从 大肠杆菌 和其他细菌中可扩展地分离和纯化细胞外囊泡

摘要

细菌分泌携带生物活性生物分子的纳米大小的细胞外囊泡（EV）。电动汽车研究的重点是了解它们的生物起源、在微生物-微生物和宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及它们潜在的治疗应用。提出了一种从各种细菌中可扩展分离电动汽车的工作流程，以促进电动汽车研究的标准化。

摘要

多种细菌种类分泌~20-300nm细胞外囊泡（EV），由脂质，蛋白质，核酸，聚糖和来自亲本细胞的其他分子组成。电动汽车作为种内和种间交流载体，同时也有助于细菌和宿主生物在感染和定植背景下的相互作用。鉴于电动汽车在健康和疾病方面的众多功能，人们对分离电动汽车进行 体外 和 体内 研究的兴趣日益浓厚。据推测，基于物理性质（即大小）分离EV将有助于从不同的细菌培养物中分离囊泡。

分离工作流程包括离心、过滤、超滤和体积排阻色谱（SEC），用于从细菌培养物中分离EV。采用泵驱动的切向流过滤（TFF）步骤以增强可扩展性，从而能够从升起始细胞培养物中分离材料。大 肠杆菌 被用作表达EV相关纳米荧光素酶和非EV相关mCherry作为报告蛋白的模型系统。纳米荧光素酶通过将其N末端与溶细胞素A融合来靶向EV。含有20-100 nm EVs和相关溶细胞素A - nanoLuc的早期色谱级分与含有游离蛋白的后期馏分不同。EV相关纳米荧光素酶的存在通过免疫金标记和透射电子显微镜得到证实。此 EV 分离工作流程适用于其他人类肠道相关的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌物种。总之，结合离心、过滤、超滤/TFF 和 SEC，可以从不同的细菌物种中扩展分离 EV。采用标准化的分离工作流程将有助于跨物种微生物电动汽车的比较研究。

引言

细胞外囊泡 （EV） 是由原核细胞和真核细胞分泌的纳米级脂质体样结构，由脂质、蛋白质、聚糖和核酸组成¹.自从早期研究可视化革兰氏阴性细菌²释放EV以来，归因于细菌EV（直径20-300nm）的生物学功能数量在过去几十年中一直在增长。它们的功能包括转移抗生素耐药性³、生物膜形成⁴、群体感应⁵ 和毒素递送⁶。人们对使用细菌EV作为治疗方法的兴趣也越来越大，特别是在疫苗学⁷ 和癌症治疗⁸中。

尽管人们对电动汽车研究的兴趣日益浓厚，但在隔离方法方面仍然存在技术挑战。具体而言，需要可重复、可扩展且与各种产生电动汽车的生物体兼容的分离方法。为了创建一套统一的原则来规划和报告EV分离和研究方法，国际细胞外囊泡学会发布并更新了MISEV立场文件⁹。此外，EV-TRACK联盟提供了一个开放平台，用于报告已发表稿件中使用的EV隔离的详细方法，以提高透明度¹⁰。

在该协议中，以前用于从哺乳动物细胞培养物中分离EV的方法被调整为^{11，12，以便} 能够从细菌细胞培养物中分离EV。我们试图采用能够将EV从各种微生物中分离出来的方法，这些微生物是可扩展的，并平衡EV纯度和产量（如MISEV立场文件⁹中所讨论的）。通过离心和过滤去除细菌细胞和碎片后，通过离心装置超滤（体积高达~100 mL）或泵驱动的TFF（体积较大）浓缩培养基。然后，SEC使用针对小型EV纯化优化的色谱柱分离EV。

图 1:细菌 EV 分离工作流程示意图。 缩写:EV = 细胞外囊泡;TFF = 切向流过滤;SEC = 体积排阻色谱;MWCO = 分子量截止值。 请点击此处查看此图的大图。

将大 肠杆菌（即大肠杆菌 MP1¹³）的小鼠共生菌株用作模式生物，并通过融合到溶细胞素A进行修饰以表达EV相关的纳米荧光素酶，如先前报道的那样¹⁴。这里使用的方法可以处理至少几升细菌培养物，并有效地将EV相关蛋白质与非EV相关蛋白质分离。最后，该方法也可用于其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌种类。报告实验的所有相关数据均提交给EV-TRACK知识库（EV-TRACK ID:EV210211）¹⁰。

方案

注意:确保所有涉及细菌和重组DNA的工作都遵循适合每种菌株生物安全危害水平的生物安全遏制最佳实践。工作应按照地方、国家和国际生物安全条例进行。

1. 细菌菌株和培养条件

注意:本研究中使用的细菌菌株是 大肠杆菌 MP1¹³， 嗜粘杆菌， Bacteroides thetaiotaomicron， 短双歧杆菌和 齿状双歧杆菌。

1. 对于 大肠杆菌， 使用无菌环将单个菌落接种到 250 至 1，000 mL 的 Luria-Bertani （LB） 肉汤中，并在振荡培养箱中以 300 rpm 和 37 °C 有氧孵育 48 小时，然后再处理培养物。对于含有p114-mCherry-Clelyluc的重组 大肠杆菌 MP1菌株（补充方法和 补充图S1），将氯霉素以终浓度为17μg/ mL的LB琼脂和肉汤中。
2. 对于嗜粘杆菌、嗜粘杆菌、短双歧杆菌和齿状芽孢杆菌，在脑心脏输注 （BHI） 琼脂平板上划线并在乙烯基厌氧室内厌氧孵育。将单个菌落接种到100mL预还原的BHI肉汤中，并厌氧孵育48小时。

2. 电动汽车隔离

1. 通过离心和过滤澄清细菌培养基
   1. 通过倒入将步骤1中接种的细菌细胞培养物转移到清洁250 mL或500 mL聚丙烯离心瓶中。将瓶子在4°C和5，000× g 的大容量固定角转子中离心15分钟。小心倾倒将上清液转移到干净的离心瓶中，并以10，000× g 再次离心15分钟。
      注意:在生物安全适当的清洁和去污后重复使用瓶子。
      1. 如果在第二次离心后存在大颗粒细菌细胞，请在干净的瓶子中重复离心以进一步去除细胞。
   2. 通过倒入将上清液转移到适当尺寸的0.22μm聚醚砜真空驱动过滤装置中。通过将过滤装置连接到真空壁供应来进行过滤。如果过滤率显着下降，只需将任何未过滤的材料移动到新设备上即可。将过滤后的培养基在4°C下储存过夜，如果需要，第二天继续该方案。
      注意:上述离心通常允许通过每个设备处理~2倍于指示体积的细胞培养物。例如，单个 500 mL 过滤装置可以过滤 ~1，000 mL 的预离心培养物。这些设备通常不会重复使用。不建议在此步骤中使用注射器过滤器而不进行优化，因为测试模型注意到了显着损失。这是一个潜在的停止点。
   3. 通过将过滤上清液的等分试样散布在合适的琼脂平板上来检查此时是否完全去除活细胞，并确保在细菌菌株的最佳条件下孵育后没有任何菌落。如果检测到细菌，则通过执行额外的离心和/或过滤来进一步优化上述程序。
2. 过滤介质的浓度
   1. 如果使用明显> 100 mL 的体积，请继续执行步骤 2.2.2。 如果使用~100 mL的体积，则使用血清移液器将90 mL过滤培养基加载到相应容量的100 kDa分子量截止（MWCO）离心超滤装置的储液槽中。始终使用匹配的超滤装置保持平衡，并在4°C和2，000× g 下在水平桶转子中离心15-30分钟，直到顶部储液槽中的培养基体积浓缩至<0.5mL。
      1. 用任何剩余的过滤培养基加满储液槽。如果"加满"，请移除设备底部的流通物并重新平衡所有设备。
         注意:据观察，使用这些设备可以浓缩的过滤培养基的最大体积是推荐体积的<2倍。
      2. 如果储液槽中浓缩培养基的粘度明显增加（深色粘性物质），则用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释并通过离心重新浓缩以稀释任何小于100 kDa的MWCO的非EV蛋白。
         注意:这是一个潜在的停止点。
      3. 将浓缩培养基转移到低蛋白结合管中，在4°C下储存过夜，如果需要，第二天继续该方案。
   2. 如果处理的体积明显> 100 mL，请选择适当尺寸的 TFF 设备 （100 kDa MWCO） 以适应要处理的体积。
      注意: 用于处理 100 mL 至 >1，000 mL 的过滤设备已上市。当地的可用性、成本以及与泵和管道/连接的兼容性将决定哪些特定型号最有用。在需要清洁过滤器之前，使用 材料表中 指示的设备处理多达 2 L 的培养基（有关清洁方案，请参见下面的步骤 2.3）。
      1. 使用#16低结合/低浸出管，1/8英寸软管倒钩到鲁尔适配器，TFF设备和蠕动泵组装过滤回路，如 补充图S2所示。
         注意:在生物安全柜内执行TFF，以最大程度地降低环境细菌污染EV制剂的风险。
      2. 在室温下，开始以大约 200 mL/min（最小 100 mL/min）的速度循环过滤的条件培养基。通过将 200 mL PBS 泵入刻度容器中，确定与所需流速相对应的适当 RPM。当循环过滤的调节培养基时，将穿过超滤膜的分子<100 kDa作为废物收集在单独的容器中。
         注意:下面的示例将假设起始体积为 2 L 培养物。
      3. 继续循环条件培养基，直到其体积减小到~100-200mL。根据需要转移到较小的船只上。用PBS稀释2倍，然后继续与泵一起循环，浓缩至75-100 mL。用PBS稀释2倍，继续循环至最终体积为25 mL。用PBS稀释2倍，继续循环至<10毫升。
      4. 将进料管从样品储液罐中取出，并继续泵送以吹扫过滤器并回收最大量的样品。
         注意:这是一个潜在的停止点。
      5. 将浓缩的样品转移到锥形管中，如果需要，在4°C下储存过夜。或者，继续执行协议。
      6. 将浓缩样品移至 15 mL 容量 100 kDa MWCO 离心超滤装置中。在4°C和2，000 ×g 的摆动桶转子中离心15-30分钟，直到顶部储液槽中的培养基体积浓缩至<2mL。
         注意:这是一个潜在的停止点。
      7. 将浓缩培养基转移到低蛋白结合管中，并在4°C下储存过夜，如果需要，第二天继续该方案。
3. 清洁 TFF 设备（可选）
   注意:随着TFF设备在此过程中开始"堵塞"（结垢），过滤速率会降低。如有必要，可以清洁过滤装置，以便于在同一纯化运行中过滤其他样品。虽然理论上可行，但清洁的TFF过滤器尚未用于不同的净化运行以避免交叉污染。
   1. 要清洁，请从 TFF 设备上取下所有管子和盖子，并排出任何残留液体。
   2. 使用蠕动泵和管道用~100 mL蒸馏水淹没TFF设备的内部和外部隔室（即，通过 材料表中列出的模型中的平行和垂直端口）。拆下所有管路/盖子并排空 TFF 设备。
   3. 盖上外部（垂直，滤液）端口，并以>200mL / min的速度在蒸馏水中循环250mL 20%乙醇，通过内室10分钟。沥干，用蒸馏水灌水，然后按上述方式再次沥干。
   4. 将 250 mL 的 0.5 N 新鲜 NaOH 溶液循环通过内室 30 分钟，然后再次沥干。
   5. 将所有管子和盖子重新连接到入口、出口和滤液端口，如 补充图 S2 所示，并再次循环 0.5 N NaOH 溶液，直到一定体积的 NaOH > 1 mL/cm² 过滤器表面积渗透通过滤膜并作为滤液/废物收集。
   6. 如上所述用蒸馏水冲洗TFF设备。立即使用TFF装置或用~100mL的20%乙醇淹没装置，并在4°C下储存过夜。
      注意:如果储存在乙醇中，请务必沥干，用水冲洗，沥干并通过设备循环250 mL PBS，直到>1 mL /^{cm 2} 过滤器表面积的体积渗透通过滤膜并作为滤液/废物收集以在样品处理之前去除残留的乙醇。
4. 体积排阻色谱 （SEC）
   注意:SEC用于提高EV的纯度并去除非囊泡蛋白。
   1. 使用较小的SEC色谱柱（10 mL床体积）从<100 mL起始材料中分离EV，使用较大的色谱柱（47 mL床体积）从>100 mL起始材料中分离EV。
      注意:下面的示例将列出较大列的卷，括号中列出了较小列的卷。
   2. 将SEC色谱柱和PBS置于室温数小时。使用标准实验室支架和支架将SEC色谱柱稳定在垂直位置。或者，使用商用色谱柱支架。
   3. 在连接到SEC色谱柱之前，通过让5 mL PBS流过筛板并流入废物容器来水合样品储液槽。拧下SEC色谱柱的入口盖，向样品储液槽中加入2 mL PBS，并在PBS通过筛板滴出时小心地将储液槽连接到色谱柱（不适用于小型SEC色谱柱）。
      注意:上一步可防止任何气泡被困在SEC色谱柱的顶部。如果空气被困住，请拆下储液罐，轻拍色谱柱以排出气泡，然后重复连接过程。对于较小的色谱柱，只需打开SEC色谱柱的顶部，然后连接样品斗。
   4. 向样品储液槽中加入 47 mL （10 mL） PBS，然后打开 SEC 色谱柱底部的盖子。允许所有上样的样品缓冲液流过色谱柱进行平衡。丢弃流出物。
   5. 将最多 2 mL （0.5 mL） 的样品加载到样品储液槽中，丢弃流出物，让样品完全进入色谱柱。
   6. 立即将PBS添加到样品储液槽或料斗中，体积为14.25 mL减去样品体积（对于小柱，则为3 mL减去样品体积）。让溶液流过色谱柱，并丢弃等于色谱柱空隙体积的量。
      注意:对于典型的 2 mL 样品，要添加到样品储液槽或料斗中的 PBS 量为 12.25 mL。
   7. 将 2 mL 低结合微管直接放置在 SEC 色谱柱下方。立即向样品储液槽中加入 2 mL （0.5 mL） PBS，使其进入色谱柱。将前 2 mL （0.5 mL） 流通液标记为 馏分 1。继续一次向样品储液槽中加入 2 mL （0.5 mL） 以收集每个后续馏分。
      注意:大多数细菌 EV 在前 5 个馏分中洗脱。在优化过程中，收集了前 12 个馏分。
   8. 将馏分储存在4°C用于短期储存（天）或-80°C用于长期储存。
   9. 清洁和储存可重复使用的SEC色谱柱
      注意:根据制造商的说法，此协议中描述的SEC色谱柱最多可以重复使用5次。如果SEC色谱柱的流速在使用<5次后降低，制造商建议在SEC之前以10，000 x g 离心浓缩样品10分钟以清除任何聚集体。然后将该离心液的上清液加载到SEC色谱柱上进行EV分离。
      1. 要在每次使用后清洁和储存SEC色谱柱，请加入2 mL （0.5 mL）的0.5 M NaOH，使其完全进入色谱柱。通过色谱柱运行100mL（20mL）20%乙醇，并将其储存在4°C直至下次使用。下次使用前，如上所述将乙醇平衡至室温，并通过在色谱柱中再运行150 mL（30 mL）PBS与PBS缓冲液交换。
      2. 要在每次使用后清洁并立即重复使用SEC色谱柱，请加入2 mL （0.5 mL）的0.5 M NaOH，使其完全进入色谱柱。运行约 150 mL （30 mL） PBS 缓冲液以洗去 NaOH。当洗脱液的pH值等于PBS（~7）时，可以加载新样品。

3. EV制备质量控制

1. 无菌测试
   注意:由于这些EV来自细菌培养物，因此在下游使用之前确保无菌至关重要。
   1. 获取 100 μL （20 μL） 用于测定的级分，并接种 3 mL 用于培养源细菌的培养基。在各自的最佳条件下培养至少3天，观察浊度。或者，将馏分样品施用到含有用于培养产生细菌的培养基的琼脂平板上，并寻找菌落形成。
      注意:如果检测到细菌污染，不建议使用EV制剂进行实验。相反，重复分离，注意通过（a）对条件细菌细胞培养基进行充分的离心/过滤，（b）使用干净的瓶子，管子，过滤器和色谱柱，以及（c）采用适当的无菌技术，将细菌污染的风险降至最低。
2. 蛋白质定量
   注意:使用了高灵敏度、基于荧光的蛋白质定量试剂盒（参见 材料表）。该套件可与匹配的专有荧光计配合使用，激发/发射波长为 485/590 nm。
   1. 将所有试剂、标准品和样品置于室温。
   2. 将 1 μL 试剂添加到 199 μL 缓冲液中，为每个待分析样品和标准品制备蛋白质试剂和缓冲液的预混液。使用薄壁 0.5 mL PCR 管，向每个标准管中加入 10 μL 标准品 + 190 μL 预混液。
      注意:为了在测定范围内，要添加到每个样品管中的每个级分的量取决于纯化的预期蛋白质产量。通常，使用每种馏分 5 μL + 195 μL 预混液。样品 + 预混液的最终体积必须为 200 μL。
   3. 涡旋测定管，并在室温下在黑暗中孵育至少15分钟。
   4. 使用箭头按钮选择蛋白质测定选项并按GO按钮进行确认，从而在适当的专有荧光计（参见材料表）上测量标准品。按照屏幕上的说明，插入每个标准管并按GO。
   5. 插入实验样品管;按 GO 阅读;并注意显示的结果，即测定缓冲液/样品混合物中的实际蛋白质浓度。要获得样品中的蛋白质浓度，请使用箭头键选择 计算样品浓度 选项，按 GO，然后使用箭头键选择添加到给定样品的测定缓冲液中的 样品体积 。按 GO 并记录样品蛋白浓度。对要分析的每个样品重复此步骤。
3. 颗粒计数和粒径分布
   注意:微流体电阻脉冲传感（MRPS）用于量化EV浓度和尺寸分布。
   1. 将样品稀释在补充有 1% 吐温-20 的 PBS 中，该吐温-20 已通过 0.02 μm 注射器过滤器过滤至蛋白质浓度约为 0.1 μg/mL。
      注意:稀释的目标是在含EV的馏分中达到10¹⁰ 个颗粒/mL的预期颗粒浓度。最佳稀释度可能需要根据经验确定。预计以后的分数（超过分数 6）的 EV 很少。因此，尽管在低稀释度下进行分析，颗粒浓度仍可能为 <10¹⁰ 个颗粒/mL。
   2. 使用微量移液器将每个样品的 3 μL 加载到一次性微流体小柱中，将小柱插入 MRPS 仪器，然后按下带有蓝色发光边缘的金属按钮。
   3. 单击采集软件上的 Go！ ，等待仪器分析样品。采集 1，000 到 10，000 个粒子事件，以最大限度地减少分析的技术统计误差。此时，单击 "停止 "和 "结束运行 "以完成样品采集。
      注意:仪器与原始数据文件一起输出一个汇总电子表格，列出样品中的颗粒浓度。根据样品稀释度校正此值。
   4. 使用分析软件，加载原始数据并生成定制的尺寸分布图。

4. 电动汽车存储

1. 将单个或混合级分试样在低蛋白结合管中将单个或混合级分分至单个级分尺寸的25-50%（取决于所用色谱柱的大小），并储存在-80°C以避免冻融循环。
   注意:不同的应用可能需要更小或更大的等分试样，具体取决于每个实验中使用的预期量。这需要根据经验来确定。如果不适用于研究目标，则可以丢弃不含EV的馏分。

5. 透射电子显微镜

1. 阴性染色
   1. 将 5 μL EV 样品添加到碳涂层铜 400 目网格中，并在室温下孵育 10 分钟。用5滴5mM Tris缓冲液（pH 7.1）洗涤样品侧，然后用5滴蒸馏水清洗。
   2. 用5滴2%乙酸铀酰染色标本侧。用滤纸吸干任何多余的污渍，让网格完全干燥数小时或过夜。用在 80 kV 下操作的电子显微镜观察样品。
2. 免疫金标记
   1. 将 10 μL EV 悬浮液施加到甲型/碳 400 目网格中，并在室温下孵育 1 小时。在PBS中洗涤网格三次，然后应用4%多聚甲醛10分钟以固定样品。用PBS清洗网格五次。
   2. 用含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS进行三次洗涤，阻塞网格。然后，在室温下应用 10 μL 一抗 40 分钟（此处为 1 μg/mL nluc 抗体）。用含有0.1%BSA的PBS再次洗涤三次。
   3. 向网格中加入 10 μL 二级金标记抗体，并在室温下孵育 40 分钟。用PBS清洗网格三次。
      注意:在这里，在封闭缓冲液中以1:10稀释后，使用与10nm金纳米颗粒偶联的山羊抗小鼠抗体。如果金标记掩盖了EV的可视化，则可以使用具有较小金纳米颗粒（例如5nm）的二抗。
   4. 在室温下用 10 μL 2.5% 戊二醛固定网格 10 分钟。在PBS中洗涤三次。用2%乙酸铀酰（10μL）进行阴性染色15分钟。将样品包埋在 10 μL 0.5% 乙酸铀酰和 0.13% 甲基纤维素溶液中 10 分钟。
   5. 在电子显微镜上成像之前，让样品网格在室温下干燥过夜。
   6. 在显微镜采集软件上，根据经验确定曝光以获得图像的最佳质量（例如，在此特定设置中为0.80851 s），并通过在曝光时间选项框中键入此值来调整 曝光。 选择 80 kV 选项，然后单击 "开始采集 "以捕获图像。

结果

为了评估哪些SEC色谱级分富集用于EV，在SEC色谱柱中加载了2 mL大 肠杆菌 MP1条件培养基，该培养基已被TFF浓缩1，000倍，并收集顺序馏分。使用MRPS，发现馏分1-6包含的EV最多（图2A）。随后的馏分含有很少的EV，而不是不含EV的蛋白质（图2B）。EV的直径主要为<100纳米（图2C）。TEM证实了EV富集和大小，特别是在馏分2-6中（图2D）。

为了进一步确保这些方法能够将EV与非EV相关蛋白分离，生成了表达溶细胞素A-纳米荧光素酶融合蛋白和游离（非融合）mCherry的大 肠杆菌 MP1重组菌株（ 图3A示意图）。先前显示溶细胞素A融合蛋白与 大肠杆菌 EVs^相关14

讨论

在上面的协议中，描述了一种可扩展的方法，该方法可靠地将EV与各种革兰氏阴性/阳性和需氧/厌氧细菌隔离开来。在整个过程中，它有几个潜在的停止点，尽管最好避免花费超过48小时的时间从条件细菌培养基中分离EV。

首先，它包括培养细菌以产生条件细菌培养基。结果发现，将培养时间延长至至少48小时并使用最佳生长培养基有助于最大限度地提高EV产量。每种细菌物种可能需要针对这两个参数进行优化。细菌培养物的体积对于确保为所需的应用分离出足够的EV也很重要。对于 体外 研究，EV通常从至少100 mL中分离，而对于 体内 研究，EV通常从>1 L培养基中分离。同样，每种细菌菌株的EV生产特性和下游测定所需的EV量将决定最小起始培养量。

一旦有条件培养基可用，必须去除细胞和大型非EV碎片。结果发现离心是这一过程中的关键步骤。如上述方案所述，进行了两次增加 g力的离心。有时，如果注意到第二次旋转的沉淀不致密，则进行额外的10，000 × g 离心。随后，通过0.22μm过滤器对该...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 平盖 Thermo	Scientific	3430	使用薄壁 PCR 管使用 Qubit
16% 多聚甲醛（甲醛）水溶液	电子显微镜科学	15700
250 mL Fiberlite 聚丙烯离心瓶	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite 聚丙烯离心瓶	ThermoFisher	010-1493
65 mm 聚丙烯圆底/锥形瓶适配器	Beckman Coulter	392077	允许 Vivacell 安装在转子
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 （100 kDa MWCO）	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20XPI 离心机	Beckman Coulter		不再由 Beckman 销售。Avanti J-26XP 是最接近现代的型号。
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
短双歧杆菌	NCIMB	B8807
齿双歧杆菌	ATCC	27678
脑心输液 （BHI） 肉汤	Himedia	M2101	高压灭菌后，将BHI肉汤和琼脂引入厌氧室，并补充甲萘醌（1 & micro;g/L）、血红素 （1.2 µg/L） 和 L-半胱氨酸盐酸盐 （0.05%）。然后将它们在厌氧条件下孵育至少 24 小时，然后接种厌氧菌菌株。
C-300 微流体卡盒	Spectradyne
氯霉素	MP 生物医学 ICN19032105
电子显微镜	FEI 公司	Tecnai G2 SpiritBT
em> 大肠杆菌 HST08（虎头感受态细胞）	Takara	636763
大肠杆菌 MP1	Mark Goulian 博士（礼物）		源自小鼠肠道的共生菌
Fiberlite 500 mL 至 250 mL 适配器	ThermoFisher	010-0151-05	与 Fiberlite 转头配合使用，使 250 mL 瓶可用于较小尺寸的起始细菌培养
Fiberlite 固定角离心转头	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	适合 6 x 500 mL 瓶
Formvar 碳膜 400 目，铜	电子显微镜科学	FCF-400-CU
戊二醛（EM 级，10% 水溶液）	电子显微镜科学	16100
血红素	ChemCruz	207729B	储备液在 0.2 M L-组氨酸溶液中制备为  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ 酶标仪	Tecan		该均衡用于测量 mCherry 荧光
In-Fusion HD 克隆 Plus	Takara	638909	用于将 PCR 片段克隆到 PCR 衬砌载体中
JS-5.3 AllSpin 摆动桶转子	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani （LB） 肉汤，Miller	Difco	244620
L-半胱氨酸盐酸盐	J.T. Baker	2071-05	应称重并直接加入厌氧体内高压灭菌的 BHI 培养基中腔室
Masterflex 接头，聚丙烯，直式，内螺纹鲁尔接头至软管倒钩适配器，1/8" 内径;25 个/包	的 cole-parmer - 用于	过滤管回路	HV-30800-08
Masterflex 接头，聚丙烯，直式，外螺纹，鲁尔接头到软管倒钩适配器，1/8" ID;25 个/包	cole-parmer -	用于过滤管回路
的专用 HV-30800-24 连接适配器Masterflex L/S 模拟变速控制台驱动器，20 至 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S 易装头，用于精密管，4 辊，PARA 外壳，SS 转子	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S 精密泵管，PharmaPure，L/S 16;25 英尺	Cole Palmer	EW-06435-16	低结合/低浸出管
甲萘醌（维生素 K3）	MP	102259	乙醇中制备储备溶液，为 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF 装置，我们用于过滤多达 2 L 大肠杆菌培养上清液
Nano-Glo 荧光素酶检测系统	Promega	N1110	该检测试剂盒用于测量 nluc 报告蛋白
NanoLuc （Nluc） 荧光素酶抗体的发光， 克隆 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 微流控电阻脉冲传感仪	Spectradyne
nCS1 查看器	用于粒度分布的	Spectradyne
含标准缓冲液的 OneTaq 2x 预混液	NEB	M0482	DNA 聚合酶预混液，用于进行常规 PCR 反应，用于菌落检查
蛋白 LoBind，2.0 mL，PCR洁净管	Eppendorf	30108450
Q5 高保真 2x 预混液	NEB	M0492	DNA 聚合酶预混液，用于进行克隆
qEV 原始、35 nm	Izon		最大上样体积为 0.5 mL
qEV 机架	Izon		与 qEV 原始 SEC 色谱柱
qEV-2、35 nm	Izon		配合使用2 mL
Qubit 荧光计	ThermoFisher		已停产。最接近的可用产品是 Qubit 4.0 荧光计（货号不。Q33238）
Qubit 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher	Q33211	在室温下储存试剂盒。标准品储存在 4 °C 下。
Sorvall Lynx 4000 离心机	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x 酶标仪	分子设备		该设备用于测量纳米荧光素酶生物发光
Stericup 速释 GP 无菌真空过滤系统（150、250 或 500 mL）	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	可以使用一个或多个过滤器来容纳工作体积。根据我们的经验，您可以过滤商品尺寸上所列体积的两倍。
乙酸铀	电子显微镜科学	22400
乙烯基厌氧室	Coy 实验室
Vivacell 100， 100,000 MWCO PES	赛多利斯	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus 针头过滤器（0.02 微米）	MilliporeSigma	过滤	MRPS 稀释剂