使用分子可视化免费软件模拟酶活性位点

摘要

生物分子建模中的一项关键技能是在蛋白质中显示和注释活性位点。本技术演示使用了四种流行的免费大分子可视化程序：iCn3D、Jmol、PyMOL 和 UCSF ChimeraX。

摘要

生物分子可视化技能对于理解生命科学中的关键概念至关重要，例如结构与功能的关系以及分子间的相互作用。多种程序允许学习者操作三维结构，生物分子建模能够促进主动学习、培养计算能力，并弥合二维教科书图像与生命真实三维结构之间的差距。该领域的一项关键技能是构建蛋白质活性位点模型，以展示大分子中能够与小分子（即配体）发生相互作用的部分，并呈现其结合相互作用方式。在本实验方案中，我们使用四种免费的大分子建模程序来描述这一过程：iCn3D、Jmol/JSmol、PyMOL 和 UCSF ChimeraX。本指南适用于希望学习特定程序基础操作的学生，也适用于将生物分子建模纳入课程教学的教师。该方案使用户能够使用某一特定可视化程序构建活性位点模型，或尝试多种可用的免费程序。本方案选用的人类葡萄糖激酶作为建模对象，它是己糖激酶的一种同工酶，可催化糖酵解的第一步反应。该酶结合了其一种底物以及一种非反应性底物类似物，使用户能够分析催化复合物中的相互作用。

引言

理解分子世界的表征对于成为生物分子科学领域的专家至关重要¹，因为对这些图像的解读是理解生物学功能的关键²。学习者通常首先通过教科书中关于细胞膜、细胞器、大分子等的二维图像来接触大分子，但生物学的真实情况是，这些结构本质上是三维的，要理解其性质，就必须具备从三维模型中可视化并提取信息的能力。

因此，高年级分子生命科学课程中生物分子可视化素养的培养日益受到关注，已有大量文章报道了教授和评估可视化技能的重要性及面临的困难^{1,3,4,5,6,7,8,9}。针对这些文章的回应是，越来越多的课堂教学干预措施得以实施，通常是在单一机构的一个学期内进行，利用分子可视化程序和模型来攻克难点概念^{2,10,11,12,13,14,15}。此外，研究人员还致力于表征学生如何使用生物分子可视化程序和/或模型来学习特定主题^16,17,18,19。我们所在的 BioMolViz 团队提出了一套框架，将可视化素养中的核心主题细分为学习目标和具体目标，以指导此类教学干预^20,21，并组织培训工作坊，指导教师运用该框架进行逆向设计，开发用于评估可视化素养技能的测评工具²²。

所有这些工作的核心都依赖于一项关键技能：利用生物分子可视化软件来操控大分子结构的能力。这些工具在不同的平台上独立开发，因此在操作和使用方式上可能具有较大的独特性。这就需要针对具体程序提供专门的操作说明，同时选择用户熟悉且顺手的程序，对于后续的持续应用至关重要。

除了掌握三维结构操作的基本技能（如旋转、选择和修改模型）之外，一个主要目标是构建蛋白质活性位点的模型。这一过程有助于学习者深入理解生物分子可视化框架（BioMolViz Framework）所提出的三个核心主题：分子相互作用、配体/修饰以及结构与功能之间的关系^20,21。

用于生物分子可视化的四种常用程序包括：Jmol/JSmol²³、iCn3D²⁴、PyMOL²⁵ 和 UCSF Chimera^26,27。我们建议初次使用 Chimera 的用户采用 UCSF ChimeraX，这是 Chimera 分子可视化程序的下一代版本，也是目前官方支持的版本。

在本实验方案中，我们演示如何使用这四种程序中的每一种来构建人葡萄糖激酶活性位点的模型，该模型包含一个结合的底物类似物复合物（PDB 编号：3FGU），并展示测量结果以说明特定的结合相互作用²⁸。该模型代表了酶的一个催化复合物。为了捕捉催化前状态的活性位点，将一种不可水解的 ATP 类似物结合到葡萄糖激酶的活性位点。这种磷氨酰基磷酸腺苷酯（ANP）在此位置以磷-氮键取代了通常的磷-氧键。活性位点中还包含葡萄糖（在模型中记为 BCG）和镁离子（记为 MG）。此外，结构中存在一个钾离子（K），来源于结晶过程中溶剂所用的氯化钾。该离子对生物学功能并不关键，且位于活性位点之外。

图 1：ATP/ANP 结构。 腺苷三磷酸（ATP）结构与磷氨酰磷酸腺苷酯（ANP）的比较。请点击此处查看此图的放大版本。

该方案展示了底物类似物复合物中结合配体的筛选，以及鉴定结合复合物5 Å范围内的活性位点残基，从而捕获能够形成相关分子相互作用（包括疏水作用和范德华力）的氨基酸和水分子。

最初调整显示方式，以卡通形式展示蛋白质的大部分结构，同时将活性位点的氨基酸残基以棍状形式显示，以呈现蛋白质的相关原子并突出分子间的相互作用。在每种程序的操作步骤3完成后，这些表示方式已被应用，蛋白质的视图在不同程序间具有相似性（图2）。在操作流程结束时，隐藏蛋白质的卡通表示，以简化视图，集中关注活性位点。

图 2：不同程序间的结构比较。 各程序中 3FGU 结构在“调整表示方式”步骤（各实验方案的步骤 2 或步骤 3）完成后的比较结果。请点击此处查看此图的放大版本。

CPK着色法应用于活性位点的氨基酸和结合的配体^29,30。该着色方案可区分在线条、棍状、球棍和空间填充表示形式中显示的分子模型中不同化学元素的原子。在CPK着色方案中，氢为白色，氮为蓝色，氧为红色，硫为黄色，磷为橙色。传统上，碳使用黑色表示，但在现代应用中，碳的着色可能有所不同。

在晶体结构中，氢原子不可见，尽管这些程序均能预测其位置。在大型大分子结构中添加氢原子可能会遮挡视图，因此本方案中不显示氢原子。因此，这些结构中的氢键将通过测量两个杂原子中心之间的距离（例如，氧到氧、氧到氮）来表示。

项目概述
可下载的图形用户界面（GUI）：PyMOL（版本 2.4.1）、ChimeraX（版本 1.2.5）和 Jmol（版本 1.8.0_301）均为基于图形用户界面的分子建模工具。这三种界面均提供命令行以输入键入的代码；许多相同的功能也可通过图形用户界面中的菜单和按钮实现。这些程序命令行的一个共同特点是，用户可使用键盘上的上下箭头键加载并重新执行之前的命令。

基于网页的图形用户界面：iCn3D（I-see-in-3D）是一种基于 WebGL 的浏览器工具，用于在网页上交互式查看三维大分子结构和化学物质，无需安装独立应用程序。该工具不依赖命令行操作，但完整的网页版本提供可编辑的命令日志功能。JSmol 是 Jmol 的 JavaScript 或 HTML5 版本，适用于网站或网页浏览器窗口中，其操作方式与 Jmol 非常相似。JSmol 可用于创建在线教程，包括动画内容。

Proteopedia^31,32、Jmol 中的 FirstGlance³³ 以及位于密尔沃基工程学院生物分子建模中心的 JSmol 网络界面（JUDE）是基于 Jmol 的在线设计环境的示例³⁴。Proteopedia 维基是一个教学工具，允许用户对大分子结构进行建模，并在网站内创建包含这些模型的页面³⁵。Proteopedia 场景编写工具基于 JSmol 构建，集成了图形用户界面（GUI），并提供了 Jmol GUI 中所不具备的附加功能。

Jmol 和 iCn3D 基于 Java 编程语言；JSmol 使用 Java 或 HTML5，而 PyMOL 和 ChimeraX 基于 Python 编程语言。这些程序均可加载蛋白质数据库文件，此类文件可从 RCSB 蛋白质数据库下载，下载时需使用 4 位字母数字组成的 PDB ID^36,37。最常见的文件类型是包含 .pdb 扩展名的蛋白质数据库（PDB）文件，以及包含 .cif 扩展名的晶体学信息文件（CIF 或 mmCIF）。目前，CIF 已取代 PDB 成为蛋白质数据库的默认文件格式，但这两种文件格式均可在上述程序中使用。使用 CIF 文件与 PDB 文件时，序列/结构的显示方式可能存在细微差异；然而，两种文件的功能基本相似，此处不详细讨论这些差异。分子模型数据库（MMDB）是美国国家生物技术信息中心（NCBI）开发的产品，为蛋白质数据库结构的一个子集，其中关联了分类信息（例如生物学特征、保守的蛋白质结构域）³⁸。iCn3D 是 NCBI 开发的产品，能够加载包含 MMDB 数据的 PDB 文件。

要查看模型，用户可从该结构对应的专用蛋白质数据库页面（例如：https://www.rcsb.org/structure/3FGU）下载所需文件，然后使用程序中的下拉文件菜单打开该结构。所有程序也可通过界面直接加载结构文件，该方法在实验方案中有详细说明。

ChimeraX、Jmol 和 PyMOL 的图形用户界面各自包含一个或多个控制台窗口，可通过拖动角落调整其大小。iCn3D 和 JSmol 完全在网页浏览器中运行。使用 iCn3D 时，由于屏幕尺寸和分辨率的不同，用户可能需要在弹出窗口内滚动以查看全部菜单项。

本文详述的实验方案提供了一种使用各程序展示酶活性位点的简便方法。需要注意的是，每个程序中的操作步骤可能存在多种执行方式。例如，在 ChimeraX 中，同一任务可通过下拉菜单、顶部工具栏或命令行来完成。建议希望深入了解某一特定程序的用户查阅这些程序提供的在线教程、手册和维基文档^{39,40,41,42,43,44,45,46}。

现有这些程序的手册和教程将本方案中的操作项目作为独立任务进行介绍。为了显示一个活性位点，用户必须从各种手册和教程中自行整合所需的操作步骤。本文通过提供一个用于构建带有分子相互作用的标记活性位点的线性操作流程，补充了现有的教程内容，为用户建立了一套可用于其他模型和程序的活性位点建模逻辑。

图 3：ChimeraX 图形用户界面。 ChimeraX 图形用户界面，标注了下拉菜单、工具栏、结构查看器和命令行。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：iCn3D 图形用户界面。 iCn3D 图形用户界面，标注了下拉菜单、工具栏、结构查看器、命令日志、选择集弹出窗口，以及序列和注释弹出菜单。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：Jmol 图形用户界面。 Jmol 图形用户界面，标注了下拉菜单、工具栏、结构查看器、弹出菜单以及控制台/命令行。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 6：PyMOL 图形用户界面。PyMOL 图形用户界面，标注了下拉菜单、结构查看器、名称/对象面板、鼠标控制菜单和命令行。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

注意：每个程序的流程均分为十个总体步骤：（1）将结构载入程序；（2）识别活性位点中的配体；（3）调整结构显示方式；（4）选择距活性位点5 Å范围内的残基以定义活性位点；（5）显示酶与活性位点配体之间的相互作用；（6）以棍状形式显示侧链，并显示/调整活性位点中的水分子；（7）简化结构；（8）标记配体及形成氢键的侧链；（9）在任意阶段保存渲染结果，以便后续继续编辑或与他人共享；（10）保存用于嵌入或打印的图像。其中，步骤1、4以及7至10在各程序中均相同；然而，由于各程序操作方式不同，部分流程在交换步骤2/3与5/6的顺序后执行效率更高。

1. UCSF ChimeraX 操作流程

注意：触控板与鼠标控制。旋转操作：点击并拖动，或使用双指拖动（鼠标操作：左键点击并拖动）。缩放操作：捏合或张开手指（Mac）或按住 Ctrl 键并使用双指移动（PC）（鼠标操作：滚动滚轮）。平移操作（即移动整个结构）：按住 Option 键并点击拖动（Mac），或按住 Shift 键并点击拖动（PC）（鼠标操作：右键点击并拖动）。重新居中：使用界面顶部的下拉菜单，点击 操作 > 视图。

1. 将结构载入 ChimeraX：在图形用户界面底部的命令行中（以 "Command:" 开头），输入：
   open 3fgu
   注意：输入任何命令行后，请按键盘上的回车键以执行该命令。
2. 识别活性位点中的配体：确保存在两种表示方式，即卡通带状图和棍状图。使用鼠标旋转/缩放蛋白质，以最佳视角观察位于蛋白质中心附近的配体（以棍状显示）。将鼠标悬停在配体上可显示其名称。
3. 调整表示方式：使用以下子步骤中的命令重新为蛋白质和配体着色，对非碳原子应用CPK着色，然后取消选择。分子中被选中的部分将以绿色高亮显示。
   1. 使用界面顶部的下拉菜单更改着色方式：点击 Actions > Color > Cornflower Blue。然后点击 Select > Structure > Ligand。为配体选择颜色，点击 Actions > Color > Gray。为应用CPK着色，点击 Select > All，然后点击 Actions > Color > By Heteroatom。最后，通过点击 Select > Clear 清除选择。
      注意：也可通过按住 control 键并在结构视图的黑色背景区域点击，或在命令行中输入：~select 来清除选择。默认情况下，对于大多数包含1-4条链的结构，ChimeraX 会自动显示配体和离子周围3.6 Å范围内的水分子和氨基酸残基。
   2. 使用下拉菜单隐藏当前显示的原子：点击 Actions > Atoms/Bonds > Hide。
   3. 使用下拉菜单显示活性位点中的配体和 Mg 离子：点击 Select > Structure > Ligand，然后点击 Actions > Atoms/Bonds > Show。接着点击 Select > Residues > MG，再点击 Actions > Atoms/Bonds > Show。为清除选择，点击 Select > Clear。
      注意：使用下拉菜单完成选择后，步骤 1.3.3 也可通过点击 Atoms 工具栏中的 Hide 和 Show 按钮执行。
4. 选择距离5 Å以内的残基以定义活性位点：在结构视图中，按住 control + shift 键，并用鼠标分别点击三个配体（即 BCG, ANP 和 Mg）中的任意一个原子或键，以选择这些配体。
   1. 接着按键盘上的向上箭头键，直到三个配体的所有原子均以绿色光晕高亮显示。为将来使用定义此选择：在下拉菜单中点击 Select > Define Selector。在弹出菜单中输入：
      ligands 以命名当前选择，然后点击 OK。
      注意：在步骤 1.4.1 中若向上箭头按键次数过多，将导致整个蛋白质被选中。此时，请点击向下箭头键，直到仅三个配体的原子被选中为止。
   2. 使用下拉菜单选择距离配体5 Å范围内的残基：点击 Select > Zone。在弹出窗口中，将 Select 下拉菜单切换为 Residues，并确保顶部复选框已勾选（勾选小于 (<) 的距离，并设置为 5.0 Å）。然后点击 OK。仅距离小于 5 Å 的残基将被高亮显示。
      注意：步骤 1.4–1.4.2 可通过命令行大幅简化，输入以下命令：
      name frozen ligands :BGC:MG:ANP
      select zone ligands 5 extend true residues true
5. 以棍状显示侧链，并显示/调整活性位点的水分子：使用下拉菜单显示选择，并通过点击 Actions > Atoms/Bonds > Show 来显示它们。为居中显示选择，点击 Actions > View。然后，点击 Select > Clear 或点击空白区域以清除选择。
6. 显示酶与活性位点配体之间的相互作用：使用下拉菜单，点击 Select > User-Defined Selectors > Ligands。然后点击 Tools > Structure Analysis > H-bonds。在弹出窗口中，确保勾选 Limit by Selection，下拉菜单设置为 “With At Least One End Selected”，并勾选 Select Atoms，然后点击 OK。为清除选择，点击 Select > Clear。
   注意：勾选 Distance Label 框可查看以 Å 为单位的键长；但此操作会使视图变得非常杂乱。最后，可通过点击 Color 框并在弹出窗口中选择新颜色来更改氢键的颜色。
7. 简化结构：使用顶部的卡通工具栏隐藏卡通图，或点击下拉菜单：Actions > Cartoon > Hide。
8. 标记配体和形成氢键的侧链：使用鼠标选择与配体形成氢键的残基（由虚线连接），如步骤 1.4 所示。然后在下拉菜单中点击 Actions > Label > Residues > Name Combo。接着点击 Select > User-Defined Selectors > Ligands。然后点击 Actions > Label > Residues > Off。最后，点击 Select > Clear 以清除选择。
9. 在任意时刻保存渲染结果，以便后续继续工作或与他人共享：在下拉菜单中点击 File > Save。选择保存位置，输入文件名，然后点击 Save。
   注意：确保格式设置为：ChimeraX 会话文件 *.cxs。
10. 保存图像用于嵌入或打印：首先使用鼠标将分子调整至所需方向。在命令行中输入以下命令，将背景颜色更改为白色：
    set bgColor white
    最后，点击工具栏中的 snapshot icon。图像将保存至桌面。
    注意：背景颜色也可在下拉菜单中设置；在 Mac 上，点击 UCSF ChimeraX > Preferences；在 PC 上，点击 Favorites > Settings > Background。

2. iCn3D 操作流程

注意：触控板和鼠标控制：旋转操作，请点击并拖动（鼠标：左键点击并拖动）。缩放操作，请捏合或张开手指（鼠标：滚动滚轮）。平移（即移动整个结构），请用两个手指点击并拖动（鼠标：右键点击并拖动）。重新居中，请将光标悬停在顶部下拉菜单中的“View”上，然后点击 Center Selection。

1. 将结构载入 iCn3D：前往 iCn3D 基于网络的 3D 结构查看器并输入 3FGU 进入 输入 MMDB 或 PDB 编号 框以加载文件。
2. 确定活性位点中的配体：在下拉菜单中将光标悬停于“Analysis”，然后点击 序列与注释序列在此以堆叠表格形式显示，包括蛋白质以及化学物质/离子/水。向下滚动可查看活性位点配体ANP、BGC和Mg的列表。在结构查看器中，将光标悬停于活性位点中的配体上（在蛋白质示意图中心以棍状表示），即可显示其名称。
3. 调整显示方式：本方案无需进行初始调整。
4. 选择距活性位点5 Å以内的残基：要选择配体，请使用 选择 下拉菜单并点击 选择 3D确保 残基 被检查。
   1. 选择配体时，按住 PC 上的 ALT 键或 Mac 上的 Option 键，然后单击第一个配体（例如， BCG）使用鼠标或触控板操作。然后，按住 control 键并点击 ANP 和 MG 配体以将其加入选择。
      注意：配体被选中时将高亮显示为黄色。
   2. 使用下拉菜单保存此选择：单击 选择 > 保存所选内容 并在弹出窗口中使用键盘输入名称（例如， 3配体），然后点击 保存此时将出现“选择集合”弹出窗口。
      注意：如果选择不正确，请单击 选择 > 清除选择.
   3. 选择配体5 Å范围内的残基：在下拉菜单中，点击 选择 > 按距离在弹出的菜单中，通过在输入框内键入数值，将第二项（半径为球体）更改为 5 Å。点击带框的词语 显示，然后单击右上角的叉号关闭窗口。
      注意：在步骤 2.4.3 中出现的弹出菜单里，保留第一组输入设置 "已选" 第二组作为 "未选择" 注意，当原子/结构在5 Å范围内时，会以黄色光晕高亮显示 显示 被点击。
   4. 使用下拉菜单保存5 Å活性位点：将光标悬停在“Select”上，然后点击 保存所选内容，在弹出窗口中使用键盘输入名称（例如， 5Ang），然后点击 保存.
   5. 接下来创建一个将两组（5Ang 和 3Ligands）合并的新选择：在 选择集合 弹出菜单，按住 Ctrl 键点击（PC）或按住 Command 键点击（Mac） 5Ang 和 3配体. 点击 选择 > 保存选中内容，使用键盘输入名称（例如， 5AFull），然后点击 保存.
5. 显示酶与活性位点配体（如氢键）之间的相互作用：在下拉菜单中将光标悬停于“Analysis”，然后点击 相互作用所有非共价相互作用的综合弹出式菜单将出现。
   1. 除以下项目外，取消勾选所有内容 "氢键" 和 "盐桥/离子" 复选框。单击 3配体 选择第一组 5Ang 对于第二组，点击显示为方框文本的内容 3D 显示交互单击右上角的叉号关闭窗口。
      注意：接触/相互作用可能代表诱导偶极-诱导偶极相互作用，此类相互作用常使显示结果显得密集。如需要，可调整任意类型相互作用的距离。
   2. 仅显示氢键，请点击 5A完整版 在“选择数据集”弹出窗口中，将鼠标悬停在下拉菜单中的“分析”上，然后单击 化学结合 > 展示.
6. 以棍状形式显示侧链，并显示/调整活性位点的水分子：使用选择集弹出菜单，然后单击 5AFull然后，在下拉菜单中，点击 风格 > 侧链 > 棒状物要应用CPK着色，请点击 颜色 > 原子最后，单击 风格 > 水 > 球体 （如果您希望水分子更大一些）。
7. 简化结构：在“选择集”弹出菜单中，单击 5AFull然后，在下拉菜单中，点击 查看 > 查看选择 （仅显示5AFull结合位点）。接下来，点击 风格 > 蛋白质 > 棒状物 （将蛋白质链显示为棍状而非带状）。
   1. 要将配体的碳原子着色为对比色，请点击 化学品 在 选择集合 弹出窗口。然后，在下拉菜单中，点击 查看 > 查看选项接下来点击 选择 > 选择 3D （确保 "原子" （已检查）。使用步骤2.4.1中描述的控制方式，通过鼠标和键盘选中BGC和ANP中的所有碳原子，然后在下拉菜单中点击 颜色 > 单色 > 青色 > 青色.
   2. 要重新显示整个活性位点，请使用 选择集合 弹出窗口以点击 5AFull然后，在下拉菜单中，单击 查看 > 查看选择.
8. 标记配体和氢键连接的侧链：使用选择集合弹出窗口进行选择 界面_all，然后在下拉菜单中，单击 分析 > 标记 > 每残基 & 编号.
   注意：您需要重新选择“按残基” & 每次添加标签时均需重新编号，即使该菜单项因先前的标签已处于选中状态。
9. 随时保存渲染结果以便继续编辑或与他人共享：在下拉菜单中，点击 文件 > 分享 链接。复制短网址（例如：https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8） 并将其粘贴到浏览器中。
10. 保存用于嵌入或打印的图像：在下拉菜单中，单击 选择 > 切换高亮然后，单击 风格 > 背景 > 白色最后，点击 文件 > 保存文件 > iCn3D PNG 图像 并选择所需尺寸。

3. Jmol 实验方案

注意：触控板和鼠标操作说明：旋转操作为点击并拖动（鼠标操作：左键点击并拖动）。缩放操作为使用两个手指垂直滚动（鼠标操作：按住 Shift 键 + 左键点击并垂直拖动）。平移操作（即移动整个结构）为 Control + Alt + 点击并拖动（PC），Control + Option + 点击并拖动（Mac）。重新居中操作：在结构查看器窗口的空白区域按下 Shift 键并双击。

1. 将结构载入 Jmol：使用 GUI 顶部的下拉菜单，通过点击 文件 > 控制台 设置工作区。然后，点击 文件 > 获取 PDB。在弹出窗口中输入：3fgu
   接着点击 确定。
   注意：也可以使用 Jmol 控制台载入结构，输入命令：load = 3fgu
   注意：输入任何命令行后，需按键盘上的回车键以执行该命令。
2. 调整分子表示方式：通过在 结构查看窗口 的任意位置右键单击（或按住 Control 键并单击）打开弹出菜单。
   1. 要将蛋白质更改为卡通表示形式，在弹出菜单中依次点击 选择 > 选择高亮。接着点击 选择 > 蛋白质 > 全部。最后点击 样式 > 方案 > 卡通。
      注意：选择高亮会在所有被选中的原子周围添加黄色轮廓（发光效果）。
   2. 使用顶部下拉菜单，通过点击 显示 > 选择 > 水分子 隐藏水分子。接着点击 显示 > 原子 > 无，最后点击 显示 > 选择 > 无。
3. 识别活性位点中的配体：使用鼠标放大活性位点区域，然后按照子步骤中的命令将配体以棍状形式显示。
   注意：载入文件后，配体名称会显示在 Jmol 控制台中。您也可以通过弹出菜单查看结合配体的名称，方法是点击 选择 > 异源分子 > 按 HETATM。
   1. 将鼠标悬停在配体上以查看其名称。活性位点位于结构中心附近；配体 MG、BGC 和 ANP 位于活性位点内。
   2. 选择配体 BGC 和 ANP：在 Jmol 控制台中输入：
      select BGC, ANP
   3. 要将配体 BCG 和 ANP 以棍状形式显示，请使用弹出菜单并点击 样式 > 方案 > 棍状。
4. 选择距离 5 Å 范围内的残基以定义活性位点：在 Jmol 控制台中输入以下命令，以选择距离三个配体 5 Å 范围内的原子：
   select within (5, (bgc,anp,mg))
   1. 若要选择完整的氨基酸残基，请在控制台中输入以下命令并按 回车：
      select within(group, selected)
      注意：使用 Jmol 控制台是选择 5 Å 范围内残基的最佳方式。
5. 以棍状形式显示侧链，并显示/调整活性位点中的水分子：右键单击以调出弹出菜单，将鼠标悬停在 样式 > 方案 > 棍状 上。
   注意：步骤 3.5 将活性位点的侧链以棍状形式显示。结构中仍会存在一些空的高亮区域，代表活性位点中的水分子。
   1. 在 Jmol 控制台中重新执行以下命令：
      select within (5, (bgc,anp,mg))
      注意：要重新执行命令，请在控制台内单击，然后使用键盘方向键直到该命令出现，再按回车键重新执行。
   2. 要显示水分子的原子，请通过输入以下两条命令从选择中移除配体和蛋白质：
      select remove group protein
      select remove group hetero and not water
   3. 要显示水分子，请点击下拉菜单 显示，将鼠标悬停在“原子”上，然后点击 20% 范德华半径。绿色的镁离子仍将以棍状形式显示。通过在 Jmol 控制台中输入以下命令，将镁离子改为更常见的球状表示：
      select Mg
      spacefill 50%
   4. 为配体重上色以区别于蛋白质：在 Jmol 控制台中输入以下命令，执行将配体重新着色为较浅颜色方案的操作：
      select (bgc,anp) and carbon; color [211,211,211]
      select (bgc,anp) and oxygen; color [255,185,185]
      select (bgc,anp) and nitrogen; color [150,210,255]
      select (bgc,anp) and phosphorus; color [255,165,75]
      select Mg; color palegreen
6. 显示酶与活性位点配体之间的相互作用：在 Jmol 控制台中，逐行执行以下命令：
   define ligbind (ANP, BGC, MG)
   select within (5, (bgc,anp,mg))
   select remove group hetero and not water
   1. 要显示代表氢键的线条，请在 Jmol 控制台中输入以下命令：
      connect 3.3 (ligbind and (oxygen or nitrogen)) (selected and (oxygen or nitrogen)) strut yellow
      然后，通过在控制台中输入以下命令修改线条粗细：
      select all; strut 0.1; select none
7. 简化结构：要隐藏蛋白质的卡通表示并清除选择，在 Jmol 控制台中输入：
   select all; cartoon off; select none
8. 标记配体及形成氢键的侧链：在弹出窗口中点击 设置拾取 > 选择原子。点击其中一个形成氢键的残基中的某个原子，氨基酸名称和残基编号将显示在控制台中。然后使用控制台输入标签，例如：
   label Glu-256
9. 在任意时刻保存当前渲染结果，以便后续继续编辑或与他人共享：在顶部菜单中点击相机图标，输入文件名并选择保存位置。
   注意：导出的 JPEG 文件（.jpg）不仅包含导出时显示窗口中图像的外观信息，还包含模型的当前状态。要重新加载模型，可打开 Jmol 并将保存的 JPEG 文件拖入 Jmol 显示窗口。
10. 保存用于嵌入或打印的图像：在 Jmol 控制台中输入以下命令，将背景颜色更改为白色：
    background white
    与步骤 3.9 相同，点击相机图标并保存文件。

4. PyMOL 操作流程

注意：触控板和鼠标操作说明：旋转时，请点击并拖动（鼠标操作：左键点击并拖动）。缩放时，请用双指捏合或张开（鼠标操作：右键点击并拖动）。平移（即移动整个结构）时，请按住 Control 键 + 点击并拖动（鼠标操作：按住 Command 键 + 左键点击并拖动）。如需重新居中，请前往右侧对象面板，点击 A > 定向或居中。

1. 将结构载入 PyMOL：在 GUI 顶部附近的命令行中（以 "PyMOL>” 开头），输入：
   fetch 3FGU
   注意：输入任何命令行后，请按键盘上的回车键以执行该命令。
2. 调整显示方式：在 PyMOL 窗口右侧的名称/对象面板中，点击 "3FGU" 右侧的 H > Waters。
3. 识别活性位点中的配体：首先通过点击顶部下拉菜单启用序列查看器：Display > Sequence。
   1. 将灰色滑块向右滚动，直到找到配体名称（BCG、ANP、MG、K）。
      注意：结构中有两种表示方式，即卡通带状图和棍状图；配体以棍状形式显示。请确保右下角鼠标控制面板中的选择模式设置为 Residue 和 3-Button Viewing 模式，可通过点击这些名称在选项间切换。
   2. 使用鼠标旋转并缩放结构，使配体可见。
4. 选择距离在 5 Å 以内的残基以定义活性位点：要选择活性位点中的配体，请在结构查看器中依次点击每个配体（BCG、ANP、MG）。此时在名称/对象面板中会弹出一个新选择；在名为 "sele" 的新对象右侧，点击 A 按钮，然后在弹出菜单中点击 Rename。
   注意：若需清除不需要的选择，可在结构查看器中点击空白区域以取消选中。
   1. 使用键盘删除结构查看器窗口左上角出现的 "sele" 字母，并输入：
      ligands
      注意：步骤 4.4–4.4.1 可通过命令行完成；输入：
      sele ligands, resn BGC+ANP+MG
   2. 使用此选择来定义配体周围的区域：首先复制该选择，点击 ligands > A > Duplicate。然后点击 sel01 > A > Rename。
      使用键盘删除 "se101" 并输入：
      active
   3. 修改此选择以显示 5 Å 范围内的残基：在名称/对象面板中，点击 active > A > Modify > Expand > by 5 A, Residues。接着，为将这些残基显示为棍状，点击 active > S > Licorice > Sticks。最后，在 Structure Viewer 中点击空白区域以清除选择。
      注意：步骤 4.4.3 可通过命令行完成；输入：
      sele active, byres all within 5 of ligands
      show sticks, active
5. 将侧链显示为棍状，并显示/调整活性位点的水分子：在名称/对象面板中点击 ligands > A > Duplicate。为重命名该选择，点击 Sel02 > A > Rename Selection。删除结构查看器右上角重命名菜单中出现的字母，并输入：
   active_water
   1. 为调整新选择以包含活性位点的水分子，点击 active_water > A > Modify > Around > Atoms Within 4 Angstroms。为进一步修改并限制为水分子，点击 active_water > A > Modify > Restrict > To Solvent。最后，点击 active_water > A > Preset > Ball and Stick。
      注意：图形用户界面（GUI）允许选择 4 Å 范围内的原子；而命令行可选择更适合氢键水分子的 3.3 Å 距离。GUI 中无法设置球体的范德华半径，但 "ball and stick" 选择的半径接近 0.5 Å。
      注意：步骤 4.5–4.5.1 可通过命令行执行，输入以下每行代码：
      select active_water, ((ligands)around 3.3) and (resn HOH)
      show spheres, active_water
      alter active_water, vdw=0.5
      rebuild
6. 显示酶与活性位点配体之间的相互作用：通过点击 active > A > Zoom 放大活性位点。为查找配体与活性位点之间的极性接触，点击 ligands > A > Find > Polar Contacts > To Any Atoms。通过点击 ligands_polar_contacts > S > Labels 将距离显示为标签。
7. 简化结构：在名称/对象面板中，点击 3FGU > H > Cartoon 以隐藏蛋白质的卡通表示，从而隐藏非活性位点区域。接着，在名称/对象面板中点击 ligands_polar_contacts > H > Labels 以隐藏氢键长度的标签。
   1. 为区分配体与蛋白质，对配体进行着色：在名称/对象面板中点击 ligands > C > By Element > CHNOS，并选择 "C" 为青色（浅蓝色）的选项。
      注意：步骤 4.7.1 可通过命令行执行；输入：
      color cyan, ligands
      color atomic, ligands & !elem C
8. 标记配体及氢键结合的侧链：在名称/对象面板中，点击任一对象名称右侧的按钮 active > L > Residues。
9. 在任意时刻保存渲染结果，以便后续继续编辑或与他人共享：点击下拉菜单中的 File > Save Session As，然后在弹出窗口中选择保存位置，输入文件名，并点击 Save。
10. 保存图像用于嵌入或打印：首先在下拉菜单中点击 Display > Background > White 将背景更改为白色。然后点击 File > Export Image As > PNG 将图像导出为新文件。

结果

每项程序成功执行后，将得到一个聚焦于活性位点的分子模型，其中活性位点的残基和配体以棍状形式显示，蛋白骨架图隐藏，配体采用对比色显示。相互作用的氨基酸残基应标注其标识符，并用线条标示氢键和离子相互作用。这些特征的存在可通过模型的直观观察来确定。

为了便于进行此项检查，并帮助用户判断是否正确执行了实验方案的各个步骤，我们提供了动画图示，以展示每一步骤完成后结构的状态。对于 ChimeraX、iCn3D、Jmol 和 PyMOL，分别如图7-10所示。

图7：ChimeraX 实验方案输出结果。 动态图示展示了 ChimeraX 实验方案的步骤1.1–1.8。请点击此处下载该图。

图8：iCn3D 协议输出结果。 动态图示展示 iCn3D 协议的步骤 2.1–2.8。请点击此处下载该图。

图9：Jmol 实验方案输出结果。 动态图示展示了 Jmol 实验方案的步骤 3.1–3.8。请点击此处下载该图。

图10：PyMOL 实验方案输出结果。 动态图示展示 PyMOL 实验方案的步骤 4.1–4.8。请点击此处下载该图。

可能影响这些方案结果的最常见错误是选择不当，导致结构的一部分以不希望的渲染方式显示。这通常是由于误点击所致，可能是点击了结构本身，也可能是点击了显示菜单中的某个按钮。一个次优结果的例子是，模型中包含活性位点之外的残基以棍状形式显示。用户可以通过目视检查以棍状显示的残基，并确认它们是否位于活性位点配体附近，来初步判断是否发生了此类错误。评估显示的残基是否在活性位点配体5Å范围内的进阶方法，是使用各程序内置的测量工具，测量邻近配体与活性位点残基之间的距离。测量工具的使用超出了本文的范围，但我们鼓励感兴趣的用户查阅大量详述此类分析的在线教程以进一步学习。

我们展示一个由于在 PyMOL 中错误点击名称/对象面板而导致该实验方案执行不理想的特定示例。此错误会以棍状模型显示整个蛋白质，而不是仅用该表示方式显示活性位点，如图11所示。

图11：阴性结果。 阴性结果的示例。在PyMOL中错误地选择了完整的卡通图并显示为棍状模型。请点击此处查看该图的放大版本。

为排除故障，用户需要先隐藏整个模型的棍状表示（在名称/对象面板中标识为3FGU），然后在PyMOL中使用隐藏和显示按钮/命令，仅对名为“active”的选定部分显示其棍状表示。一旦用户能够为模型的不同部分创建合适的选区，并有效控制其显示与隐藏，从此类错误中恢复模型就相对简单。虽然重新开始实验流程并再次逐步操作颇具诱惑力，但我们鼓励用户不要害怕脱离既定步骤，大胆对模型进行尝试。根据我们的经验，解决显示错误的过程有助于加深对建模程序的理解。

每个程序成功执行后的最终输出结果并列显示在图12中。视图采用相似的取向，以便用户比较不同程序所创建模型的外观。

图 12：不同程序的最终结构对比。 对本实验方案结束时各程序生成的活性位点结构的比较。A：ChimeraX，B：iCn3D，C：Jmol，D：PyMOL。PyMOL 的活性位点标签包含所有活性位点残基及配体，而其他程序的输出仅标注了形成氢键的侧链。请点击此处查看此图的高清版本。

讨论

本方案概述了酶活性位点建模的十个步骤，并将其应用于四种常用的生物分子建模软件。该方案的关键步骤包括：识别活性位点中的配体，选择距活性位点5 Å以内的残基以界定活性位点区域，以及展示酶与活性位点配体之间的相互作用。区分与生物学功能相关的配体至关重要，因为这使用户能够确定5 Å范围内可能参与配体结合的氨基酸残基。最后，利用程序展示分子相互作用，使用户能够掌握理解促进结合的分子相互作用所必需的技能。

基于计算机的分子建模方法的一个局限性在于其对特定命令和语法的依赖性。尽管生物化学实验方案可能允许操作步骤中有微小变动，但基于计算机的研究若未严格遵循既定流程，则可能产生截然不同的最终结果。这一点在使用命令行界面时尤为重要，因为必须使用程序特定的语法才能获得预期输出，而标点符号或大小写的看似微不足道的更改都可能导致命令执行失败。每种程序通常都有相应的各种 Wiki 页面和用户手册，用户可在其中查找并排查命令行输入的问题；因此，用户应仔细关注命令语法的每一个细节。尽管大多数分子可视化程序都包含“撤销”命令，但由于界面复杂，“撤销”功能并不总能准确地逆转上一步操作。因此，建议经常保存当前工作状态，特别是对于新用户而言更为重要。

模型本身所使用的数据也可能带来进一步的局限性。尽管蛋白质数据库（Protein Data Bank）中的固有标准确保了一定程度的一致性，但分子可视化程序的使用者常常会在蛋白质的渲染图像中遇到意想不到的效果。首先，大多数结构是通过X射线晶体学确定的，该方法仅提供蛋白质的一个单一模型；然而，核磁共振（NMR）结构通常由多个模型组成，可逐个进行可视化。其次，通过晶体学或冷冻电子显微镜实验确定的结构可能包含某些无法明确其位置的原子，这些原子在蛋白质的某些表示形式中会呈现为缺口。蛋白质结构中的侧链可能存在多种构象，在以棍状模式显示时，会表现为从同一氨基酸主链上伸出的两组不同结构。甚至短段的主链也可能存在此类替代构象，有时配体在活性位点中也会以多种结合构象叠加存在。

对于晶体结构，已提交的三维坐标包含非对称单元的所有组分，这些信息足以重构蛋白质晶体的重复单元。有时，该结构所包含的蛋白质链可能多于蛋白质的生物学活性形式（例如，胎儿血红蛋白突变体，PDB ID: 4MQK）。相反，某些程序可能不会自动加载生物学活性单元中的全部蛋白链。例如，在ChimeraX、PyMOL和Jmol中使用本实验方案所述命令获取SARS-CoV-2主蛋白酶（PDB ID: 6Y2E）结构时，仅加载了生物学活性二聚体的一半（由两条蛋白链组成）。尽管对命令稍作修改即可加载完整的生物学活性二聚体，但对于建模软件的新手用户而言，这一操作可能并不直观。另一个可能出现的问题是活性位点或底物本身的识别。晶体学实验中使用了多种分子，这些分子可能被建模到最终结构中。例如，硫酸根分子可能结合在活性位点的磷酸结合位点，也可能结合在与催化机制无关的其他区域。这些分子可能妨碍对活性位点的正确识别，甚至可能使学生误认为它们参与了催化机制。

用户可能希望将此方法应用于其他活性位点或结合位点。在今后涉及新蛋白质活性位点分析的工作中，若要应用本实验方案，用户需要确定哪些结合的配体与蛋白质功能相关。某些配体并不参与蛋白质功能，而是实验所用溶剂或结晶条件的产物（例如 3FGU 模型中存在的钾离子）。关键配体应通过查阅原始文献来确认。通过实践，以及在适用的情况下掌握命令行语法，用户将能够将该方案应用于任意酶活性位点的建模，并对其选择的其他大分子进行建模。

鉴定和分析结合的底物与配体对于阐明分子机制以及基于结构的药物设计至关重要，这些研究已直接推动了包括获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）和 COVID-19 在内的疾病治疗手段的进步^{47,48,49,50,51,52}。尽管不同的分子可视化程序提供各具特色的界面和用户体验，但大多数程序具备相似的功能。在生物化学高年级学生中培养生物分子可视化能力至关重要，他们需要熟悉结构可视化及其图像生成工具^4,20,53。这有助于学生超越教科书和期刊文章中二维图像的解读，更轻松地基于结构数据提出自己的科学假设⁵⁴，从而为未来科研人员应对公共卫生问题、深化对生物化学过程的理解做好准备。

综上所述，本实验方案详细介绍了使用四种主流的免费大分子建模程序进行活性位点建模的方法。我们的社区 BioMolViz 采用与具体软件无关的生物分子建模教学方法。本文并未对各程序的功能进行批评或比较，尽管用户在试用不同程序后，可能会发现其中某一程序在某些大分子建模方面更符合个人偏好。我们邀请读者使用 BioMolViz 教学框架，该框架明确了本方案所涉及的基于生物分子可视化学习的学习目标与教学目的，并通过 BioMolViz 社区网站 http://biomolviz.org 获取有关生物分子可视化教学与学习的更多资源。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ChimeraX（版本 1.2.5）https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
计算机			任意
iCn3D（仅限网络版：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html）
Java（用于 Jmol）https://java.com/en/download/
Jmol（版本 1.8.0_301）http://jmol.sourceforge.net/
鼠标（可选）			任意
PyMOL（版本 2.4.1 - 教育版）：https://pymol.org/2 仅限教育用途版本：https://pymol.org/edu/?q=educational