本方案描述了一种研究细胞外基质黏弹性及其对蛋白质组成或环境因素依赖性的方法。所针对的基质系统为小鼠睫状小带。通过比较野生型睫状小带纤维与缺乏微纤维相关糖蛋白-1的纤维的黏弹性行为，展示了该方法的应用效果。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
弹性对于血管、肌肉和肺等组织的功能至关重要。这种特性主要来源于细胞外基质（ECM），即连接细胞与组织的蛋白质网络结构。ECM网络的弹性特性如何与其组成相关，以及ECM的应力松弛特性是否具有生理学意义，这些问题尚未得到充分解答。部分挑战在于大多数ECM系统的复杂结构，以及在不破坏其结构的前提下难以分离ECM组分。一个例外是晶状体悬韧带（zonule），这是一种存在于脊椎动物眼球中的ECM系统。晶状体悬韧带由长度从数百至数千微米的纤维组成，跨越晶状体与眼球壁之间的无细胞间隙。在本报告中，我们描述了一种力学检测技术，该技术利用晶状体悬韧带高度有序的结构来量化其黏弹性特性，并确定各个蛋白质组分的贡献。该方法包括解剖固定的眼球以暴露晶状体和晶状体悬韧带，并采用一种“拉起”技术，在监测张力的同时均匀拉伸悬韧带纤维。该技术成本相对较低，但灵敏度足够高，能够检测缺乏特定悬韧带蛋白的小鼠或随年龄增长过程中悬韧带纤维黏弹性特性的改变。尽管本文所述方法主要用于研究眼部发育与疾病，但它也可作为实验模型，用于探索更广泛的问题，例如弹性ECM的黏弹性特性，以及离子浓度、温度和信号分子相互作用等外部因素所起的作用。
引言
脊椎动物的眼睛包含一个活的光学晶状体，有助于将图像聚焦在视网膜上1。晶状体通过一套精细的、呈放射状排列的纤维悬挂在光轴上，如图1A所示。这些纤维一端附着于晶状体赤道部，另一端附着于睫状体表面。其长度范围从小鼠的150 µm到人类的1 mm不等。这些纤维统称为Zinn小带（zonule of Zinn）2、睫状小带（ciliary zonule），或简称为小带（zonule）。眼部外伤、疾病以及某些遗传性疾病均可影响小带纤维的完整性3，最终导致纤维断裂并伴随视力丧失。在小鼠中，这些纤维的核心主要由纤维蛋白-2（fibrillin-2）构成，外围则被富含纤维蛋白-1（fibrillin-1）的鞘层包裹4。尽管小带纤维为眼部特有，但其与体内其他部位存在的以弹性蛋白（elastin）为基础的细胞外基质（ECM）纤维具有许多相似之处。后者同样被一层纤维蛋白-1（fibrillin-1）包裹5 ，且尺寸与 小带纤维相似6。其他一些蛋白质，如潜伏型转化生长因子β结合蛋白（latent-transforming growth factor β-binding proteins, LTB....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均经华盛顿大学动物研究委员会批准，并遵循眼科与视觉研究中动物使用 ARVO 声明。
1. 专用部件的制备与装置的构建
- 专用部件的制备
- 探针制备。如图2A左侧面板所示，将玻璃毛细管以一定角度夹持。将打火机火焰置于毛细管一端约2 cm处，并保持该位置直至该端弯曲90°，如图2A右侧面板所示。
- 样品平台制备。使用3D绘图软件设计一个尺寸为30 × 30 × 5 mm的平台，其上设有直径分别为2.0、2.5和3.0 mm的半球形凹槽，如图2B所示。
- 探针夹具制备。使用3D绘图软件设计一个用于固定毛细管探针的支架，并将其连接至显微操作器（见图2C）。
注：平台和探针夹具的3D设计文件（STL格式）可向通讯作者索取。 - 负透镜组件装配。如图1C和图1D所示，放置一个负柱面透镜（焦距-75 mm，高度和长度均约为50 mm），以校正向培养皿中添加液体所引起....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本文所述的上拉技术为测定小鼠悬韧带纤维的黏弹性特性提供了一种简便的方法。简而言之，首先在生理眼内压条件下向小鼠眼球内注射固定剂以保存眼球组织。该方法可维持眼球的自然膨胀状态，并使纤维保持适当的预张力（在初步实验表明该固定方法不会显著改变纤维的弹性或强度后，认为该方法是可接受的）。随后通过解剖去除小鼠眼球后部，以暴露晶状体及其悬韧带纤维。将眼球前部固定于一个平台上，并置于放置在电子天平上的培养皿内。接着，将连接至显微操作器的玻璃毛细管用胶粘附于晶状体后表面。然后以50 µm为增量逐步上提晶状体，同时记录天平上的受力变化。样品表观重量的减少可反映拉伸纤维所受的力。每次位移后均设置约1分钟的平衡期，以观察位移所诱导应力的任何松弛现象。最后，采用专为小鼠悬韧带纤维几何结构及本实验拉伸方向设计的准线性黏弹性模型对结果进行分析4。
使用本方法获得的典型粘弹性数据如图3所示。由于透镜上的抬升力使培养皿/平台/眼球组件在天平上的重量等量减少，曲线呈现倒置（负值）形态。每次透镜垂直位移50 µ.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
悬韧带是一种特殊的细胞外基质（ECM）系统，其纤维呈对称排列，可通过沿光轴移动晶状体实现对纤维的均一操控。该空间无需破坏细胞即可轻松进入，使得纤维能够在接近其天然状态的环境中被研究。拉起技术（pull-up technique）利用这种细胞外基质的呈现方式，对来自小鼠（一种遗传操作可行的模型系统）的精细纤维进行操控，并精确量化其力学特性。这使我们能够探究关键细胞外基质蛋白（本文报道的 fibrillin-118、LTBP-24 和 MAGP-1）对悬韧带纤维生物力学特性的影响。我们对 fibrillin-1 缺陷型小鼠的分析显示，缺乏 fibrillin-1 的悬韧带纤维随年龄增长而逐渐变弱，最终发生断裂，导致眼球内晶状体移位（在人类中称为晶状体异位）。值得注意的是，晶状体脱位也是马凡综合征患者中常见的临床表现，该疾病由 FBN1 基因突变引起20。因此，拉起实验为在小鼠中模拟人类结缔组织疾病的某些方面提供了可能。在缺乏 LTBP-2（一种被认为参与微原纤维形成的蛋白）的小鼠中.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 EY029130（S.B.）和P30 EY002687（S.B.）、R01 HL53325以及Ines Mandl研究基金会（R.P.M.）、马凡综合征基金会，以及防盲研究组织向华盛顿大学眼科与视觉科学系提供的无限制资助支持。J.R. 还获得了健康科学与药学大学为此项目提供的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/4-20 六角螺钉，长度 3/4 英寸 | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 螺母 | 五金商店 | ||
| 3D SLA 打印机 | Anycubic | Photon | |
| 4-40 螺钉，长度 3/8 英寸，2 个 | 五金商店 | ||
| 毛细管，外径 1.2 mm，长度 3 英寸，无灯丝 | WPI | 1B120-3 | |
| 氰基丙烯酸酯（瞬间）胶水 | Loctite | ||
| 精度为 0.01 g 的电子天平 | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | 电子表格软件 | |
| 气体打火机 | |||
| 检查/解剖显微镜 | Amscope | SKU: SM-4NTP | 工作距离约 15 cm |
| 经济型四轴显微操作器 | WPI | Kite-L | |
| 电动千分尺 | Thorlabs | Z812B | |
| 负柱面透镜 | Thorlabs | LK1431L1 | 焦距 -75 mm |
| 培养皿，50 mm | |||
| 支架夹持器，3 英寸 | Thorlabs | PH3 | |
| 支架，4 英寸 | Thorlabs | TR4 | |
| 天平数据记录软件 | Vernier | LoggePro | |
| 伺服电机控制器 | Thorlabs | KDC101 | |
| 伺服电机控制器软件 | Thorlabs | APT | |
| 带槽底座，1 个 | Thorlabs | BA1S | |
| 带槽底座，2 个 | Thorlabs | BA2 | |
| 显微操作器支架 | WPI | M-10 | |
| 用于显微镜的 USB 相机 | Amscope | SKU: MD500 | |
| 带紫外光源的紫外固化胶 | Amazon |
参考文献
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn's zonule. Progress i....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
