本方案描述了一种研究细胞外基质黏弹性及其对蛋白质组成或环境因素依赖性的方法。所针对的基质系统为小鼠睫状小带。通过比较野生型睫状小带纤维与缺乏微纤维相关糖蛋白-1的纤维的黏弹性行为，展示了该方法的应用效果。
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摘要
摘要
弹性对于血管、肌肉和肺等组织的功能至关重要。这种特性主要来源于细胞外基质（ECM），即连接细胞与组织的蛋白质网络结构。ECM网络的弹性特性如何与其组成相关，以及ECM的应力松弛特性是否具有生理学意义，这些问题尚未得到充分解答。部分挑战在于大多数ECM系统的复杂结构，以及在不破坏其结构的前提下难以分离ECM组分。一个例外是晶状体悬韧带（zonule），这是一种存在于脊椎动物眼球中的ECM系统。晶状体悬韧带由长度从数百至数千微米的纤维组成，跨越晶状体与眼球壁之间的无细胞间隙。在本报告中，我们描述了一种力学检测技术，该技术利用晶状体悬韧带高度有序的结构来量化其黏弹性特性，并确定各个蛋白质组分的贡献。该方法包括解剖固定的眼球以暴露晶状体和晶状体悬韧带，并采用一种“拉起”技术，在监测张力的同时均匀拉伸悬韧带纤维。该技术成本相对较低，但灵敏度足够高，能够检测缺乏特定悬韧带蛋白的小鼠或随年龄增长过程中悬韧带纤维黏弹性特性的改变。尽管本文所述方法主要用于研究眼部发育与疾病，但它也可作为实验模型，用于探索更广泛的问题，例如弹性ECM的黏弹性特性，以及离子浓度、温度和信号分子相互作用等外部因素所起的作用。
引言
脊椎动物的眼睛包含一个活的光学晶状体，有助于将图像聚焦在视网膜上1。晶状体通过一套精细的、呈放射状排列的纤维悬挂在光轴上，如图1A所示。这些纤维一端附着于晶状体赤道部，另一端附着于睫状体表面。其长度范围从小鼠的150 µm到人类的1 mm不等。这些纤维统称为Zinn小带（zonule of Zinn）2、睫状小带（ciliary zonule），或简称为小带（zonule）。眼部外伤、疾病以及某些遗传性疾病均可影响小带纤维的完整性3，最终导致纤维断裂并伴随视力丧失。在小鼠中，这些纤维的核心主要由纤维蛋白-2（fibrillin-2）构成，外围则被富含纤维蛋白-1（fibrillin-1）的鞘层包裹4。尽管小带纤维为眼部特有，但其与体内其他部位存在的以弹性蛋白（elastin）为基础的细胞外基质（ECM）纤维具有许多相似之处。后者同样被一层纤维蛋白-1（fibrillin-1）包裹5 ，且尺寸与 小带纤维相似6。其他一些蛋白质，如潜伏型转化生长因子β结合蛋白（latent-transforming growth factor β-binding proteins, LTBPs）和微纤维相关糖蛋白-1（microfibril-associated glycoprotein-1, MAGP-1），也存在于这两类纤维中7,8,9,10,11。小带纤维的弹性模量范围为0.18–1.50 MPa12,13,14,15,16，与以弹性蛋白为基础的纤维（0.3–1.2 MPa）相当17。这些结构和力学上的相似性提示我们，对小带相关蛋白功能的任何深入理解，都有助于阐明它们在其他细胞外基质弹性纤维中的作用。
建立本方法的主要目的是深入了解特定悬韧带蛋白在遗传性眼病进展中的作用。该方法的总体思路是，比较野生型小鼠与携带悬韧带蛋白编码基因靶向突变的小鼠之间悬韧带纤维的黏弹性特性。尽管此前已有多种方法用于测量悬韧带纤维的弹机械性能，但这些方法均针对体型更大动物的眼睛而设计12,13,14,15,16。由于此类模型在遗传操作上存在困难，因此我们致力于开发一种更适用于小鼠微小而脆弱眼球的实验方法。
我们开发的用于评估小鼠悬韧带纤维黏弹性特性的方法是一种被称为拉起实验的技术4,18，其内容在图中以可视化方式概括 图1下文将详细介绍拉伸法及其结果分析。首先，我们将描述实验装置的构建过程，包括项目中使用的三维（3D）打印部件。接着，详细说明获取和准备实验眼球的实验方案。最后，提供获取悬韧带纤维黏弹性特性数据的逐步操作指南。在代表性结果部分，我们展示了利用本方法获得的、关于缺乏MAGP-1的小鼠悬韧带纤维黏弹性特性的未发表数据。19 以及从同龄野生型动物获得的对照组数据。最后，我们对本方法的优势与局限性进行总结，并提出一些可能有助于阐明环境因素和生化因素如何影响细胞外基质纤维黏弹性特性的潜在实验建议。
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方案
所有动物实验均经华盛顿大学动物研究委员会批准，并遵循眼科与视觉研究中动物使用 ARVO 声明。
1. 专用部件的制备与装置的构建
- 专用部件的制备
- 探针制备。如图2A左侧面板所示，将玻璃毛细管以一定角度夹持。将打火机火焰置于毛细管一端约2 cm处，并保持该位置直至该端弯曲90°，如图2A右侧面板所示。
- 样品平台制备。使用3D绘图软件设计一个尺寸为30 × 30 × 5 mm的平台，其上设有直径分别为2.0、2.5和3.0 mm的半球形凹槽，如图2B所示。
- 探针夹具制备。使用3D绘图软件设计一个用于固定毛细管探针的支架，并将其连接至显微操作器（见图2C）。
注：平台和探针夹具的3D设计文件（STL格式）可向通讯作者索取。 - 负透镜组件装配。如图1C和图1D所示，放置一个负柱面透镜（焦距-75 mm，高度和长度均约为50 mm），以校正向培养皿中添加液体所引起的图像畸变（从侧面观察时，液体的加入会导致解剖后眼球的视图发生扭曲）。
- 将负透镜粘附至其中一个双槽底座上（参见图2D中透镜在底座上的位置）。
- 按图2D所示组装其余部件。
- 调节支柱高度，使透镜略高于秤盘表面，并拧紧支柱支架上的螺丝。
- 装置的构建
- 在计算机上安装与秤配套的数据记录程序、显微镜相机软件以及电动千分尺控制器应用程序。
- 将电动千分尺连接至伺服电机控制器，再将后者连接至计算机。启动 电机控制器应用程序并编辑电机设置。
注：以下列出的电机参数是根据初步实验结果选定的，实验表明应力在10–20 s的时间尺度上发生松弛。基于此，我们选择了一个速度和加速度，使电机能在小于应力松弛时间但又不至于过短的时间内完成50 µm的位移，以避免对样品造成突然冲击 。此处选择的位移时间约为5–10 s。 - 将最大速度设为0.01 mm/s，加速度设为0.005 mm/s2。
- 将相机安装到检测显微镜上，并测试相机成像软件。
- 将秤放置在实验装置专用的台面区域。
- 将一个3D打印的平台（来自步骤1.1.2）粘附至一个培养皿上，并在其中一个凹槽中加入一颗2–3 mm的玻璃珠。将培养皿置于秤上，使玻璃珠位于秤盘中心附近。
- 将显微操作器上的手动千分尺更换为电动千分尺。
- 将两颗4-40螺丝旋入探针夹具中。按图1C所示将探针夹具连接至显微操作器。
- 按图2A所示制备探针，将其插入探针夹具中，使弯曲部分朝下，并拧紧螺丝。
- 将显微操作器放置在台面上，使探针尖端位于平台玻璃珠正上方。将显微操作器固定在台面上，以防止实验过程中发生意外移动。
- 将侧向显微镜放置在台面上，使玻璃珠位于其视场中心并处于清晰对焦状态。
2. 样品制备与数据采集
- 眼固定与解剖
- 维持野生型小鼠并 Magp1-null 动物置于相同的 C57/BL6J 背景下。通过 CO2 吸入
- 用精细镊子去除眼球，并将摘除的眼球在4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中于4 °C过夜固定。在固定过程中，眼内需维持15–20 mmHg的正压，具体操作如前所述。6.
注意：实验在雄性小鼠上进行，以控制可能存在的性别相关差异对眼球大小的影响。正压可确保眼球保持膨胀状态，从而维持晶状体与眼球壁之间由悬韧带纤维跨越的间隙。 - 用PBS冲洗眼睛10分钟。在体视显微镜下，使用眼科手术剪，在视神经乳头附近的巩膜壁上做一个全层切口。
- 向前剪至赤道部，然后沿眼球赤道周长环绕剪开。注意保护 delicate 的睫状突及其相关的悬韧带纤维。
- 移除眼球后部，暴露晶状体的后表面。
- 用镊子将解剖好的眼球从缓冲液中取出，置于干燥的一次性擦拭纸上，使角膜面朝下。轻轻拖动角膜在擦拭纸表面以吸干水分。
- 在培养皿中用于放置眼球的平台孔内各加入 3 µL 瞬干胶。
- 将培养皿放置在体视显微镜的载物台上，使含有胶水的孔位于视野范围内。
- 将眼睛从擦拭处转移到含有胶水的孔的边缘。然后，小心地将眼睛拖入孔中，并迅速调整其方向，使晶状体的背面朝上。
- 用干燥擦拭纸的边缘轻轻按压镜片暴露的一面，使其干燥。
- 在50 mm培养皿底部涂抹少量瞬干胶，将平台粘附于其上。
- 测量悬韧带的黏弹性响应
- 打开电子天平，启动天平数据记录程序和相机软件。确保数据记录程序能够持续采集数据30分钟，因为部分实验可能持续如此长时间。
- 打开伺服电机控制器，并在计算机上启动控制器应用程序。确保控制器已设置为使用与步骤1.2.2中注释所述相似的运动参数，以50 µm的步长移动。
- 按照步骤1.1.1所述，在毛细管棒上制作一个90°的弯折。
- 将弯曲的毛细管插入毛细管探头架中，并拧紧固定螺丝。
注意：为尽量减少样本脱水，建议在眼球解剖前或解剖过程中完成步骤1-4。 - 在毛细管尖端添加一小滴（约 1 mm）紫外光固化胶。
- 使用操纵器上的手动调节装置，移动毛细管探针的尖端，使其正对透镜中心。从正面（目视观察）和侧面（通过显微镜相机）观察，检查紫外胶的底部是否居中位于透镜顶部。
- 通过摄像头观察，降低探头尖端，直至紫外胶与透镜接触并覆盖其上表面的三分之一至二分之一。
- 使用低强度（约 1 mW）、方向性、近可见紫外光（380–400 nm）光源固化胶水。
注意：这些参数足以在数秒内固化胶水，同时最大限度地降低诱导蛋白质交联的风险。商用紫外胶笔所配备的紫外光源符合这些参数要求。 - 向培养皿中加入 PBS 溶液，直至液体完全覆盖眼球，深度至少为 2 mm。
- 将圆柱透镜置于检测显微镜前方，并尽可能靠近培养皿但不接触。
- 同时启动记录程序和计时器程序。使用相机拍摄眼/探头的照片。
- 60 秒后，再次施加 50 µm 的位移，此后每隔 60 秒重复一次，直至实验结束，即所有纤维均被断裂为止。需注意，由于实验过程中缓冲液蒸发，信号不会恢复至基线水平。在数据分析时校正由此引起的读数漂移，校正方法如步骤 2.2.14 所示。
- 运行结束后，保存标度记录数据，并将其导出为与电子表格兼容的格式（例如 .csv 格式）。保存运行期间采集的镜头图像。
- 将数据导入电子表格。利用第一次和最后一次的读数，通过插值法计算由于蒸发导致的背景读数随时间发生的变化（参见 图3）。从该读数中减去插值结果 每个时间点
注意：如果使用电子表格，可通过输入公式 = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT( 自动执行插值计算"B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2，输入到第一个量表读数右侧的单元格中，然后移动 将光标移至单元格的右下角，然后向下拖动至最后一个数据值。该公式假设数据按列排列，且第一个数据点位于单元格 B2。如有需要，可使用其中一位共同作者 Matthew Riley 博士开发的准弹性黏弹性模型对步骤 2.2.14 中处理的数据进行分析。4.
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结果
本文所述的上拉技术为测定小鼠悬韧带纤维的黏弹性特性提供了一种简便的方法。简而言之，首先在生理眼内压条件下向小鼠眼球内注射固定剂以保存眼球组织。该方法可维持眼球的自然膨胀状态，并使纤维保持适当的预张力（在初步实验表明该固定方法不会显著改变纤维的弹性或强度后，认为该方法是可接受的）。随后通过解剖去除小鼠眼球后部，以暴露晶状体及其悬韧带纤维。将眼球前部固定于一个平台上，并置于放置在电子天平上的培养皿内。接着，将连接至显微操作器的玻璃毛细管用胶粘附于晶状体后表面。然后以50 µm为增量逐步上提晶状体，同时记录天平上的受力变化。样品表观重量的减少可反映拉伸纤维所受的力。每次位移后均设置约1分钟的平衡期，以观察位移所诱导应力的任何松弛现象。最后，采用专为小鼠悬韧带纤维几何结构及本实验拉伸方向设计的准线性黏弹性模型对结果进行分析4。
使用本方法获得的典型粘弹性数据如图3所示。由于透镜上的抬升力使培养皿/平台/眼球组件在天平上的重量等量减少，曲线呈现倒置（负值）形态。每次透镜垂直位移50 µ...
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讨论
悬韧带是一种特殊的细胞外基质（ECM）系统，其纤维呈对称排列，可通过沿光轴移动晶状体实现对纤维的均一操控。该空间无需破坏细胞即可轻松进入，使得纤维能够在接近其天然状态的环境中被研究。拉起技术（pull-up technique）利用这种细胞外基质的呈现方式，对来自小鼠（一种遗传操作可行的模型系统）的精细纤维进行操控，并精确量化其力学特性。这使我们能够探究关键细胞外基质蛋白（本文报道的 fibrillin-118、LTBP-24 和 MAGP-1）对悬韧带纤维生物力学特性的影响。我们对 fibrillin-1 缺陷型小鼠的分析显示，缺乏 fibrillin-1 的悬韧带纤维随年龄增长而逐渐变弱，最终发生断裂，导致眼球内晶状体移位（在人类中称为晶状体异位）。值得注意的是，晶状体脱位也是马凡综合征患者中常见的临床表现，该疾病由 FBN1 基因突变引起20。因此，拉起实验为在小鼠中模拟人类结缔组织疾病的某些方面提供了可能。在缺乏 LTBP-2（一种被认为参与微原纤维形成的蛋白）的小鼠中...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 EY029130（S.B.）和P30 EY002687（S.B.）、R01 HL53325以及Ines Mandl研究基金会（R.P.M.）、马凡综合征基金会，以及防盲研究组织向华盛顿大学眼科与视觉科学系提供的无限制资助支持。J.R. 还获得了健康科学与药学大学为此项目提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/4-20 六角螺钉，长度 3/4 英寸 | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 螺母 | 五金商店 | ||
| 3D SLA 打印机 | Anycubic | Photon | |
| 4-40 螺钉，长度 3/8 英寸，2 个 | 五金商店 | ||
| 毛细管，外径 1.2 mm，长度 3 英寸，无灯丝 | WPI | 1B120-3 | |
| 氰基丙烯酸酯（瞬间）胶水 | Loctite | ||
| 精度为 0.01 g 的电子天平 | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | 电子表格软件 | |
| 气体打火机 | |||
| 检查/解剖显微镜 | Amscope | SKU: SM-4NTP | 工作距离约 15 cm |
| 经济型四轴显微操作器 | WPI | Kite-L | |
| 电动千分尺 | Thorlabs | Z812B | |
| 负柱面透镜 | Thorlabs | LK1431L1 | 焦距 -75 mm |
| 培养皿，50 mm | |||
| 支架夹持器，3 英寸 | Thorlabs | PH3 | |
| 支架，4 英寸 | Thorlabs | TR4 | |
| 天平数据记录软件 | Vernier | LoggePro | |
| 伺服电机控制器 | Thorlabs | KDC101 | |
| 伺服电机控制器软件 | Thorlabs | APT | |
| 带槽底座，1 个 | Thorlabs | BA1S | |
| 带槽底座，2 个 | Thorlabs | BA2 | |
| 显微操作器支架 | WPI | M-10 | |
| 用于显微镜的 USB 相机 | Amscope | SKU: MD500 | |
| 带紫外光源的紫外固化胶 | Amazon |
参考文献
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