观察渗漏情况以及蓝色幼虫的存活状态。
  3. 使用带皮下针头（22 G，25 mm 长）的塑料一次性 20 mL 注射器，将矿物油注入毛细管中。
  4. 设置纳升级注射仪，并将毛细管中的油排出（图 2C）。
  5. 用毛细管吸取所需注射的细菌悬液。从置于石蜡膜上的液滴（约 20 µL）中取液。在本实验方案中，每只注射 50.2 nL 的两种细菌原液。

5. 幼虫注射

  1. 在操作前，使用二氧化碳麻醉 D. melanogaster 幼虫约 2 分钟。
  2. 将麻醉后的幼虫轻轻转移至用任氏液润湿的滤纸上，准备在体视显微镜下进行注射。此时幼虫会呈现迟钝或无反应状态。
  3. 注射幼虫时，用镊子对幼虫后端背侧施加稳固压力（后端可见气门结构，而前端为黑色口器）（图 2D）。
  4. 将注射针头水平朝向幼虫后端、靠近表皮处插入。成功的注射不应导致注射液从幼虫体内泄漏（图 3）。
  5. 在拔出针头前，先移除用于按压幼虫尾部的镊子。若未先行移除，镊子可能迫使血淋巴和/或肠道内容物从伤口处挤出。
  6. 根据实验需求，感染相应数量的幼虫。在本实验方案中，每种实验条件注射 20 只幼虫。
  7. 使用镊子将注射后的幼虫轻轻转移至培养皿中另一张湿润的滤纸上（每皿 10 只幼虫）或食物小瓶中（根据实验目的决定），以供恢复。
  8. 将培养皿或食物小瓶置于 25 °C 恒温培养箱中。若幼虫置于培养皿中，需根据需要添加任氏液以防止干燥。

6. 记录存活/死亡情况

  1. 根据设定的实验时间点，记录黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫的死亡数和存活数。存活的幼虫将继续发育为蛹和成虫。
  2. 使用统计软件（如 Prism）输入原始的存活/死亡数据，采用log-rank（Mantel-Cox）检验进行分析，并以图表形式展示结果。

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结果

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若操作正确，对D. melanogaster幼虫的注射可表现出细菌特异性的效应。在用P. asymbiotica（菌株ATCC43943）、E. coli（菌株K12）和PBS感染后多个时间点收集了存活数据（图4）。D. melanogaster幼虫对P. asymbiotica敏感，感染后存活率迅速下降；而注射E. coli或PBS对照的幼虫则表现出较长的存活时间24,25,26。特别是，与注射P. asymbiotica后24小时存活率为57%的幼虫相比，注射E. coli的幼虫在同一时间点的存活率达到85%。

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讨论

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Drosophila melanogaster 是研究先天免疫及多种微生物感染致病机制中最有价值且常用于实验操作的模式生物之一。这得益于其简单快速的生活周期、实验室易于维持的特性、成熟的进化遗传学基础以及丰富的遗传学工具。以往对 D. melanogaster 幼虫进行注射的方法，例如使用混合型微流控装置或纳利科显微操作仪，往往需要高度专业化的设备，且成本较高21,27。 在本实验方案中，为了进一步拓展 D. melanogaster 的应用，我们介绍了一种简单、高效且快速的注射技术，可用于将细菌注入 D. melanogaster 幼虫的血腔中。该技术的关键步骤是使用显微注射仪将目标病原体或其他液体物质注入幼虫体内。除描述这一核心操作外，我们还介绍了相关辅助方法，例如细菌的培养与扩增以及实验材料的处理。

该方法的主要优势在于，注射针头与幼虫体轴大致平行，且对幼虫施加的固定压力极小，从...

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披露

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作者声明无竞争利益。

致谢

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感谢乔治·华盛顿大学（GWU）生物科学系成员对本文手稿的审阅。GT 获得了 GWU 哈兰暑期奖学金的支持。所有图形均使用 BioRender 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
果蝇食物B（布卢明顿配方）LabExpress7001-NV窄型小瓶装食物B，每托盘100个小瓶
100 × 15 毫米单层可完全堆叠培养皿VWR25384-342直径 100 × 15 毫米
60 × 15 毫米单层可完全堆叠培养皿VWR25384-092直径 60 × 15 毫米
玻璃毛细管VWR53440-186
1号定性滤纸，标准级，圆形VWR28450-150直径 150 毫米
II级A2型实验室细胞培养生物安全柜ESCOLA2-4A2-E
LB琼脂赛默飞世尔科技BP1425-500LB琼脂Miller粉末，500克
LB肉汤赛默飞世尔科技BP1426-500LB肉汤Miller粉末，500克
矿物油Alfa Aesar，赛默飞世尔科技31911-A1
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000C
Nanoject III 可编程纳升级注射仪Drummond3-000-207
窄型果蝇小瓶，聚苯乙烯材质Genesee Scientific32-109
皮下注射针头VWR89219-31622 G，25 毫米
下一代微电极拉制仪World Precision InstrumentsSU-P1000
PBSVWR97062-732生物技术级PBS缓冲液片剂，200片
PrismGraphPadVersion 8
塑料一次性注射器VWR76124-65220 毫升
台盼蓝Sigma-AldrichT8154

参考文献

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