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三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 Fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

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DOI：

10.3791/63181

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2021年10月28日

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1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

防控西瓜枯萎病需要了解病原菌的生理小种组成。本文介绍了根浸法、带菌种子播种法和改良盘浸法三种接种方法，以验证其在尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，Fon）生理小种鉴定中的有效性。

摘要

由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，简称 Fon）引起的西瓜枯萎病（Citrullus lanatus）近年来在美国东南部，尤其是佛罗里达州，重新成为西瓜生产的主要限制因素。实施综合病虫害管理策略（如种植特定生理小种抗性品种）需要了解田间病原菌的多样性及其种群密度。尽管在开发用于鉴定病原菌分离物的分子诊断工具方面已取得一定进展，但生理小种的鉴定通常仍需依赖生物测定方法。

通过根部浸蘸接种法、带菌种子接种法以及改良托盘浸蘸法，对四种西瓜鉴别寄主（Black Diamond、Charleston Grey、Calhoun Grey、Plant Introduction 296341-FR）进行生理小种分型。接种后五周，根据病害发生率计算结果，确定分离物的生理小种类型。若某一特定品种的植株发病比例低于33%，则归类为抗病；若发病比例高于33%，则视为感病。本文描述了三种用于确定生理小种的接种方法：根部浸蘸法、带菌种子法和改良托盘浸蘸法，其具体应用根据实验设计而有所不同。

引言

构成土传真菌的 Fusarium oxysporum 物种复合体（FOSC）是一类重要的半活体营养型植物病原菌，可在多种作物上引起严重病害并导致产量损失1西瓜枯萎病，由 F. oxysporum 专化型 niveum (Fon), 在过去的几十年里，其在全球范围内的波及范围、发生率和严重程度均有所上升2,3幼苗期， Fusarium 枯萎病的症状常与猝倒病相似。在较老的植株中，叶片逐渐变为灰白色、失绿并出现坏死。最终，植株萎蔫进一步发展为整株倒伏和死亡4直接产量损失由症状和植株死亡引起，而间接产量损失可能由于叶片冠层被破坏导致果实受阳光伤害而发生5. 有性生殖及其相关的生殖结构从未被观察到过 F. oxysporum 然而，该病原菌可产生两种无性孢子，即分生孢子和大分生孢子，以及一种较大的长期存活结构，称为厚垣孢子，可在土壤中存活多年6.

尖孢镰刀菌（FOSC）根据观察到的寄主范围被划分为不同的专化型，通常仅限于一种或少数几种寄主物种1....

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方案

1. 采用根浸法（RDM）测定生理小种

  1. 制备 实验环境
    1. 由于症状表现高度依赖于环境条件，需将植物置于受控环境中培养。监测相对湿度、温度、光周期和光照强度（图1).
      1. 将温度设置为26-28 °C，相对湿度设置为50-75%，并设定16小时光周期，以确保植物充分生长和健康。
        注意：为防止缺氧、幼苗萎蔫和/或种子腐烂，请勿过度浇水，也不要让幼苗周围积水。
      2. 使用两根荧光灯管，每组灯管的光通量至少为1850流明，色温为2800 K，以支持光合作用生长。
      3. 保持区域清洁，采用卫生操作规范，包括清除废土和植物残渣，以防止害虫侵害和偶然感染。
    2. 种植条件
      1. 填充 8个16格（25厘米宽 × 50厘米长）育苗盘，装入种植基质后轻轻压实，使土壤略微紧实（图2).
      2. 获取四种鉴别品种的种子：Black Diamond/Sugar Baby、Charleston Grey/Allsweet/Dixielee、Calhoun Grey 和 PI-296341-FR。
      3. 将种子播种，使其顶端（尖端）朝上，深度等于种子长度。播种后，....

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结果

这些实验有助于确定常见栽培品种的相对抗性（表1）。该信息随后可用于根据当地Fon菌群情况制定管理建议。换句话说，如果已知某商业种植田中存在0型或1型生理小种，则农户可选择种植“抗性”品种，例如Calhoun Gray、Sunsugar或同类品种。采用所有方法进行的生物测定结果表明，当幼苗接种1型生理小种后，Black Diamond和Charleston Grey品种死亡或表现出严重症状，而Calhoun Grey和PI品种则表现出抗性（表2和图8A）。

所有方法均显示，当幼苗接种3号生理小种菌株时，几乎所有品种的植株均死亡或表现出严重症状（图8B）。这些结果表明，利用两种接种方法的生物测定能够成功区分尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fon）的不同生理小种。对于所有方法而言，病害植株的表现应一致，唯一的差异在于品种在空间上的分组方式。在根部浸蘸法和改良干燥浸蘸法中，不同品种将按培养皿的列进行排列；而在种子法.......

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讨论

已提出三种生理小种分型方法。每种方法均适用于特定的研究问题和实验条件。带菌籽粒接种法（土壤接种法）可能更为简单直接，特别适用于致病性评估30。使用该方法进行简单的生理小种分型非常有效。然而，在测定某一特定栽培品种抗性时，该方法的应用可能面临挑战，因为每株植物所经历的侵染程度或暴露水平可能不一致，而要测试目标栽培品种的抗性，通常需要达到相对均一且较高的病害水平。其原因在于，通过该方法产生的接种物难以准确定量，且具有活力的繁殖体比例，或到达根区的具侵染能力繁殖体数量均不易精确控制31。此外，该方法还受限于所播籽粒与根区之间距离的一致性。若籽粒距离根区过远，孢子可能无法萌发，或菌丝无法充分生长以抵达根部。

根浸法32,33 更为费力且耗时；然而，由于能够更准确地测量与植物相互作用的存活繁殖体数量，因此可以更精确地描述寄主抗性，有助于抗性筛选。此外，同一生理小种内毒力的差异也更容.......

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们谨向阿里博士、植物分子诊断实验室以及佐治亚大学的季平生博士致以诚挚感谢，他们的领导与支持对建立我们的Fon项目起到了重要作用。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% 弗勒土（Fuller’s Earth）Sigma-AldrichF200-5KG
1 L 玻璃锥形瓶（Erlenmeyer Flask）PYREX4980-1L
15 mL 离心管（falcon tubes）Fisher Scientific14-959-49B
50 mL 量筒Lab Safety Supply41121805
50 mL Eppendorf 圆底离心管Fisher Scientific05-413-921
铝箔纸Reynolds Wrap720
漂白剂Walmart587192290
本生灯Fisher Scientific03-391-301
CaCO3sigma-Aldrich239216
涂布棒（cell spreaders）Fisher Scientific08-100-11
纱布Lions Services, Inc8305-01-125-0725
透明塑料培养皿Visions Wave999RP6CLSS直径约 15 cm
用于蘑菇袋夹具的透明乙烯基软管Shroom Supply小袋用 6"，中袋用 8"，大袋用 10"
棉球Fisherbrand22-456-885无菌
乙醇Fisher ChemicalA4094100%，使用时与水混合配制成 70%
荧光灯管MaxLumeModel T5色温 2800 K，长度 24'' 或 48''
颗粒状琼脂VWR International90000-786
手持式喷雾瓶Ability One24122002容量约 0.95 L
血细胞计数板（hemacytometer）Fisher Scientific02-671-55A双室血细胞计数板
实验托盘Fisher Scientific15-236-2A
大号可密封塑料袋Ziploc43080538 cm × 38 cm
喷雾器 / 浇水壶Bar5FB10H22
蘑菇袋夹具Shroom Supply小袋用 6"，中袋用 8"，大袋用 10"
腈类手套Fisher Scientific19-130-1597D
有机黑麦粒Shroom Supply0.5 加仑或 25 磅装袋
P1000 移液器及吸头Fisher Scientific14-388-100
培养皿（Petri dishes）FisherbrandFB0875713圆形，直径 100 mm，高 15 mm
种植基质Jolly GardenerPro-Line C/B
塑料水壶BrandTechUX06008501 L 或更大
塑料种植盆Neo/SCI01-1177直径约 15 cm，高约 10 cm
塑料耐高压灭菌容器Thermo ScientificUX06010223 L
四分之一强度马铃薯葡萄糖琼脂培养基Cole-ParmerUX1420028使用粉末并结合 QPDA 配方使用
科学天平（以克为单位称量）Ohaus30208458任何可精确称量 200 g 的精密天平均可使用
4 号软木塞钻孔器Cole-ParmerNC9585352
小型蘑菇培养袋Shroom Supply带 0.5 微米过滤膜，也有中号和大号规格
园艺铲Walmart563876946
聚苯乙烯育苗盘（6 × 12 孔）SpeedlingModel TR72A
聚苯乙烯育苗盘（8 × 16 孔）SpeedlingModel TR128A
注射器（5 或 10 mL）fisher Scientific14-829-19C
计时器WalmartTM-01
100% 原味 V8 蔬菜汁Walmart564638212
涡旋振荡器Fisher Scientific02-215-418
西瓜种子 - 黑钻（Black Diamond）Willhite Seed Inc17
西瓜种子 - 卡尔霍恩灰（Calhoun Gray）Holmes Seed Company4440
西瓜种子 - 查尔斯顿灰（Charleston Gray）Bonnie Plants7.15339E+11
西瓜种子 - PI 296341-FR联系作者联系作者
小麦粒（Maxie 品种）（可选）Alachua County Feed & Seed

参考文献

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant dise....

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