一种改进的全胚胎培养平台，可支持小鼠着床后胚胎从原肠胚形成前期到高级器官发生阶段连续且稳定的体外发育，最长可达六天。ex utero。在本方案中，我们详细阐述了使用静置培养板和旋转瓶系统进行胚胎成功培养的标准操作流程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
哺乳动物胚胎的着床后体外培养方法通常效率较低，且仅限于从子宫中分离后的短暂培养时期。近年来已开发出一些平台，能够实现从小鼠胚胎卵圆柱阶段到高级器官发生阶段的高效且长期的ex utero（体外）培养。这些平台可支持原肠胚形成前胚胎（E5.5）直至后肢形成阶段（E11）的正常且精确的发育。在该体系中，晚期原肠胚（E7.5）在旋转瓶中培养，而从原肠胚形成前阶段（E5.5 或 E6.5）开始的延长培养则需要静态培养与旋转瓶培养相结合。此外，O2 和 CO2 浓度、气体压力、葡萄糖水平的精确调控，以及特定的ex utero培养基的使用，对于胚胎的正常发育至关重要。本文提供了一套详细的延长ex utero小鼠胚胎培养操作步骤。从小鼠原肠胚形成至器官发生阶段实现正常的ex utero胚胎培养，为研究胚胎发育过程中不同实验干预的影响提供了有力工具。
引言
哺乳动物胚胎的宫内发育限制了对植入后早期发育阶段的研究1,2胚胎植入子宫后，其发育过程难以接近，这阻碍了人们对关键发育事件的理解，例如动物体轴的建立、胚层的特化以及组织和器官的形成。此外，早期植入后胚胎体积非常微小，使得活体成像观察极为困难。 在子宫内 之前 E103无法在这些阶段观察和操作活体胚胎，限制了对植入后早期胚胎发生的研究，仅能获得发育过程中的静态图像。
实验方案 体外 哺乳动物着床前胚胎的培养技术已得到充分建立，具有可靠性和常规应用性4然而，建立 子宫外 支持哺乳动物着床后胚胎正常生长的培养系统成功率有限5一个多世纪以来，已提出了多种培养技术，主要是在常规静态培养板中培养胚胎6,7,8 或旋转瓶（滚瓶培养）5,9,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均按照魏茨曼科学研究所的动物保护指南进行，并经魏茨曼科学研究所IACUC批准（#01390120-1、01330120-2、33520117-2）。根据拉班医学中心赫尔辛基委员会（#RMB-0452-15）的批准，健康孕妇被要求签署知情同意书，以采集其脐带血。根据魏茨曼科学研究所赫尔辛基委员会指南（#1566-3），健康成人也被要求签署知情同意书以采集血液样本。
1. 培养基制备
- 使用500 mL不含酚红和L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清和5 mL青霉素/链霉素，通过0.22 µm滤器过滤除菌，配制解剖用培养基。
注意：解剖用培养基可于4 °C保存最多1个月。 - 每天在生物安全柜内新鲜配制ex utero胚胎培养基（EUCM），成分为25%胚胎培养基、50%大鼠血清和25%人脐带血清（HCS）或人成人血清（HBS）。
- 配制胚胎培养基时，在500 mL不含酚红和L-谷氨酰胺的DMEM中加入5 mL谷氨酰胺、5 mL HEPES和5 mL青霉素/链霉素。分装为10–15 mL等份，于4 °C保存，最多可使用两个月。
注意：若出现污染，应将抗生素浓度加倍。 - 将大鼠血清在56 °C加热灭活30–45分钟，然后通过0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）滤器过滤。灭活后当天即用于培养....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
E7.5 胚胎（晚期原肠胚阶段）所描述的滚管培养条件可支持胚胎持续且正常的生长，在培养 4 天后平均效率接近 75%图2 和 表1）。胚胎发育效率可能因小鼠遗传背景的不同而有所差异，但通常较为稳定（图 2C）。以HBS替代HCS进行补充，在培养4天后可达到约68%的效率 子宫外 培养，具体取决于小鼠的遗传背景（图 2D 和 表2）。胚胎发育 子宫外 可正常发育至约44体节期。此后，由于缺乏尿囊胎盘，胚胎出现发育异常，导致此阶段因胚胎体积增大而无法获得充足的氧气和营养供应。
E6.5胚胎（早期原条）在静态培养板中的发育可被准确重现，效率为 >90%直至早期体节阶段E8.5，使用含HCS和HBS的EUCM图3, 表3
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述的培养方案可维持小鼠胚胎的正常且持续发育 子宫外 最长可达六天，从E5.5至E11。此前，处于这些发育阶段的胚胎在体外培养中仅能正常发育较短时间（最多48小时）。15将气体调控模块与滚筒式培养孵育器耦合，以精确控制氧气浓度和高压气体压力，对于本文所述的小鼠胚胎的适当培养至关重要。将气体压力增加至7 psi可增强氧气扩散，使得胚胎在最高达21% O₂的大气环境中发育至E11阶段。2/5% CO₂2，与先前采用的95% O₂条件相比216, 长期可能对胚胎有害。此外，已知氧浓度在胚胎发育中起着关键作用，因为早期植入后胚胎发生是在低氧条件下进行的17因此，晚期原肠胚的成功培养需要初始5% O₂2 大气环境，随着胚胎发育，氧浓度动态增加。值得注意的是，在5% O₂的静态培养条件下培养前/早期原肠胚2 与21% O₂相比，显著降低了胚胎正常发育的效率.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
J.H.H. 担任 Biological Industries Ltd 的顾问，并已提交一项专利申请，涵盖本文所述的滚瓶和静态培养条件（由 J.H.H. 和魏茨曼科学研究所提交）。其他作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由 Pascal 和 Ilana Mantoux；欧洲研究理事会（ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety）；空乘人员医学研究理事会（FAMRI）；以色列癌症研究基金（ICRF）教授职位；BSF；Helen 和 Martin Kimmel 干细胞研究研究所；Helen 和 Martin Kimmel 创新研究奖；以色列科学基金会（ISF）；Minerva；Sherman 药物化学研究所；Nella 和 Leon Benoziyo 神经疾病研究中心；David 和 Fela Shapell 遗传病研究家族中心；Kekst 家族医学遗传学研究所；Beth Rom-Rymer 博士干细胞研究基金；Edmond de Rothschild 基金会；Zantker 慈善基金会；Zvia Zeroni 遗产基金资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 孔径滤器（250 mL） | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm 孔径注射器 PVDF 滤器 | Millipore | SLGV033RS | |
| 8 孔 µ-板 玻璃底/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| 带气体进口适配盖的瓶子 | Arad Technologies | ||
| 塞子（带孔） | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | 用于将瓶子密封至滚筒 |
| 塞子（实心） | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | 用于密封旋转滚筒 |
| 培养瓶 | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | 可选用小号玻璃瓶 BTC 03 或大号玻璃瓶 BTC 04 |
| D-(+)葡萄糖一水合物 | J.T. Baker | ||
| 金刚石刀 | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| 数字压力计 | 上海本旭电子科技有限公司 | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Biological industries | 02-020-1A | |
| 胎牛血清 | Biological industries | 04-013-1A | |
| 气体调控模块 | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | 谷氨酰胺 |
| Graefe 镊子 | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| 显微外科镊子（Dumont #5, #55） | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| 巴斯德吸管（玻璃） | Hilgenberg | 3150102 | |
| 巴斯德吸管（塑料） | Alexred | SO P12201 | |
| 青霉素/链霉素 | Biological industries | 03-031-1B | |
| 培养皿（60 mm 和 100 mm） | Falcon | 351007/351029 | |
| 精密培养系统 | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | 配备气体鼓泡装置套件的 BTC01 型号 |
| 促凝无菌试管（5 mL） | Greiner Bio-One | #456005 | |
| 大鼠全胚胎培养血清 | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| 配备加热板的体视显微镜 | Nikon | SMZ18 | |
| 无菌注射器（5 mL、10 mL），用于血清过滤 | Pic Solution | ||
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14094-11 |
参考文献
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
