测定带状纤维粘弹性的生物制备及机械技术

摘要

该协议描述了研究细胞外基质粘弹性及其对蛋白质组成或环境因素的依赖性的方法。目标基质系统是鼠标区域。通过比较野生型带状纤维与缺乏微纤维相关糖蛋白-1的粘弹性行为来证明该方法的性能。

摘要

弹性对于血管、肌肉和肺等组织的功能至关重要。这种性质主要来自细胞外基质（ECM），这是将细胞和组织结合在一起的蛋白质网状物。ECM网络的弹性特性如何与其组成相关，以及ECM的弛豫特性是否起生理作用，都是尚未完全解决的问题。部分挑战在于大多数 ECM 系统的复杂架构，以及在不影响其结构的情况下隔离 ECM 组件的困难。一个例外是区域，这是一种在脊椎动物眼中发现的ECM系统。该区域由数百至数千微米长的纤维组成，横跨晶状体和眼壁之间的无细胞空间。在本报告中，我们描述了一种机械技术，该技术利用区域的高度组织结构来量化其粘弹性并确定单个蛋白质组分的贡献。该方法涉及解剖固定的眼睛以暴露晶状体和区域，并采用引体向上技术，在监测其张力的同时均匀拉伸带状纤维。该技术相对便宜，但灵敏度足以检测缺乏特定区域蛋白或随着年龄的增长而产生的小鼠中区域纤维粘弹性特性的改变。虽然这里介绍的方法主要用于研究眼发育和疾病，但它也可以作为一个实验模型，用于探索有关弹性ECM的粘弹性性质以及外部因素（如离子浓度，温度和与信号分子的相互作用）的作用的更广泛问题。

引言

脊椎动物的眼睛包含一个活的光学晶状体，有助于将图像聚焦在视网膜上¹。透镜通过一组精密的径向光纤悬挂在光轴上，如图1A所示。在一端，纤维附着在晶状体赤道上，在另一端，附着在睫状体的表面上。它们的长度范围从小鼠的150μm到人类的1 mm。这些纤维统称为^Zinn2的带状体，睫状状体，或简称为状状带。眼外伤、疾病和某些遗传性疾病可影响区域纤维的完整性³，导致其最终衰竭并伴随视力丧失。在小鼠中，纤维的核心主要由蛋白质纤维菌素-2组成，周围是富含纤毛素-¹⁴的地幔。虽然区域纤维是眼睛独有的，但它们与身体其他部位发现的基于弹性蛋白的ECM纤维有许多相似之处。后者由纤毛素-1地幔⁵覆盖，并且具有与带状纤维相似的尺寸⁶。其他蛋白质，如潜伏转化生长因子β结合蛋白（LTBPs）和微纤维相关糖蛋白-1（MAGP-1），与两种类型的纤维有关^{7，8，9，10}

方案

所有动物实验均获得华盛顿大学动物研究委员会的批准，并遵守ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。

1. 专用零件的制造和设备的制造

1. 专用零件的制造
   1. 探头制造。以 图2A左面板所示的角度握住玻璃毛细管。从点烟器中取出一个火焰，从一端约2厘米处点燃，并保持在那里，直到末端弯曲90°，如图 2A的右面板所示。
   2. 示例平台制造。使用3D绘图软件，设计一个尺寸为30 x 30 x 5 mm的平台，其中包含直径为2.0，2.5和3.0 mm的半球形压痕，如图 2B所示。
   3. 探头支架制造。使用3D绘图软件，设计一个支架，用于固定毛细管探头并将其连接到显微操作器（见 图2C）。
      注:可根据通讯作者的要求，提供用于平台制造和探头支架制造的 STL 格式的示例 3D 文件。
   4. 负片镜头组件。如图1C和图1D所示，放置一个负圆柱透镜（焦距为-75 mm，高度和长度约为50 mm），以纠正因向培养皿中添加液....

结果

这里描述的引体向上技术为确定小鼠中带状纤维的粘弹性特性提供了一种直接的方法。简而言之，首先通过在生理眼内压下注射固定剂来保存小鼠眼睛。这种方法保持了眼睛的自然膨胀，并保持纤维适当的预张紧（在初步实验证明它不会显着改变纤维的弹性或强度后，固定被认为是可以接受的）。然后通过解剖去除小鼠眼睛的后部，以暴露晶状体和悬挂它的带状纤维。眼睛的前部固定在平台上，并放置在数字秤上的培养皿内。接下来，连接到显微操纵器的玻璃毛细管被粘合到晶状体的后表面。然后以50μm的增量升高透镜，同时记录刻度上的力。制剂表观重量的减少提供了有关拉伸纤维的力的信息。每次位移之后是持续约1分钟的平衡期，以观察位移引起的应力的任何松弛。最后，使用专为小鼠带状纤维的几何形状和用于测定的拉入方向设计的准线性粘弹性模型分析结果⁴。

使用我们的方法获得的典型粘弹性数据如图 3所示。曲线呈倒置（负），因为镜头上的提升力使秤上碟形/平台/眼睛组件的重量减少了等量。响应包括透镜50 μm垂直位移期间的每个瞬时力峰值，然后是寿命约.......

讨论

区域是一种不寻常的ECM系统，其中光纤对称排列，并且可以通过沿光轴置换眼镜片来相同地操纵。该空间也可以很容易地进入而不会破坏细胞，从而允许在接近其原始状态的环境中研究纤维。引体向上技术利用这种ECM演示来操纵来自小鼠的脆弱纤维，这是一个遗传上可处理的系统，并准确地量化其机械性能。这使我们能够检查关键ECM蛋白（原纤维化素-¹¹⁸，LTBP-24和此处报道的MAGP-1）对带状纤维的生物力学特性的贡献。我们对纤维蛋白-1缺陷小鼠的分析显示，缺乏纤维蛋白-1的带状纤维随着年龄的增长而减弱并最终破裂，导致眼睛内晶状体的位移（在人类中，这种情况称为异位lentis）。值得注意的是，晶状体脱位在马凡氏综合征患者中也很常见，马凡氏综合征是由FBN1基因²⁰突变引起的疾病。因此，引体向上测定为模拟小鼠中人类结缔组织病的各个方面提供了机会。在缺乏LTPB-2（一种被认为参与微原纤维发生的蛋白质）的小鼠中，我们能够证明在没有该蛋白质的情况下产生区域纤维，但在显着较低的应激下破裂并最终随着年龄的增.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1/4-20 个六角螺钉 3/4 英寸长	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 螺母	五金店
3D SLA 打印机	Anycubic	Photon
4-40 个螺丝 3/8 英寸长，2	五金店
毛细管，外径 1.2 毫米和 3 英寸长，无丝	WPI	1B120-3
氰基丙烯酸酯（超级）胶水	乐泰
数字秤 精确到 0.01 克	游标	奥豪斯 Scout 220
Excel	Microsoft		电子表格
燃气打火
检查/解剖显微镜	Amscope	SKU： SM-4NTP	工作距离 ~ 15 厘米
显微作器，经济型 4 轴	WPI	Kite-L
电动千分尺	Thorlabs	Z812B
负柱面透镜	Thorlabs		LK1431L1-75 mm 焦距
皿，50 mm
柱架，3 英寸	Thorlabs	PH3
柱，4 英寸	Thorlabs	TR4
比例记录软件	游标	LoggePro
伺服电机控制器	Thorlabs	KDC101
伺服电机控制器软件	Thorlabs	APT
开槽底座，1	Thorlabs	BA1S
开槽底座，2	个 Thorlabs	BA2
显微作支架	WPI	M-10
显微镜用 USB 相机	Amscope	SKU：MD500
UV 活性胶，带 UV 源	亚马逊