通过布雷菲德林A注射鉴定肾脏分泌蛋白的来源

摘要

确定分泌细胞因子的细胞类型对于理解肾脏疾病的病理生物学机制至关重要。本文介绍一种利用分泌抑制剂布雷菲德菌素A（brefeldin A）和细胞类型特异性标记物，对肾上皮细胞或间质细胞产生的细胞因子进行定量染色的方法。

摘要

慢性肾病（CKD）是美国十大主要死因之一。急性肾损伤（AKI）虽然通常可恢复，但会增加患者日后发展为CKD的风险。肾小管上皮细胞已被确认为AKI和CKD过程中关键的信号枢纽，这些细胞可通过分泌细胞因子及其他蛋白质来决定疾病的进展方向。尤其是在CKD中，多条证据表明，适应不良性修复的肾小管细胞通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）、结缔组织生长因子（CTGF）及其他促纤维化细胞因子，驱动疾病的进展。然而，识别不同细胞类型中分泌蛋白的来源及其相对数量 体内 仍然具有挑战性。

本文介绍了一种利用布雷菲德菌素A（Brefeldin A, BFA）阻止细胞因子分泌的技术，从而能够使用标准免疫荧光方法对肾脏组织中的细胞因子进行染色。BFA可抑制内质网（ER）向高尔基体的转运过程，而该过程是细胞因子及其他蛋白质分泌所必需的。在急性肾损伤（AKI）的顺铂小鼠模型中，于处死前6小时注射BFA，可导致转化生长因子-β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）和结缔组织生长因子（CTGF）在近端小管细胞（PTCs）内积聚；在慢性肾病（CKD）的马兜铃酸（AA）小鼠模型中，则可观察到TGF-β在 近端小管细胞内的积聚。分析结果显示，与单独使用BFA+生理盐水、顺铂或AA相比，BFA+顺铂或BFA+AA处理组中TGF-β阳性信号显著增强。这些数据表明，BFA可用于鉴定产生特定细胞因子的细胞类型，并量化其所产生细胞因子的相对含量和/或不同类型。

引言

据估计，全球有>10%的人口患有某种形式的肾脏疾病¹。急性肾损伤（AKI）以发病迅速为特征，大多可治愈；然而，一次AKI发作可能使患者在日后发展为慢性肾病（CKD）^2,3。与AKI不同，CKD的特点是进行性纤维化和肾功能持续恶化，最终导致需要肾脏替代治疗的终末期肾病。大多数肾脏损伤均以构成肾单位的特化上皮细胞（如足细胞或近端小管细胞）为靶点^4,5。损伤发生后，存活的上皮细胞通过分泌细胞因子和其他蛋白质，协助协调修复反应。通过这种方式，存活细胞可调节免疫反应、引导细胞外基质重塑，并促进器官恢复。

细胞因子是一类小分子分泌蛋白，对多细胞生物体的成熟、生长及应答能力具有重要的调节作用^6,7。它们作为不同类型细胞之间的信号信使发挥作用，包括免疫细胞和上皮细胞⁸。尽管传统认为细胞因子主要由免疫细胞分泌，但长期研究表明，肾脏上皮细胞和间质细胞也能分泌细胞因子，作为对其他肾脏常驻细胞（如小管细胞、间质细胞和免疫细胞）的信号分子^9,10。其中，近端小管细胞（PTCs）在急性肾损伤（AKI）后的启动修复和恢复阶段发挥着重要作用¹¹。然而，已知异常修复的PTCs会分泌促纤维化细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、血小板源性生长因子-D（PDGF-D）和结缔组织生长因子（CTGF），从而促进慢性肾脏病（CKD）的进展¹²。因此，肾脏上皮细胞通过分泌细胞因子来调节肾脏损伤过程。

尽管已知肾上皮细胞能够分泌细胞因子，但由于研究分泌蛋白存在技术难题，每种细胞类型的具体来源及其相对贡献仍难以确定¹³。流式细胞术是检测细胞因子的常用方法，但在受损肾脏尤其是高度纤维化的肾脏中实施该技术具有挑战性。利用细胞因子启动子驱动Cre重组酶的细胞因子报告小鼠常被用于鉴定表达特定细胞因子的细胞类型。然而，报告小鼠的应用受到多种限制，包括需要将报告小鼠与不同的基因敲除背景小鼠进行杂交、缺乏合适的报告系统，以及每次只能分析一种细胞因子。因此，有必要开发一种简单、通用且经济的技术，用于检测释放细胞因子的肾细胞。

我们假设，注射BFA（一种通过阻断内质网-高尔基体运输来抑制分泌的抑制剂） 体内 可实现对肾脏组织中分泌蛋白的染色（图1A，B如基于流式细胞术的检测所示^14,15结合细胞类型特异性标记物，该技术可用于鉴定损伤肾脏中产生细胞因子的细胞来源及其相对贡献。与流式细胞术样本不同，固定组织可长期保存蛋白质和细胞结构，从而更深入地研究分泌细胞。为验证这一假设，采用急性肾损伤模型（顺铂）和慢性肾病模型（马兜铃酸肾病（AAN））诱导小鼠肾脏损伤，注射布雷菲德菌素A（BFA），并使用标准免疫荧光技术进行染色。

方案

所有动物实验均按照范德比尔特大学医学中心机构动物护理与使用委员会批准的动物使用方案进行。

1. 动物

1. 使用8至12周龄的雄性BALB/c小鼠（体重：约25 g）建立顺铂或马兜铃酸诱导的肾病模型。
2. 确保小鼠健康，无明显痛苦迹象，且无打斗造成的伤口。
   注意：伤口，尤其是尾部伤口，可能干扰本方案的操作。选择BALB/c小鼠的原因是其尾静脉更易于观察，便于注射。本方案适用于其他小鼠品系，但不同品系间顺铂或马兜铃酸的给药剂量可能有所不同。

2. 顺铂注射

1. 将顺铂溶解于无菌生理盐水中，配制成终浓度为 1 mg/mL 的溶液。
   注意：顺铂在室温下不会完全溶解，应在通风橱中操作。
2. 将顺铂溶液置于 37 °C 水浴中加热，并反复涡旋振荡，直至顺铂完全溶解。
3. 称量小鼠体重，并计算每只小鼠按 20 mg/kg 体重（bw）所需注射的顺铂溶液体积。
4. 使用聚维酮碘（7.5%）和乙醇（70%）棉签交替擦拭腹部皮肤进行消毒，每种棉签各擦拭 3 次。
5. 使用带 25 G 针头的胰岛素注射器，将顺铂溶液进行腹腔注射。
6. 注射后第 3 天进入第 4 部分操作。

3. 马兜铃酸（AA）注射

1. 将马兜铃酸-I 溶解于磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，终浓度为 0.5 mg/mL。
   注意：马兜铃酸应在通风橱中操作。应使用马兜铃酸-I，因其是导致肾脏损伤的主要形式。
2. 将马兜铃酸溶液在 37 °C 水浴中预热，并反复涡旋至完全溶解。
3. 称量小鼠体重，并计算每千克体重注射 5 mg 的马兜铃酸溶液所需体积。
4. 使用聚维酮碘（7.5%）和酒精（70%）棉签对腹部皮肤消毒 3 次。
5. 使用带有 25 G 针头的胰岛素注射器，将马兜铃酸溶液腹腔注射。
6. 每隔一天注射一次马兜铃酸，共注射 3 次。
7. 末次注射后第 42 天，进入第 4 节操作。

4. BFA 溶液的配制

1. 将BFA溶解于二甲基亚砜中，配制成10 mg/mL的储存液。
2. 将储存液于-20 °C保存。
3. 用无菌PBS将BFA储存液稀释至终工作浓度为1.25 mg/mL
   ​注意：每次注射前应立即新鲜配制工作液。

5. BFA 尾静脉注射

1. 注射前，将笼子一半放在37 °C 的加热垫上，一半悬空，持续10分钟，以确保小鼠体温升高，防止体温下降导致尾部血管收缩，从而影响注射效果。
   注意：将笼子放置在加热垫上时，应使笼子一半在加热垫上，另一半不在。这样当小鼠感到过热时，可自行移动到笼子的另一侧，反之亦然。 使用温控装置调节的 37 °C加热垫是必要的，以避免造成热灼伤。
2. 使用市售的合适尺寸的固定装置固定小鼠。
3. 用聚维酮碘和酒精棉片对尾部进行三次消毒，方法如上所述。
4. 水平握住尾部，观察侧尾静脉（图1C）。
   注意： 使用市售的带有内置低温LED光源的尾静脉注射平台有助于更方便地定位尾静脉。也可使用其他光源，但需注意避免热灼伤。
5. 插入28 G针头，使针头和注射器保持与静脉平行，并朝向头部方向推进。
6. 注射200 µL的1.25 mg/mL BFA溶液（含0.25 mg BFA）。观察静脉逐渐变透明，血液被注射液取代，表明注射成功。
7. 拔出针头，并轻轻按压尾部直至出血停止。
8. 将小鼠放回笼中，并观察其是否有持续出血或其他不适症状。

6. 处死动物并收获肾脏

1. 注射布雷菲德菌素A（BFA）6小时后，使用过量异氟烷（5%异氟烷置于钟形罩内）对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位以确保死亡。
   注意：选择6小时时间点是基于文献报道，其他器官经6小时BFA处理后，细胞内细胞因子已有足够积累，可通过免疫荧光染色进行可视化检测¹⁶。
2. 处死后立即通过腹正中切口暴露小鼠腹部。
3. 用镊子夹住胸骨以暴露心脏。使用剪刀从胸骨左右两侧剪开肋骨。操作时需小心避免划伤心脏或主要血管。剪开心包组织，使心脏脱离胸壁。 
4. 通过心脏穿刺采集100–500 µL血液用于血尿素氮（BUN）检测。使用25 G针头连接1 mL胰岛素注射器采集血液。为防止凝血，每份样本中加入5 µL肝素溶液（100 mg溶于15 mL dH₂O）。
   注意：BUN检测至少需要20 μL血液；然而，安乐死后通过心脏穿刺最多可采集约500 μL 血液，可用于其他检测。应尽可能采集更多血液。
5. 将血液样本置于冰上保存，直至按下方第7节操作采集肾脏。
   1. 以1,300 × g离心10分钟。
   2. 轻柔分离血浆，并于-20 °C保存，待进行下方第17节BUN检测。或者，可将血浆样本保存用于肌酐检测。

7. 灌注并摘除肾脏

1. 使用20 mL注射器以2–4 mL/min的流速经左心室向小鼠灌注10–20 mL磷酸盐缓冲液（PBS），直至灌注液变澄清。
2. 用镊子夹住靠近乳头部位的肾动脉和肾静脉，于远离肾脏的一侧剪断血管，取出肾脏。
3. 用手或精细无菌镊子轻轻剥离并去除肾包膜。
4. 根据所用抗体的不同，继续进行第8节以制备固定石蜡包埋组织，或进行第10节以制备固定冷冻组织。
   ​注意：组织处理步骤需针对每种用于染色的抗体进行优化。

8. 用于TGF-β和PDGF-D染色的石蜡包埋组织

1. 将肾脏置于洁净的载玻片上，用新的剃须刀片水平横向切开，一分为二。取其中一半放入含有10 mL 4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中，在10 rpm转速的翻转摇床上固定24小时。
   注意：切片无需使用整个肾脏。另一半肾脏可保存或用于其他检测。
2. 用70%乙醇替换PFA溶液。
3. 此时将肾脏半块 送至实验平台进行组织处理及石蜡包埋，随后使用切片机将石蜡包埋的肾脏组织切成4–6 µm厚的切片，并贴附于预先清洁并带电荷的载玻片上^17,18。
   ​注意：肾脏组织由范德堡大学医学中心转化病理学共享资源平台进行处理和石蜡包埋，并在室温下保存。

9. 脱蜡与复水

1. 将载玻片放入染色架中，并浸入含有D-柠檬烯的染色缸中5分钟，确保组织完全浸没。再用另一缸新鲜的D-柠檬烯重复此步骤。
2. 通过将载玻片依次浸入100%（两次）、95%、90%和70%的乙醇梯度溶液中进行再水化，每次5分钟。
3. 用流动的dH₂O冲洗载玻片5分钟。
4. 将切片置于柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，在压力锅内121 °C、15 psi条件下孵育45分钟，进行抗原修复。
5. 用流动的dH₂O冲洗载玻片20分钟。
6. 继续进行第12节操作。

10. 结缔组织生长因子染色用冷冻组织的制备

1. 使用新的剃须刀片沿水平轴将肾脏切成两半。
   注意：切片无需使用整个肾脏。其中一半可用于储存或其他检测。
2. 将半侧肾脏放入含有10 mL 0.5% 多聚甲醛（PFA）的15 mL离心管中，于4 °C、10 rpm转速下在旋转仪上固定2小时。
3. 倾去PFA溶液至专用废液容器中进行妥善处理，加入10 mL含0.1 M甘氨酸的PBS溶液，于4 °C、10 rpm转速下旋转1小时。
4. 倾去甘氨酸溶液，加入10 mL用PBS溶解的15%蔗糖溶液，将离心管置于旋转仪上，于4 °C、10 rpm转速下过夜。
5. 倾去15%蔗糖溶液，更换为10 mL用PBS溶解的30%蔗糖溶液，于4 °C、10 rpm转速下处理1小时。
6. 在包埋模具中加入适量最佳切割温度化合物（OCT），并将第10.5步中的半侧肾脏组织放入模具中，使肾脏的切面朝下。
7. 将含有半侧肾脏和OCT的模具小心地浸入液氮中进行冷冻。
   注意：避免液氮直接接触OCT，以免产生气泡。使用液氮时必须佩戴适当的个人防护装备，如护目镜/面罩、低温手套和实验服。建议使用长约25 cm的长柄镊子将模具放入液氮中。
8. 待组织完全冻结后，将模具储存于-80 °C环境中。

11. 冷冻切片

1. 确保冷冻切片机温度为 -20 °C。
2. 将含有标本的OCT包埋模具置于冷冻切片机中，在 -20 °C 下保存 2 小时，以平衡温度。
3. 握住模具边缘的标签，从底部按压，取出模具。
4. 在样品头表面添加新鲜OCT，并将冷冻的组织块放置其上，确保组织面背离样品头。
5. 将样品头及组织块放置于冷冻台面上。
6. 在组织块上方放置带重物的散热块，以压平组织表面。不使用时应保持冷冻切片机盖子关闭，防止温度波动。
7. 待组织块与样品头之间的新鲜OCT完全冻结后，检查连接是否牢固。
8. 将样品头夹紧固定于冷冻切片机的切片装置上。
9. 开始切片，直至在组织块中可见组织。
10. 以 4–6 μm 厚度对肾组织进行切片，并将切片转移至室温预处理的带电荷载玻片上¹⁹。
11. 切片转移完成后，将载玻片储存于 -20 °C 至 -80 °C 环境中，直至染色前。在准备染色前不得使其解冻。
12. 染色前，从储存处取出载玻片，使其恢复至室温。切勿让切片干燥。
13. 待载玻片达到室温后，立即在室温下用PBS洗涤切片两次，每次5分钟，以去除OCT包埋剂。
14. 继续进行第12节操作。

12. 免疫荧光染色

1. 使用疏水屏障记号笔勾画组织切片的轮廓。组织与疏水屏障轮廓之间应保持至少 5 mm 的距离。
2. 在切片上加入 50 μL 封闭缓冲液（含 3% 驴血清、0.1% Triton 的 1% 牛血清白蛋白/Tris 缓冲盐水（TBS）），于湿盒中室温孵育 1 小时。
3. 用 PBS 将一抗稀释至适当浓度。检测细胞因子时，使用 50 μL 针对 TGF-β1（1:200）、PDGF-D（1:400）和 CTGF（1:200）的一抗溶液。标记肌成纤维细胞时，使用 50 μL 与 Cy3 偶联的抗 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗溶液（1:200）。
4. 去除封闭液，将一抗加至切片上，确保液体不溢出圆形疏水轮廓，于 4 °C 湿盒中孵育过夜。若发生泄漏，需重新涂抹疏水屏障。
5. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
6. 用 PBS 将相应的二抗稀释至 1:200。
7. 在湿盒中加入 50 μL 二抗溶液，室温孵育 1 小时。
8. 用 PBS 洗涤 5 分钟。
9. 用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 将与荧光素偶联的莲藕四棱豆凝集素（LTL）稀释至 10 μg/mL。
   注意：Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 对 LTL 结合是必需的。
10. 在湿盒中加入 50 μL LTL 溶液，室温孵育 30 分钟。
11. 用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 洗涤 5 分钟。
12. 加入 50 μL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，5 μg/mL 水溶液）染色 DNA/细胞核，室温孵育 5 分钟。
13. 在组织上滴加 20 μL 抗荧光淬灭封片剂，缓慢盖上盖玻片。封片剂需静置 24 小时使其完全固化后再进行成像。
    注意：凝集素结合信号可能随时间降解，导致信号减弱。建议在封片剂固化后尽快对凝集素染色样本进行成像。若观察到信号减弱，可在封片剂中添加 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 以维持染色效果。

13. 图像采集

1. 打开配备自动XY载物台的倒置显微镜（参见材料表）。
2. 选择20倍物镜。
3. 启动图像采集软件（参见材料表）。
4. 点击实时成像以打开实时预览窗口。
5. 找到组织切片，并确保其处于聚焦状态。
6. 点击采集菜单，然后选择扫描大图。
7. 在扫描大图窗口中，使用操纵杆将载物台移至组织切片最左侧，点击左箭头；依次对最上侧、最右侧和最下侧的组织区域重复此操作，以设定扫描范围。
8. 点击采集菜单。
9. 确保大图选项的复选框已勾选。
   1. 若需采集多通道图像，请点击光谱选项卡。
   2. 依次点击每个通道，并设置曝光时间，使染色信号清晰可见，且图像任何区域均未饱和。
      注意：同一实验组内的设置必须保持一致。不同样本间更改采集参数将导致结果不准确。
   3. 对每个待采集的通道重复步骤9.2。
10. 点击扫描。

14. 图像分析

1. 打开图像采集软件。
2. 点击 文件 | 打开，并选择图像。
3. 在图像窗口上单击右键，选择多边形感兴趣区域（ROI）。
4. 使用手绘工具勾画ROI轮廓，圈选LTL阳性小管细胞或α-SMA阳性间质细胞。
5. 点击测量 选项卡 | 阈值。
6. 通过调节滑块，设置阈值的上限和下限，使其位于阳性信号区域的两侧。
7. 点击ROI选项卡。
8. 点击导出图标以保存数值。使用电子表格软件计算阳性信号面积/ROI面积的百分比。

15. 替代方法：使用免费软件（ImageJ）进行图像分析

1. 打开 ImageJ。
2. 点击 文件 | 打开 以查看图像。
3. 点击 自由选择 工具。
4. 使用 自由绘制 工具勾画出 感兴趣区域（ROI），圈选 LTL 阳性小管细胞或 α-SMA 阳性间质细胞。
5. 点击 编辑 菜单，选择 清除外部。
6. 点击 分析，选择 测量，以确定 ROI 的面积。
7. 进入 图像 | 颜色 | 拆分通道。
8. 调整阈值的上限和下限，以检测阳性信号区域。
9. 点击 分析，选择 测量。
10. 保存数据。
11. 使用电子表格软件打开数据，并计算阳性信号区域与 ROI 面积的比值。

16. 可选：使用激光扫描共聚焦显微镜成像

注意：为了获得更高分辨率的图像以用于发表，扫描共聚焦显微镜可提供更清晰的肾脏组织图像并降低背景信号。

1. 打开激光扫描共聚焦显微镜（参见材料表）。
2. 选择40倍物镜 （参见材料表）。
3. 点击定位选项卡，并通过调节焦距找到组织。
4. 进入采集选项卡，点击通道，并在针孔设置中选择1 AU。
5. 调节每个通道的激光增益强度，使阳性信号可见但不饱和。确保同一批实验样品的设置保持一致。
6. 点击拍摄并以所需格式保存图像。

17. 血浆尿素氮水平

1. 从 -20 °C 取出样品，并在冰上解冻。
2. 用 dH₂O 按 1:10 的比例稀释血浆。
3. 对于每个样品，在 96 孔板中设置三个独立的重复反应。
   1. 对于样品加标准品孔，加入 5 µL 的 200 mg/dL 尿素和 20 µL 稀释后的血浆。
   2. 对于仅样品孔，加入 5 µL dH₂O 和 20 µL 稀释后的血浆。
   3. 对于样品空白孔，加入 5 µL dH₂O 和 20 µL 稀释后的血浆。
4. 每份样品将 85 µL 试剂与 1 µL 脲酶混合，以配制工作液。
5. 向“样品加标准品”和“仅样品”孔中各加入 80 µL 工作液。
6. 向上述第 17.3 步中的“样品空白”孔加入 80 µL 试剂（不含脲酶）。
7. 轻轻敲击酶标板以混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
8. 使用酶标仪读取 OD₅₆₀ 值。
9. 根据公式（1）计算尿素浓度，并使用公式（2）将其转换为 BUN。
   Urea (mg/dL) = (仅样品 − 样品空白)/(标准品 − 仅样品) × (标准品/4) × (稀释倍数) （1）
   BUN (mg/dL) = 尿素浓度 / 2.14 （2）
   注：本检测测定的是血清中尿素（分子量：60）的含量；然而，BUN 仅指尿素中的氮含量（分子量：28）。因此，需使用校正系数 2.14（60/28）将尿素浓度转换为 BUN。

结果

为了研究肾小管上皮细胞在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）后产生细胞因子的作用，以20 mg/kg的浓度注射顺铂，并在注射顺铂后的第3天静脉注射0.25 mg布雷菲德菌素A（BFA）。6小时后处死动物并获取肾脏组织。将石蜡包埋的肾脏组织切片，并使用TGF-β、PDGF-D和CTGF进行染色，这三种细胞因子是AKI中参与组织修复的代表性因子。如图2A所示，在顺铂处理且存在BFA的情况下，用LTL标记的近端小管细胞（PTCs）中可见TGF-β⁺囊泡。而在未受损肾脏或未使用BFA处理的肾脏中，则未观察到TGF-β⁺囊泡。

定量分析显示，在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）中，经BFA处理后TGF-β1⁺区域面积增加（图2B）。与TGF-β类似，在顺铂诱导的AKI中，PDGF-D⁺或CTGF⁺囊泡在BFA处理后也出现积聚（图2C<...

讨论

已知肾小管上皮细胞通过分泌TGF-β、TNF-α、CTGF、PDGF、血管内皮生长因子以及许多其他蛋白质来调控急性肾损伤和慢性肾病^20,21,22,23同样，肾小球、远端小管及其他肾脏上皮细胞，以及间质细胞，在损伤过程中会分泌这些和/或其他蛋白质^24,25,26这些细胞类型在细胞因子分泌中的相对贡献难以阐明，因为细胞因子在产生后会迅速被分泌。尽管如此 原位 杂交及其他RNA染色技术可用于标记分泌蛋白的RNA，但这些技术难以与细胞类型特异性标志物或损伤标志物的染色相结合。相比之下，许多研究采用联合方法 体内 研究结果与 体外 在培养的肾细胞中进行的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 胰岛素注射器	BD	329654
10 mL 注射器	BD	302995
2 mL 离心管	Fisher brand	05-408-138
20 mL 注射器	BD	302830
25 G 针头	BD	305125
28 G 针头	BD	329424
96 孔板	Corning	9017
马兜铃酸-I	Sigma-Aldrich	A9461
α-SMA 抗体（与 Cy3 偶联）	Sigma-Aldrich	C6198	RRID:AB_476856
冷冻切片机刀片	C.L. Sturkey. Inc	DT315R50
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
布雷菲德菌素 A	Sigma-Aldrich	B6542
顺铂	Sigma-Aldrich	P4394
柠檬酸	Sigma-Aldrich	791725
共聚焦显微镜	ZEISS	LSM710
共聚焦显微镜物镜	ZEISS	40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
共聚焦显微镜软件	ZEISS	ZEN
柯普林瓶	Fisher Scientific	19-4
盖玻片	Fisher brand	12545F
冷冻切片机	Leica	CM1850
CTGF 抗体	Genetex	GTX124232	RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-165-152	RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-175-147	RRID: AB_2340415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
一次性包埋底模	Fisher brand	22-363-553
驴血清	Jackson immunoresearch	017-000-121
乙醇	Decon Labs, Inc.	2701
镊子	VETUS	ESD-13
甘氨酸	Fisher brand	12007-0050
加热垫	Kent scientific	DCT-20
肝素钠盐	ACROS organics	41121-0010	100mg/15ml dH2O
湿化室	Invitrogen	44040410	可用铝箔包裹的塑料盒替代湿化室。
胰岛素注射器	BD	329461
倒置显微镜	NIKON	Eclipse Ti-E2	免疫荧光
KIM-1 抗体	R & D	AF1817	RRID: AB_2116446
Lemozole (Histo-clear)	National diagnostics	HS-200
莲属四棱豆凝集素	Vector	FL-13212
显微镜载玻片	Fisher scientific	12-550-343
切片机	Reichert	Jung 820 II
单色 CMOS 相机	NIKON	DS-Qi-2
小鼠手术器械包	Kent scientific	INSMOUSEKIT
NIS Elements	NIKON
物镜	NIKON	Plan Apo 20x/0.75	与 Eclipse Ti-E2（倒置显微镜）连接的图像采集软件
OCT 包埋剂	Scigen	4586
防扩散笔	Vector	H-4000
含钙镁的 PBS	Corning	21-030-CV
不含钙镁的 PBS	Corning	21-031-CV
PDGF-D 抗体	Thermo-Fisher scientific	40-2100
多聚甲醛 (PFA)	Electron Microscopy Science	15710	RRID: AB_2533455
酶标仪	Promega	GloMax® Discover Microplate Reader	4% PFA 由 16% PFA 在 PBS 中稀释而成。
聚维酮碘（贝塔碘）	Avrio Health L.P.	NDC 67618-151-17
高压锅	Tristar 8	Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930
Quantichrom 尿素（BUN）检测试剂盒 II	BioAssay Systems	DUR2-100
用于肾脏解剖的单刃剃须刀片（.009", 0.23 mm）	IDL tools	521013
载玻片烘片机	Lab Scientific Inc.,	XH-2001
软件	NIKON	NIS elements
蔗糖	RPI	S24060
TGF-b1 抗体	Sigma-Aldrich	SAB4502954
Tris EDTA 缓冲液	Corning	46-009-CM	RRID: AB_10747473
二水合柠檬酸三钠	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
二水合柠檬酸三钠	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
吐温-20	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
白色带电载玻片，25 x 75 mm，磨边，蓝色磨砂	Globe Scientific	1358D