需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用母源性crispant确定母源性表达基因在早期发育中的作用

2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63177

⸱

2021年12月21日

 ,  , 
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

早期发育依赖于母源遗传的产物，而这些产物中许多的功能目前尚不清楚。本文描述了一种利用 CRISPR-Cas9 在单一代次内鉴定母源效应表型的实验方案。

摘要

早期发育依赖于在卵子发生过程中整合到成熟卵母细胞中的一组母源因子，这些因子在合子基因组激活之前执行发育所需的所有细胞功能。通常，对这些母源因子进行基因靶向需要额外的一代才能鉴定出母源效应表型，从而阻碍了确定母源表达基因在发育过程中作用的能力。CRISPR-Cas9 双等位基因编辑能力的发现使得能够在显微注射后的胚胎体细胞组织或“crispant”中筛选胚胎表型，增强了对合子表达基因在发育程序中作用的理解。本文描述了一种对 crispant 方法的扩展性实验方案。该方法通过生殖细胞的双等位基因编辑，可在单一代次中分离出母源效应表型，即“母源 crispant”。将多个向导 RNA 靶向同一目标可促进母源 crispant 的高效生成，而对母源 crispant 单倍体的序列分析则为验证产生母源效应表型的遗传损伤提供了简便方法。母源 crispant 的应用有助于快速鉴定关键的母源表达基因，从而促进对早期发育过程的理解。

引言

在胚胎的合子基因组激活之前，所有早期细胞过程都依赖于母源沉积产物（例如RNA、蛋白质和其他生物分子）的储备1。这些产物若在卵母细胞中过早耗尽，通常会导致胚胎致死。尽管这些基因在发育过程中具有重要性，目前许多母源表达基因的功能仍不清楚。斑马鱼基因编辑技术的进步，例如CRISPR-Cas9，使得靶向母源表达基因成为可能2,3,4。然而，与合子效应表型相比，鉴定母源效应表型需要额外的一代，因而消耗更多资源。近年来，CRISPR-Cas9的双等位基因编辑能力已被用于在显微注射后（F0代）胚胎的体细胞组织中筛选胚胎表型，这类个体被称为“crispants”5,6,7,8,9,10。crispant技术实现了在体细胞中对候选基因进行资源高效的筛选，有助于理解发育过程中的特定方面。本文所述的实验方案可在单一代次内鉴定母源效应表型，即“母源crispants”11。该策略通过将多个向导RNA靶向同一基因，促进生殖系中的双等位基因编辑事件来实现。这些母源crispant胚胎可通过明显的形态学表型进行识别，并可进行初步表征，例如细胞边界标记和DNA模式染色11。结合对可观察表型的分析与所诱导的插入缺失（INDELs）的基本分子表征，可预测靶基因在早期发育中的作用。

在斑马鱼中，受精后的前24小时（hpf）内，一小群细胞会发育为原始生殖细胞，即生殖系的前体12,13,14,15。由F0代雌鱼产下的卵中，所获得的母源crispant胚胎比例取决于靶基因发生双等位基因编辑事件的生殖细胞数量。通常情况下，编辑事件在胚胎中发生得越早，CRISPR-Cas9突变出现在生殖系中的概率就越高。大多数情况下，母源crispant胚胎的表型源于发育中卵母细胞内两个母源等位基因功能的丧失。当卵母细胞完成减数分裂时，其中一个母源等位基因通过极体被排出胚胎，而另一个等位基因则进入母源原核。对多个母源crispant单倍体进行测序，可反映出参与表型形成的生殖系中存在的突变混合情况（包括插入和/或缺失（INDELs））11。

以下方案描述了利用母源crispant方法在母源效应基因中创建CRISPR-Cas9突变并鉴定相应表型所需的步骤（图1）。第一部分将介绍如何高效设计和构建向导RNA，第二和第三部分则包含通过显微注射制备母源crispant的关键步骤。注射CRISPR-Cas9混合物后，通过PCR筛选注射后的胚胎是否存在体细胞编辑（第四部分）。当注射后的F0代胚胎发育至性成熟时，将F0代雌性个体与野生型雄性个体交配，并对其后代进行母源效应表型的筛选（第五部分）。第六部分介绍了制备母源crispant单倍体的方法，该单倍体可与Sanger测序结合，用于鉴定由CRISPR-Cas9诱导的插入缺失突变（INDELs）。此外，讨论部分包含了可对本方案进行的若干改进，以提高该方法的灵敏度和检测效能。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

在本方案开发相关的研究中，所有斑马鱼的饲养和实验均经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物照护与使用委员会（IACUC-M005268-R2）批准。

1. 向导RNA的合成

注意：已使用单个向导 RNA 或将多个向导 RNA 多重化至单一靶点来创建合子 crispant5,6,7,8,9,10。将多个向导 RNA 多重化可提高表现出合子 crispant 表型的胚胎比例10。由于表现出表型的胚胎频率更高，因此通过将四个向导 RNA 多重化至单个基因来创建母源性 crispant。有关使用 CHOPCHOP 设计向导 RNA 以及合成斑马鱼向导 RNA 的退火方法的更详细方案，可参见其他文献16,17,18,19,20。

  1. 为了鉴定待靶向的母源表达基因，可通过提供从受精卵到5天发育阶段转录组信息的RNA测序数据库，确定该基因在发育过程中的mRNA转录水平。21一般来说，母源特异性基因在早期胚胎中高表达，并在合子基因组激活后被降解22.
  2. 一旦确定了母源表达的靶基因，使用以下方法确定其首个预测的蛋白质结构域 "结构域与特征" Ensembl基因组浏览器上提供的区域23. 将此结构域作为四个向导RNA的靶向区域。
  3. 使用引导RNA筛选程序CHOPCHOP，在第一个活性结构域中鉴定四个引导RNA靶位点。针对每个靶位点，设计基因特异性寡核苷酸，如下所示。在基因特异性寡核苷酸中，N20 该片段对应于使用CHOPCHOP软件设计时去除PAM位点（NGG）后的目标序列。请使用标准脱盐纯化方法合成这些基因特异性寡核苷酸和通用寡核苷酸（参见 材料表).
    基因特异性寡核苷酸：
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
  4. 为每个基因特异性寡核苷酸创建向导RNA模板时，将其与恒定寡核苷酸退火，并如前所述使用T4 DNA聚合酶补平突出末端16. 四种引导RNA模板构建完成后，使用DNA纯化浓缩试剂盒，按照制造商说明书将它们一同纯化和浓缩（参见 材料表).
  5. 使用混合的引导RNA模板合成sgRNA混合物 体外 T7 转录试剂盒（参见 材料表）。执行 体外 根据制造商说明书进行转录。使用T7转录试剂盒的半反应体系可降低每次反应的成本。
  6. RNA合成后，使用乙醇/乙酸铵法对所得的sgRNA混合物进行纯化，具体步骤如前所述。16,20,24RNA 提取后，将其重悬于 20 µL 无核酸酶水。如果使用T7转录试剂盒的半量反应来转录sgRNA混合物，则将纯化的RNA重悬于10-15 µL 无核酸酶水。
  7. 使用分光光度计定量所制备的混合sgRNA的含量。用无核酸酶水将sgRNA混合物稀释至1500 ng/μL。µL ± 500 ng/µL通常，工作稀释液的最终体积范围为30-50 µL.
  8. 确定sgRNA混合物的浓度后，在1%琼脂糖凝胶上验证sgRNA的完整性。
    1. 制备1%琼脂糖凝胶/0.5 µg/mL 溴化乙锭/TBE 琼脂糖凝胶。待凝胶完全凝固后，将其放入 TBE 电泳缓冲液中。
    2. 混合 1 µL sgRNA 混合物的 1 µL RNA加样缓冲液（参见 材料表). 将该样品加入凝胶中，以 100 V 电压电泳 5 分钟。
  9. 使用紫外光（UV）观察条带。sgRNA 混合物应呈现为单一条带。若出现拖尾现象，则可能发生了 RNA 降解。
  10. 将sgRNA混合物储存于单次使用装 1 µL 在无核酸酶的 PCR 条状管中分装，并置于 -80 °C 冷冻柜。对于大量sgRNA混合物（30 µL 或更多时，将一半体积分装至无核酸酶的PCR条状管中，另一半以较大体积保存于无核酸酶的微量离心管中。根据需要解冻并分装。
  11. 为防止RNA降解，确保微量离心管中的样品冻融次数不超过两次。

2. 准备显微注射所需的试剂和材料

注意：在斑马鱼中，注射 Cas9 mRNA 可以产生合子 crisprants。然而，研究表明，Cas9 蛋白在注射胚胎中产生插入缺失（INDELs）的效率更高16,25。本方案使用 Cas9 蛋白来生成母源 crisprants，因为该蛋白的活性不会像注射的 Cas9 mRNA 那样存在延迟。理论上，这应能提高在发育早期发生双等位基因突变的概率，从而增加更大范围的生殖系受到影响的可能性。其他有关如何准备显微注射的方案和资源可参见 elsewhere24,26。

  1. 购买或制备 Cas9 蛋白（参见材料表）。用无核酸酶水重悬 Cas9 蛋白，配制成 2 mg/mL 的溶液，并将 1 µL 分装至无 RNase 的聚丙烯微量离心管中。将分装产物作为单次使用管保存于 -80 °C。
  2. 注射前一日下午，使用微量移液器拉制仪拉制玻璃毛细管，制备显微注射针。将未断裂的注射针存放于密闭的针头 holder 中，直至显微注射当日早晨使用。
  3. 制备注射板时，将 20 mL 1.5% 琼脂糖/无菌 H2O 倒入 100 mm × 15 mm 的培养皿中，填充至一半高度，静置使其凝固。琼脂糖凝固后，再加入 20 mL 1.5% 琼脂糖/无菌 H2O，并将塑料模具（参见材料表）放入液态琼脂糖中，待其完全硬化。
  4. 琼脂糖完全硬化后，移除塑料模具，将注射板倒置存放于冰箱中，直至注射当日早晨使用。只要孔穴结构保持完整，同一块注射板可用于多次注射操作。

3. 将 CRISPR-Cas9 混合物显微注射至单细胞斑马鱼胚胎以产生母源性 crispant

注意：有关斑马鱼胚胎显微注射的更多资源可参见其他文献24,26,27。将CRISPR-Cas9混合物注射至单细胞胚胎的发育中胚盘区域，可提高获得母源性crispant的几率。该混合物也可在胚胎发育至2细胞期前注射至卵黄囊内。然而，注射至卵黄中的混合物需依赖卵质流动到达胚盘区域，因此注射至卵黄的CRISPR-Cas9可能降低其切割效率28。

  1. 显微注射前一日下午，在斑马鱼交配盒中设置野生型杂交。将雄鱼和雌鱼置于同一水族箱中，但使用交配盒隔板将二者分隔，或将雌鱼放入产卵插槽内。
  2. 实验当天早晨，取出一份2 mg/mL的Cas9蛋白和一份sgRNA混合物。在含有Cas9蛋白的无RNase聚丙烯微量离心管中，配制以下反应体系 5 µL 包含sgRNA文库的注射混合物， 1 µL 0.5% 酚红溶液和无核酸酶水。目标终浓度为 400 ng/µL Cas9 蛋白和 200 ng/µL 将混合的sgRNA溶于无RN酶的水中，或按2:1的比例将Cas9蛋白与sgRNA混合用于胚胎注射。该注射混合物可在冰上保存，于注射当日上午使用。
  3. 从冰箱中取出一块注射板，置于室温（RT）下至少20分钟，使其升温至室温。
  4. 注射混合液制备完成后，让雄性和雌性交配，例如通过移除交配盒中的隔板，或根据需要将雄性放入与雌性相同的产卵垫中。
  5. 在鱼类产卵后但收集胚胎前，使用新的剃刀刀片或精细镊子剪断未破损的针尖，制备出内径足够小以避免损伤胚胎、但又足够宽以免被注射混合物堵塞的针头。针头制备完成后，使用插入毛细管后端的微量移液吸头将注射混合物装入针头中（参见 材料表).
  6. 针头充满后，在室温下孵育5分钟，以组装Cas9-sgRNA复合物。
  7. 打开显微注射仪，将注射针插入显微操作器。在微米尺载玻片上滴加一滴矿物油，通过调节注射压力校准注射针，直至针尖向矿物油中排出1 nL的液滴。
    注意：当将1 nL的液体注入矿物油中时，其液滴直径约为0.125 mm（或半径为0.062 mm），该数值使用微米尺测量得出。
  8. 为同步胚胎发育，使用塑料滤网在10分钟后收集胚胎，并用1x E3培养基（5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, pH 7.4）冲洗至培养皿中。2，0.33 mM MgSO₄4，并添加 20 µL 的 0.03 M 亚甲蓝溶于 1 L 1x E3 溶液中。取出 10–15 个胚胎，放入另一个培养皿中作为未注射对照组。
  9. 将剩余的发育中胚胎转移至注射板的孔中。
  10. 向单细胞胚胎的发育中胚盘注射1 nL溶液（共含400 pg Cas9蛋白和200 pg sgRNA）。若针尖堵塞，可用镊子折断针尖后重新校准，使针头能够推出1 nL的液滴。确保在受精后发育的前40分钟内完成所有胚胎的注射。
  11. 注射完成后，将已注射的胚胎放回含有1x E3培养基的标记培养皿中，使其在当天继续发育。根据斑马鱼发育分期系列，移除未受精或发育异常的胚胎。29.

4. 在F0代注射胚胎中筛选体细胞插入缺失突变（INDELs）

注意：在确定胚胎是否含有体细胞插入缺失突变（INDELs）时，可使用其他检测INDELs的方法，例如T7内切酶I检测法或高分辨率熔解曲线分析30。

  1. 注射后的第二天，从培养皿中移除异常和裂解的胚胎，并更换1x E3培养基，以维持胚胎的健康状态。
  2. 清理培养皿后，从未注射的培养皿中收集六个健康的已注射胚胎和两个对照胚胎。将每个胚胎单独放入PCR条状管的一个孔中，并在管盖上做好标记。
  3. 为提取单个胚胎的基因组DNA，先吸除条状管各孔中的多余E3培养基，然后每孔加入100 µL的50 mM NaOH。
  4. 将胚胎在95 °C孵育20分钟，随后将样品冷却至4 °C，加入10 µL的1 M Tris HCl（pH 7.5），并涡旋混匀5至10秒。提取的DNA可在-20 °C保存至少6个月，且不会发生显著降解。
  5. 为每个向导RNA靶位点设计特异性筛查引物，扩增一段包含CRISPR-Cas9靶位点的100–110 bp DNA片段。如有可能，应将靶位点置于扩增片段的中间位置，以便检测较大的缺失。
  6. 针对四个向导RNA靶位点中的每一个，使用5 µL已制备的单胚胎基因组DNA、PCR混合液以及靶位点特异的筛查引物，设置八个25 µL的PCR反应，以鉴定靶位点的体细胞突变（表1）。
  7. 使用可形成约0.625 cm宽加样孔的梳子，制备含2.5%琼脂糖、0.5 µg/mL溴化乙锭的TBE凝胶。这种宽孔梳子有助于更清晰地分辨基因组序列的大小变化。待凝胶凝固后，将其放入含有TBE电泳缓冲液的电泳槽中。
  8. 向PCR产物中加入5 µL的6x上样染料，取25 µL该混合物上样至凝胶孔中。确保注射组和对照组样品在同一排加样。所有样品加样完成后，在电泳槽正极端每1 L TBE运行缓冲液中加入5 µL溴化乙锭。
  9. 以120 V电压电泳，直至DNA条带分离清晰或接近泳道末端。若Cas9在靶位点产生了插入/缺失（INDELs），通常在注射样品中可观察到弥散条带，而对照样品中则无此现象。
  10. 若在注射了四种向导RNA的胚胎中，至少有三个靶位点出现弥散条带，则可继续培养同窝的其他注射胚胎。
  11. 若注射样品在所需数量的靶位点未出现弥散条带，则需重新设计向导RNA以替换无效的序列，并构建包含有效序列和新设计序列的新向导RNA混合物。按照上述方法重新注射并检测该混合物是否在体细胞中产生INDEL突变。

5. 母源性crispant胚胎中母源效应表型的鉴定

注意：当显微注射后的 F0 代雌性达到性成熟后，其生殖细胞有可能产生母源 crispr 编辑胚胎（maternal crispants）与野生型胚胎的混合后代。尽管这种混合后代可作为受精和发育时间的内部对照，但仍建议设置野生型个体间的交配作为外部对照，以防 F0 代雌性所产的整窝胚胎均为母源 crispr 编辑胚胎。

  1. 实验前一天下午，将注射后的F0代雌鱼与野生型雄鱼以及对照用的野生型杂交组合分别放入标准的斑马鱼交配盒中。将雄鱼和雌鱼置于同一水族箱内，但使用交配盒隔板将它们分开，或将雌鱼放入产卵插槽中。
  2. 实验当天早晨，通过移除交配盒隔板或将雄鱼放入与雌鱼相同的产卵插槽中，使雄鱼和雌鱼开始交配。
  3. 每10分钟收集一次胚胎，方法是将产卵插槽转移至含有新鲜系统水的新交配盒底部，并用标签标记该容器以标识对应的F0代雌鱼个体。取下旧的交配盒底部，将其中的水倒入茶筛中，以收集来自单个个体、10分钟内产出的一批胚胎。
  4. 当一批10分钟内产出的胚胎在茶筛中收集完毕后，将其转移至含有1x E3培养基的培养皿中。在培养皿上标注收集时间及对应的鱼类信息。
  5. 在体视显微镜下使用透射光源，于受精后的前6–8小时内每小时观察一次胚胎发育情况，随后5天内每天观察一次。
  6. 通过比较与同时间点野生型对照组相比出现的明显形态学变化，识别潜在的母源性crispant胚胎29。
  7. 将潜在的母源性crispant胚胎转移至含有1x E3培养基的培养皿中，在24小时后检测其形态学表型，并在受精后5天评估其存活情况（例如，是否出现 swim bladder inflation，即鳔充气）。

6. 母源性crispant单倍体中等位基因的测序

注意：母源crispant单倍体在靶向位点仅含有一个等位基因，因此可通过Sanger测序鉴定目标基因中的插入缺失（INDELs）。也可使用高通量测序方法分析母源crispant单倍体胚胎。表现出母源crispant表型的胚胎预计至少在四个靶位点之一存在基因损伤（见讨论部分）。

  1. 实验前一天下午，将已知可产生母源crispant胚胎的F0代雌鱼与野生型雄鱼配对交配。使用交配盒隔板将野生型雄鱼与雌鱼物理隔离，或将雌鱼置于产卵隔间中。
  2. 实验当天早晨，移除物理隔板或将雄性和雌性一同放入产卵隔间以启动交配。一旦观察到开始产卵，立即通过分离雄性和F0代雌性来中断交配。将每只分离后的F0代雌性单独置于各自的交配盒中。
  3. 使用每只野生型雄性个体的精巢制备紫外照射处理的精子溶液 100 µL Hank's 溶液的表 2)，足以使一只雌性个体排出的卵子受精，方法如前所述31.
  4. 从预先筛选的F0代雌性个体中手动挤出成熟卵子并进行操作 体外 体外受精（IVF）使用经紫外线处理的精子31.
  5. 之后 体外 受精后，让单倍体胚胎发育至观察到母源crispant表型，然后将这些胚胎转移至另一个培养皿中。
  6. 一旦鉴定出母源crispant单倍体胚胎，让其受精后至少发育6小时。
  7. 为了从至少十个母源性crispant单倍体胚胎中提取基因组DNA，将单个单倍体胚胎放入PCR条状管的单个孔中，吸除孔中多余的E3培养基，然后加入 50 µL 50 mM NaOH
  8. 将胚胎置于培养环境中孵育 95 °C 20分钟。然后将样品冷却至 4 °C，添加 5 µL 1 M Tris HCl (pH 7.5) 中，涡旋混匀 5–10 秒。提取的 DNA 可保存于 -20 °C 长达6个月。
  9. 为确定哪些向导位点含有插入缺失（INDELs），设计测序引物以扩增包含全部四个 CRISPR-Cas9 靶位点的 DNA 片段。这些测序引物可实现对跨越多个向导位点的 INDELs 进行鉴定。
  10. 设置两组 25 µL 每个胚胎的 PCR 反应数 5 µL 已制备的基因组DNA和测序引物。
  11. PCR 结束后，使用 DNA 纯化浓缩试剂盒对两个样本进行纯化和浓缩（参见 材料表然后使用正向和反向测序引物对DNA片段进行Sanger测序。
  12. 对单倍体母源crispant片段进行测序后，使用序列比对程序将其与野生型序列比对，并在靶位点处鉴定插入缺失突变（INDELs）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本方案中描述的实验方法能够快速、高效地鉴定母体效应表型（图1）。

生成母源性基因编辑个体：
在设计四种靶向单一候选母源效应基因的向导RNA时，需特别关注向导RNA与DNA结合的位置。通常，这些向导RNA应聚集在首个预测蛋白质结构域的起始位置，且彼此之间应尽量减少或避免重叠区域（图2A）。将向导RNA靶向该结构域可提高同框和非同框插入/缺失（INDELs）影响蛋白质功能的可能性。在设计向导RNA时还应考虑其他变量，如切割效率以及基因组中脱靶位点的数量。

注射CRISPR-Cas9溶液后，可通过在琼脂糖凝胶上扩增一段约100 bp的小片段PCR产物来检测Cas9的体细胞活性。如果在注射的胚胎中产生了插入缺失突变（INDELs），则在注射样本中应观察到弥散条带，而在未注射的对照样本中则不应出现（图2B）。每个向导R...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本论文所介绍的方案能够在单一代次内实现对母源效应表型的鉴定及初步分子表征，而传统的正向与反向遗传学技术通常需要多个世代才能完成。目前，许多母源表达基因的功能仍不清楚，这一知识空白部分原因在于鉴定母源效应基因时需要额外的一代才能观察到表型。过去，可通过将翻译阻断型吗啉代寡核苷酸注射到培养的卵母细胞中，以实现斑马鱼母源效应基因的快速鉴定32。该方法已成功模拟多个已知母源效应基因的表型，但操作未成熟卵母细胞是一项精细且耗时的实验过程。此外，也可利用CRISPR-RfxCas13d复合物靶向降解母源RNA，但将这些复合物注射到单细胞胚胎中无法靶向母源提供的蛋白质33。最近研究发现，CRISPR-Cas9可在生殖细胞系中诱导双等位基因突变，从而实现在单一代次内快速鉴定新的母源效应基因11。

本方案包含多个关键步骤，有助于获得母源性crispant胚胎。理论上，由于生殖细胞在早期胚胎发育阶段即已确定，因此在靶基因中越早产生DNA损伤，携带突变的细胞进入...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢Pelegri实验室过去和现任的动物饲养团队成员对水生设施的悉心管理。我们还感谢Ryan Trevena和Diane Hanson对本文手稿提出的宝贵意见和见解。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：GM065303，授予F.P.）

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M Tris-HCl (pH 8.4)Invirogen15568025用于PCR反应体系
1.5 mL Eppendorf管任何制造商
10 mM dNTPsThermo Fischer Scientific18427013gRNA 的合成
100 BP ladder任何制造商用于凝胶电泳
100% 无RNA酶乙醇任何制造商
100% 无RNA酶乙醇任何制造商
100 ml 烧杯任何制造商用于体外受精
5 M 醋酸铵Thermo Fischer ScientificMEGAshortscript T7 转录试剂盒中提供gRNA 的合成
70% 乙醇gRNA 的合成（70 mL 乙醇 + 30 mL 水）  无核酸酶水
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm IDFHC INC27-30-1用于显微注射
批量制药级碳酸氢钠 35 磅Bulk Reef Supply255鱼类供应
CaCl2MilliporeSigmaC7902
带有NLS的Cas9蛋白PNABioCP01
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
恒定寡核苷酸Integrated DNA Technologies (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression 玻璃平板Thermo Fischer Scientific13-748B用于体外受精
解剖镊DumontSS用于体外受精
解剖剪Fine Science Tools14091-09用于体外受精（IVF）
解剖显微镜（带透射光源）任何制造商用于体外受精
DNA纯化 & 浓缩仪 -5Zymo ResearchD4014gRNA 的合成
DNA上样缓冲液（6x）任何制造商用于凝胶电泳
EconoTaq DNA聚合酶Lucigen30032-1用于PCR反应体系
电泳电源任何制造商用于凝胶电泳
集合https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips 显微注射针尖，用于 Femtojet 显微注射仪Thermo Fischer ScientificE5242956003用于显微注射
乙醇（200 proof，无核酸酶）任何制造商
FemtoJet 4iEppendorf5252000021用于显微注射
鱼网任何制造商鱼类供应
冷冻卤虫虾卤虫直接法鱼类供应
通用型琼脂糖任何制造商用于凝胶电泳
基因特异性寡核苷酸Integrated DNA Technologies (IDT)TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
手套任何制造商
冰桶任何制造商
Instant Ocean盐任何制造商鱼类供应
Invitrogen UltraPure 溴化乙锭，10 mg/mLThermo Fischer Scientific15-585-011
KClMilliporeSigmaP5405
KH2PO4MilliporeSigma7778-77-0
KimwipesThermo Fischer Scientific06-666
雄性 & 雌性斑马鱼
MEGAshortscript T7 转录试剂盒Thermo Fischer ScientificAM1354gRNA 的合成
亚甲蓝赛默飞世尔科技AC414240250对于 E3
MgCl₂2MilliporeSigma7791-18-6用于PCR反应体系
MgSO₄2·7H2OMilliporeSigmaM2773
显微注射塑料模具World Precision InstrumentsZ-Molds用于显微注射
显微操作仪任何制造商用于显微注射
微量移液器任何制造商
显微注射针拉制仪SutterP-87用于显微注射
带滤芯的微量移液器吸头（所有规格）任何制造商
无滤芯微量移液器吸头（所有规格）任何制造商
微波任何制造商
矿物油MilliporeSigmam5904-5ml用于显微注射
MS-222（Tricaine-D）任何制造商FDA 批准
Na2HPO4MilliporeSigmaS3264
NaClMilliporeSigmaS5886
NaHCO₃3MilliporeSigmaS5761
Nanodrop任何制造商
NaOHMilliporeSigma567530
无粘附性、无RN酶微型离心管，1.5 mLAmbionAM12450gRNA 的合成
无核酸酶水任何制造商
纸巾任何制造商
Pastro 移液管任何制造商
PCR条状管任何制造商
直径100 mm的培养皿任何制造商
酚红溶液MilliporeSigmaP0290用于显微注射
塑料研钵VWR47747-358用于体外受精（IVF）
塑料勺任何制造商用于体外受精
优质级卤虫卵卤虫直接法细网筛
RNA凝胶上样染料见 MEGAshortscript T7 转录试剂盒用于凝胶电泳
RNAse AWAYThermo Fischer Scientific21-402-178
比例尺任何制造商
Sharpie任何制造商
 解剖刀任何制造商
无菌 H2O任何制造商用于PCR反应体系
T4 DNA 聚合酶NEBM0203gRNA 的合成
胶带任何制造商
TBE（Tris-硼酸-EDTA）10x任何制造商用于凝胶电泳
茶渍染色剂亚马逊IMU-71133W鱼类供应
赛默飞世尔科技 Owl 12 齿梳，1.0/1.5 mm 厚，双面，适用于 B2Thermo Fischer ScientificB2-12用于凝胶电泳
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini 胶电泳系统Thermo Fischer Scientific09-528-110B用于凝胶电泳
PCR仪任何制造商
PCR仪任何制造商
透射式光源成像仪任何制造商
紫外灯UVPModel XX-15（货号 UVP18006201）用于体外受精
紫外线防护眼镜任何制造商用于体外受精
洗瓶Thermo Fischer ScientificS39015鱼类供应
斑马鱼交配盒Aqua Schwarz产卵盒1鱼类供应
1.5 ml Eppendorf管Fisher Scientific05-402-11
10 摩尔 dNTPsThermo Fischer Scientific18427013
100 BP ladderThermo Fischer Scientific15628019
100% 无RNA酶乙醇任何标记物
5m 氯化铵醋酸盐Thermo Fischer Scientific
70% 乙醇70 ml 乙醇和 30 ml 无核酸酶水
水平凝胶电泳槽配件Fisher Scientific0.625 mm
琼脂糖任何标记物
CaCl₂Sigma10043-52-4
CaCl2，二水合物Sigma10035-04-8E3 培养基
毛细管管Cole-ParmerUX-03010-68用于注射针头
Cas9蛋白Thermo Fischer ScientificA36496
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
计算机任何标记物
解剖镊任何标记物
体视显微镜任何标记物
解剖剪任何标记物
DNA 纯化 & 浓缩仪 -5Zymo ResearchD4014
DNA凝胶上样缓冲液（6X）Thermo Fischer ScientificR0611
EconoTaq DNA聚合酶Lucigen30032-1
集合https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader 吸头Fischer Scientific1028965120 微升
乙醇（200 proof，无核酸酶）任何标记物
溴化乙锭Thermo Fischer Scientific15585011
鱼网任何标记物细网筛
冷冻卤虫虾LiveAquariaCD-12018鱼食
凝胶梳（0.625 mm）任何标记物
凝胶电泳系统任何标记物
基因特异性寡核苷酸Integrated DNA Technologies (IDT)
玻璃毛细针Grainger21TZ99https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
玻璃培养皿任何标记物
手套任何标记物
Hank's 最终工作液将 9.9 ml Hank's Premix 与 0.1 ml HS Stock #6 混合
Hank's Premix按以下顺序混合：(1) 10.0 ml HS #1，(2) 1.0 ml HS#2，(3) 1.0 ml HS#4，(4) 86 ml ddH2O，(5) 1.0 ml HS#5。所有HS溶液储存于4°C
汉克斯溶液
Hank's 溶液通过体外受精生产单倍体斑马鱼胚胎
Hank's 储存液 #18.0 g NaCl，0.4 g KCl 溶于 100 ml ddH2O
Hank's 储存液 #20.358 g 无水 Na2HPO4；0.60 g K2H2PO4 溶于 100 ml ddH2O
Hank's 储存液 #40.72 g CaCl2 溶于 50 ml ddH2O
Hank's 储存液 #51.23 g MgSO₄·7H₂O 溶于 50 ml ddH₂O
Hank's 储存液 #60.35 g NaHCO3 溶于 10.0 ml ddH2O 中；现配现用
HClSigma7647-01-0
冰桶任何标记物
Instant Ocean盐任何标记物用于养鱼用水
体外转录试剂盒 Mega Short ScriptThermo Fischer ScientificAM1354
Invitrogen™ UltraPure™ 无DNase/RNase蒸馏水Fisher Scientific10-977-023
KClSigma7447-40-7E3 培养基
KH2PO4Sigma7778-77-0
KimwipesFisher Scientific06-666
雄性和雌性斑马鱼
Mega Short Script T7 体外转录试剂盒Thermo Fischer ScientificAM1354
亚甲蓝Fisher ScientificAC414240250E3 培养基
MgSO₂·7H₂OSigmaM2773
显微操作仪
显微注射塑料模具World Precision InstrumentsZ-Molds
显微注射仪
微针载玻片
显微移液器（1-10）及吸头任何标记物需要过滤的 p10 吸头
微量移液器（20-200）及吸头任何标记物
显微移液器（100-1000）及吸头任何标记物
微塑料载玻片
微波任何标记物
MiliQ 水任何标记物
矿物油sigma-aldrichm5904-5ml
Na2HPO4Sigma
NaClSigmaS9888
NaHCO₂Sigma223441
Nanodrop
NaOHSigma567530
窄头刮刀任何标记物
拉针仪SutterP-97
纸巾任何标记物
Pastro 移液管Fisher Scientific13-678-20A
PCR引物（侧翼引导序列位点）Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR引物（侧翼位于gRNA切割位点）Integrated DNA Technologies (IDT)标准脱盐
PCR条状管Thermo Fischer ScientificAB0771W
培养皿Fisher ScientificFB087571410 cm 直径 100 mm × 15 mm
酚红Fisher ScienceS25464https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
移液器吸头任何标记物10 µl、200 µl 和 1000 µl 吸头
塑料研钵Fisher Scientific12-141-364
塑料勺任何标记物
引物设计指南Integrated DNA Technologies (IDT)
剃刀刀片UlineH-595B
RNA凝胶上样染料在Megashort Script试剂盒（体外转录试剂盒）中
RNA酶清除剂Fisher21-402-178
无RNase的聚丙烯微量离心管Thermo Fischer ScientificAM12400https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNase free waterFisher Scientific10-977-023
比例尺任何标记物
Sharpie任何标记物
碳酸氢钠（细胞培养测试）SigmaS5761鱼水
溴化钠溶液SigmaE1510
Sanger测序分析软件
分光光度计
无菌 H2O任何品牌
T4 DNA聚合酶NEBM0203Shttps://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
胶带任何品牌
TBE（Tris-硼酸-EDTA）10XThermo Fischer ScientificB52https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
茶渍亚马逊IMU-71133W大多数厨房用品店均有售
PCR仪
移液管优联S-24320
透射式光源成像仪
TricaineFisher ScientificNC0872873
Tris HCl 7.5Thermo Fischer Scientific15567027
通用引物Integrated DNA Technologies (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
紫外灯UVP
紫外线防护眼镜任何标记物
洗瓶Fisher ScientificS39015
斑马鱼交配盒任何标记物
PCR缓冲液配方加入171.12 mL无菌H2O；0.393 mL 1 M MgCl2；2.616 mL 1 M MgCl2；2.618 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.4）；13.092 mL 1 M KCl；0.262 mL 1%明胶。121℃高压灭菌20分钟，然后将溶液置于冰上冷却。随后加入3.468 mL 100 mg/mL BSA；0.262 mL dATP（100 mM）；0.262 mL dCTP（100 mM）；0.262 mL dGTP（100 mM）；  0.262 mL dTTP (100mL)。分装至无菌离心管中

参考文献

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860(2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319(2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

母源效应基因CRISPR-Cas9 编辑向导RNA多重编辑斑马鱼胚胎发生体细胞突变桑格测序单倍体胚胎母源效应表型
利用母源性crispant确定母源性表达基因在早期发育中的作用
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。