可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

摘要

细菌会分泌携带生物活性分子的纳米级细胞外囊泡（EVs）。EV研究主要关注其生物发生机制、在微生物间及宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及潜在的治疗应用。本文介绍了一种可放大的从多种细菌中分离EV的方法流程，以促进EV研究的标准化。

摘要

多种细菌可分泌直径约20-300 nm的细胞外囊泡（EVs），其成分包括来自亲代细胞的脂质、蛋白质、核酸、聚糖及其他分子。EVs可作为种内和种间通讯的载体，同时在感染与定植过程中参与细菌与宿主生物之间的相互作用。鉴于EVs在健康与疾病状态下具有多种功能，目前对分离EVs用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究的兴趣日益增加。有研究假设，根据EVs的物理特性（特别是尺寸）进行分离，将有助于从不同细菌培养物中实现囊泡的有效分离。

分离流程包括离心、过滤、超滤和尺寸排阻色谱法（SEC），用于从细菌培养物中分离细胞外囊泡（EVs）。引入泵驱动的切向流过滤（TFF）步骤以提高可扩展性，从而能够从数升起始培养液中分离材料。Escherichia coli 被用作模型系统，表达与EV相关的纳米荧光素酶（nanoluciferase）和非EV相关的mCherry作为报告蛋白。通过将纳米荧光素酶的N端与溶细胞素A融合，使其靶向定位至EVs。含有20–100 nm EVs及与溶细胞素A融合的纳米荧光素酶（cytolysin A - nanoLuc）的早期色谱组分，与含有游离蛋白的后期组分明显不同。EV相关纳米荧光素酶的存在通过免疫金标记和透射电子显微镜得到证实。该EV分离流程适用于其他与人类肠道相关的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌物种。综上所述，结合离心、过滤、超滤/TFF和SEC的方法可实现从多种细菌物种中规模化分离EVs。采用标准化的分离流程将有助于跨物种开展微生物EVs的比较研究。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由原核和真核细胞分泌的、大小为纳米级的脂质体样结构，由脂质、蛋白质、糖类和核酸组成¹。自早期研究观察到革兰氏阴性菌释放EVs以来²，过去几十年中，人们对细菌来源的EVs（直径为20–300 nm）所具有的生物学功能的认识不断扩展。这些功能包括介导抗生素耐药性转移³、生物膜形成⁴、群体感应⁵以及毒素递送⁶。此外，细菌EVs作为治疗剂的应用也日益受到关注，尤其是在疫苗学⁷和癌症治疗领域⁸。

尽管人们对细胞外囊泡（EV）研究的兴趣日益增长，但在分离方法方面仍存在技术挑战。具体而言，亟需具备可重复性、可扩展性且适用于多种EV产生生物体的分离方法。为建立统一的EV分离及研究方法规划与报告原则，国际细胞外囊泡学会定期发布并更新MISEV立场文件⁹此外，EV-TRACK 联盟提供了一个开放平台，用于报告已发表论文中使用的细胞外囊泡（EV）分离的详细方法，以提高研究透明度¹⁰.

方案

注意：涉及细菌和重组 DNA 的所有操作均应遵循针对每种菌株生物安全危害等级的生物安全防护最佳实践。操作应符合当地、国家和国际生物安全法规。

1. 细菌菌株及培养条件

注意：本研究中使用的细菌菌株为Escherichia coli MP1¹³、Akkermansia mucinophila、Bacteroides thetaiotaomicron、Bifidobacterium breve 和Bifidobacterium dentium。

1. 对于 E. coli，使用无菌接种环将单菌落接种至 250 至 1,000 mL 的 Luria-Bertani (LB) 液体培养基中，在 300 rpm、37 °C 条件下于摇床培养箱中好氧培养 48 小时后再进行后续处理。对于携带 p114-mCherry-Clyluc 的重组 E. coli MP1 菌株（补充方法 和 补充图 S1），需在 LB 琼脂平板和液体培养基中加入氯霉素，终浓度为 17 µg/mL。
2. 对于 A. mucino....

结果

为了评估哪些SEC色谱组分富含EVs，将2 mL样品加载至SEC色谱柱中 E. coli 经TFF浓缩1000倍的MP1条件培养基，并收集连续洗脱组分。通过MRPS分析发现，第1-6组分含有最多的EVs（图2A）。后续的组分中含有极少的EVs，主要由无EV的蛋白质组成（图2B）。细胞外囊泡（EVs）主要 <直径100 nm（图2C）。透射电子显微镜（TEM）证实了细胞外囊泡（EV）的富集及其大小特征，尤其在第2至第6组分中。图2D).

为了进一步验证这些方法能否将细胞外囊泡（EVs）与非EV相关蛋白分离，构建了一种表达溶细胞素A-纳米荧光素酶融合蛋白以及游离（非融合）mCherry的重组 E. coli MP1 菌株（示意图见图3A）。先前研究.......

讨论

上述方案描述了一种可扩展且可靠的方法，用于从多种革兰氏阴性/阳性以及需氧/厌氧细菌中分离细胞外囊泡（EVs）。该过程包含多个潜在的暂停步骤，但最好避免从条件化细菌培养基中分离EVs的时间超过48小时。

首先，需要培养细菌以制备条件化细菌培养基。研究发现，将培养时间延长至至少48小时，并使用最佳生长培养基，有助于最大化细胞外囊泡（EV）的产量。很可能每种细菌物种都需要针对这两个参数进行优化。细菌培养的体积也很重要，以确保能够分离出足够量的EV用于目标应用。对于体外（in vitro）研究，通常从至少100 mL的培养物中分离EV；而对于体内（in vivo）研究，通常需要从>1 L的培养基中分离EV。同样，每种细菌菌株的EV产生特性以及下游检测所需的EV用量将决定最低起始培养体积。

一旦获得条件培养基，必须去除细胞和大的非细胞外囊泡（EV）碎片。研究发现，离心是该过程中的关键步骤。如上述方案所述，需进行两次逐步增加相对离心力（g）的离心操作。如果发现第二次离心的沉淀物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 平盖薄壁 PCR 管	赛默飞世尔科技	3430	使用薄壁PCR管对于获得Qubit检测的准确读数至关重要
16% 甲醛（Paraformaldehyde）水溶液	电子显微镜科学	15700
250 mL Fiberlite 聚丙烯离心管	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite 聚丙烯离心瓶	ThermoFisher	010-1493
65 毫米聚丙烯圆底/锥形瓶适配器	Beckman Coulter	392077	使 Vivacell 能够适配转子
阿克曼氏菌（Akkermansia mucinophila）	ATCC	BAA-835
Amicon-15（100 kDa 截留分子量）	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI 离心机	贝克曼库尔特		不再由贝克曼销售。Avanti J-26XP 为目前最接近的型号。
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	美国典型培养物保藏中心	29148
短双歧杆菌	NCIMB	B8807
齿双歧杆菌	美国典型培养物保藏中心	27678
脑心浸液（BHI）肉汤	Himedia	M2101	高压灭菌后，将脑心浸液肉汤和琼脂引入厌氧室，并补充甲萘醌（1 µ克/升），血红素（1.2 µg/L）和盐酸半胱氨酸（0.05%），然后在厌氧条件下孵育至少24小时，再接种厌氧菌株。
C-300 微流控芯片	Spectradyne
氯霉素	MP Biomedicals	ICN19032105
电子显微镜	FEI公司	Tecnai G2 SpiritBT
大肠杆菌 HST08（Steller 感受态细胞）	Takara	636763
大肠杆菌 MP1	Dr. Mark Goulian（赠予）		源自小鼠肠道的共生细菌
Fiberlite 500 mL 至 250 mL 转接头	ThermoFisher	010-0151-05	使用 Fiberlite 转子，以便在较小体积的起始细菌培养中使用 250 mL 瓶
Fiberlite 定角离心机转子	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	可容纳 6 个 500 mL 瓶子
400目铜载Formvar碳膜	电子显微镜科学	FCF-400-CU
戊二醛（电子显微镜级，10% 水溶液）	电子显微镜科学	16100
血红素	ChemCruz	207729B	储备液用0.2 M L-组氨酸溶液配制  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ 微孔板读板仪	Tecan		该设备用于测量 mCherry 荧光
In-Fusion  HD克隆Plus	Takara	638909	将PCR片段克隆至PCR线性化载体中
JS-5.3 AllSpin 摇摆桶转子	贝克曼库尔特	368690
劳里亚·伯特尼（LB）肉汤，米勒配方	Difco	244620
L-半胱氨酸盐酸盐	J.T. Baker	2071-05	应在厌氧环境中直接称重并加入已灭菌的BHI培养基中
Masterflex 接头，聚丙烯，直型，阴性鲁尔接头转软管接头，1/8" ID；25/PK	Cole-Parmer - 特殊	HV-30800-08	过滤管路系统的连接适配器
Masterflex 接头，聚丙烯，直型，公鲁尔接头转软管接头，1/8" ID；25/PK	Cole-Parmer - 特殊	HV-30800-24	过滤管路系统的连接接头
Masterflex L/S 模拟可调速控制台驱动器，20 至 600 转/分钟	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S 精密管路易装泵头，4 辊轮，PARA 机壳，不锈钢转子	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S 精密泵管，PharmaPure，L/S 16；25 英尺	Cole Palmer	EW-06435-16	低吸附/低溶出管路
甲萘醌（维生素K3）	MP	102259	储备液以乙醇配制，浓度为1 mg/mL
MIDIKROS 41.5厘米 100K MPES 0.5毫米 FLL × FLL 1/包	Repligen	D04-E100-05-N	我们使用的TFF装置可过滤多达2 L的大肠杆菌培养上清液
Nano-Glo 荧光素酶检测系统	Promega	N1110	该检测试剂盒用于检测nluc报告蛋白的发光情况
NanoLuc (Nluc) 荧光素酶抗体，克隆 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 微流控电阻脉冲传感仪	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		用于粒径分布的分析软件
OneTaq 2x Master Mix（含标准缓冲液）	美国新英格兰生物实验室	M0482	用于菌落鉴定常规PCR反应的DNA聚合酶预混液
蛋白低吸附 LoBind，2.0 mL，PCR 洁净管	Eppendorf	30108450
Q5 高保真 2x 预混液	NEB	M0492	用于克隆所需PCR反应的DNA聚合酶预混液
qEV 原始型，35 nm	Izon		最大上样体积为 0.5 mL
qEV 样品架	Izon		用于 qEV-original SEC 柱
qEV-2，35 nm	Izon		最大上样体积为 2 mL
Qubit 荧光仪	ThermoFisher		该产品已不再提供。最接近的可用产品为 Qubit 4.0 荧光计（货号 Q33238）
Qubit 蛋白质检测试剂盒	ThermoFisher	Q33211	将试剂盒于室温保存。标准品于 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 离心机	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x 微孔板读板仪	Molecular Devices		该设备用于测量纳米荧光素酶的生物发光
Stericup Quick-release-GP 无菌真空过滤系统（150、250 或 500 mL）	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	可使用一个或多个滤器以适应工作体积。根据我们的经验，过滤体积可达产品规格所列体积的两倍。
醋酸铀酰	电子显微镜科学	22400
乙烯厌氧室	Coy 实验室
Vivacell 100，100,000 截留分子量 PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus 注射器滤器（0.02 微米）	MilliporeSigma	WHA68093002	过滤 MRPS 稀释液