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方法文章

三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 Fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

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DOI：

10.3791/63181

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2021年10月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

防控西瓜枯萎病需要了解病原菌的生理小种组成。本文介绍了根浸法、带菌种子播种法和改良盘浸法三种接种方法，以验证其在尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，Fon）生理小种鉴定中的有效性。

摘要

由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，简称 Fon）引起的西瓜枯萎病（Citrullus lanatus）近年来在美国东南部，尤其是佛罗里达州，重新成为西瓜生产的主要限制因素。实施综合病虫害管理策略（如种植特定生理小种抗性品种）需要了解田间病原菌的多样性及其种群密度。尽管在开发用于鉴定病原菌分离物的分子诊断工具方面已取得一定进展，但生理小种的鉴定通常仍需依赖生物测定方法。

通过根部浸蘸接种法、带菌种子接种法以及改良托盘浸蘸法，对四种西瓜鉴别寄主（Black Diamond、Charleston Grey、Calhoun Grey、Plant Introduction 296341-FR）进行生理小种分型。接种后五周，根据病害发生率计算结果，确定分离物的生理小种类型。若某一特定品种的植株发病比例低于33%，则归类为抗病；若发病比例高于33%，则视为感病。本文描述了三种用于确定生理小种的接种方法：根部浸蘸法、带菌种子法和改良托盘浸蘸法，其具体应用根据实验设计而有所不同。

引言

构成土传真菌的 Fusarium oxysporum 物种复合体（FOSC）是一类重要的半活体营养型植物病原菌，可在多种作物上引起严重病害并导致产量损失1西瓜枯萎病，由 F. oxysporum 专化型 niveum (Fon), 在过去的几十年里，其在全球范围内的波及范围、发生率和严重程度均有所上升2,3幼苗期， Fusarium 枯萎病的症状常与猝倒病相似。在较老的植株中，叶片逐渐变为灰白色、失绿并出现坏死。最终，植株萎蔫进一步发展为整株倒伏和死亡4直接产量损失由症状和植株死亡引起，而间接产量损失可能由于叶片冠层被破坏导致果实受阳光伤害而发生5. 有性生殖及其相关的生殖结构从未被观察到过 F. oxysporum 然而，该病原菌可产生两种无性孢子，即分生孢子和大分生孢子，以及一种较大的长期存活结构，称为厚垣孢子，可在土壤中存活多年6.

尖孢镰刀菌（FOSC）根据观察到的寄主范围被划分为不同的专化型，通常仅限于一种或少数几种寄主物种1。尽管近期研究表明，该物种复合体可能由15种不同的物种组成，但目前尚不清楚具体是哪些物种感染西瓜7。F. oxysporum f. sp. niveum（Fon）是指专门侵染Citrullus lanatus或栽培西瓜的菌株类群8,9。大多数致病性专化型内的F. oxysporum菌株在遗传组成及其对寄主物种的毒力方面表现出一定程度的多样性。例如，某一菌株可侵染某寄主的所有栽培品种，而另一菌株则仅侵染其中较敏感的品种。为了描述此类变异，这些菌株类群通常根据进化关系或共同的表型特征被非正式地划分为生理小种。在Fon中，已根据其对一组选定西瓜栽培品种的致病性划分为四个生理小种（0、1、2和3），其中生理小种3为近期发现10。

尽管表现出明显的多样性，但不同尖孢镰刀菌（Fon）生理小种之间的孢子或菌丝形态无法区分，因此需要借助分子或表型检测方法来确定分离物所属的独特生理小种11。分子研究表明，某些遗传差异已被发现。例如，木质部分泌蛋白（Secreted in Xylem, SIX）效应因子在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）中的作用已被研究多年，其中一些效应因子位于水平基因转移过程中交换的染色体上12。例如，SIX6存在于Fon生理小种0和1中，但不存在于生理小种2中13。SIX效应因子已被证实参与尖孢镰刀菌番茄专化型（F. oxysporum f. sp. lycopersici）和尖孢镰刀菌香蕉专化型（F. oxysporum f. sp. cubense）的致病过程，这两种病原菌分别引起番茄和香蕉的镰刀菌枯萎病14,15,16,17。对引起菠菜镰刀菌枯萎病的尖孢镰刀菌菠菜专化型（F. oxysporum f. sp. spinaciae）菌株中SIX效应因子谱的分析，已实现了能够准确反映其遗传和表型多样性的分类18。然而，目前对不同Fon生理小种间致病机制的差异尚未完全阐明，基于这些机制开发的分子检测方法也表现出结果不一致且准确性不足的问题19。因此，目前通过接种试验获得的表型结果仍是对分离物进行分类的最佳方法。

F. oxysporum 最初通过根部侵染寄主，随后进入木质部并向上扩展20。因此，直接接种特定寄主品种的根部是进行生理小种分型的有效方法，也是根浸法和托盘浸根法的基础21。在未侵染寄主时，F. oxysporum 存在于土壤中，并可休眠多年。在来自目标田块的土壤中种植感病的西瓜品种，是检测Fon是否存在的一种方法。将该方法扩展至使用已知不同抗性水平的品种，并在人为接种Fon的土壤中进行种植，也是进行生理小种分型的有效手段（表1），并构成了接种菌核育苗法的基础。改良托盘浸根法是原始托盘浸根法的一种变体，可实现高通量的生理小种分型，能够快速检测大量植株和田间分离物22。快速且成功的生理小种分型生物测定的关键因素包括：选用对不同病原菌生理小种具有明确抗性差异的品种、确保接种物在侵染期间具有生物活性且数量充足、维持有利于病原菌和寄主生长的环境条件，以及采用统一的病害严重程度或发病率评级系统。本文基于上述原理，描述了根浸法23,24、接种菌核育苗法25,26和改良托盘浸根法22等用于表型生理小种分型的方法。

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方案

1. 采用根浸法（RDM）测定生理小种

  1. 制备 实验环境
    1. 由于症状表现高度依赖于环境条件，需将植物置于受控环境中培养。监测相对湿度、温度、光周期和光照强度（图1).
      1. 将温度设置为26-28 °C，相对湿度设置为50-75%，并设定16小时光周期，以确保植物充分生长和健康。
        注意：为防止缺氧、幼苗萎蔫和/或种子腐烂，请勿过度浇水，也不要让幼苗周围积水。
      2. 使用两根荧光灯管，每组灯管的光通量至少为1850流明，色温为2800 K，以支持光合作用生长。
      3. 保持区域清洁，采用卫生操作规范，包括清除废土和植物残渣，以防止害虫侵害和偶然感染。
    2. 种植条件
      1. 填充 8个16格（25厘米宽 × 50厘米长）育苗盘，装入种植基质后轻轻压实，使土壤略微紧实（图2).
      2. 获取四种鉴别品种的种子：Black Diamond/Sugar Baby、Charleston Grey/Allsweet/Dixielee、Calhoun Grey 和 PI-296341-FR。
      3. 将种子播种，使其顶端（尖端）朝上，深度等于种子长度。播种后，用100%漂白土或其他膨润土类替代物覆盖含有埋入种子的培养基，覆盖厚度为0.3175–0.635 cm。
      4. 将育苗盘喷雾润湿，使培养基质潮湿但不产生积水。此后，在种子萌发前约5天内，每隔180分钟喷雾20秒，或每天手动浇水一次，以保持基质湿润。萌发后，每天浇水一次，并根据需要补充水分，以促进幼苗生长。
    3. 培养基制备
      注意：两种培养基均添加额外的颗粒状琼脂以增强硬度，便于通过刮取表面收集孢子。
      1. 澄清V8果汁培养基（V8）
        1. 制备 500 mL 澄清V8汁培养基（V8）27 通过加入100 mL澄清的V8原味100%蔬菜汁和1% CaCO₃3 至400 mL蒸馏水中。
        2. 加入7.5 g颗粒状琼脂。
        3. 充分混合各成分，高压灭菌后冷却至50 °C，再倒入无菌培养皿中。
      2. 四分之一强度马铃薯葡萄糖琼脂培养基（qPDA）
        1. 通过加入4.5 g颗粒状琼脂制备qPDA培养基 向500 mL蒸馏水中加入3.8 g马铃薯葡萄糖琼脂。
        2. 将成分充分混合，高压灭菌后冷却至 50 °C，再将 12–15 mL 倒入无菌培养皿中。
  2. 实验处理的制备
    1. 制备接种物。
      1. 种植后第5天（dpp），将含有偏好物质的浸润滤纸片（直径1-1.25 cm）放置于目标位置 F. oxysporum 在一块V8培养基和一块qPDA培养基上分别分离，并置于培养箱中（约28 °C）培养八天28 (图3A).
      2. 在真菌生长的第8天，即接种前一天（参见第1.3.2节），将V8和qPDA平板从培养箱转移至生物安全柜中。
      3. 对于每个分离株，向每块 V8 和 qPDA 培养平板中加入 6 mL 灭菌去离子水。
      4. 用无菌细胞刮铲在培养基表面轻轻刮擦以释放分生孢子（图3B）。合并液体分生孢子悬液，并转移至无菌50 mL培养管中（图3C).
      5. 重复此过程，直至50 mL培养管中液体分生孢子悬液的总体积约为12 mL。
      6. 在处理下一个分离物之前，用酒精对工作区域和涂布棒进行表面消毒。将涂布棒浸入浓度不低于70%的乙醇后，通过本生灯火焰灼烧以实现灭菌。
      7. 将所有菌株的液体分生孢子悬浮液转移至培养管后，进行孢子计数。首先，将单个50 mL培养管中的悬浮液充分涡旋振荡，然后吸取10 µL加入血细胞计数板的每个计数室中。随后，按照前述方法计算血细胞计数板中的孢子数量。29.
      8. 通过转移计算好的体积来制备最终接种液，以获得106 + 10% 转移至另一无菌培养管中，并加入无菌去离子水至总体积为 30 mL。
      9. 将这些培养管在 8 ± 1 °C 条件下避光保存过夜。
        注意：根据未发表的数据，此操作不会影响分生孢子的活力。
  3. 接种
    1. 准备接种。
      1. 接种前一天，将13日龄的幼苗充分浇水至土壤持水量。
      2. 预先在标牌上标注相关信息，包括待测菌株、西瓜品种及接种日期。
      3. 将6个12格（20 cm宽 × 40 cm长）聚苯乙烯泡沫育苗盘置于操作区域，这些育苗盘需事先用10%次氯酸钠溶液消毒并充分冲洗，用于放置接种后的植株。
      4. 预先准备好所有所需材料（参见 材料表).
    2. 接种植物根部。
      1. 在开始接种前数小时对植株充分浇水。浇水后至少2小时，将幼苗从8×16孔聚苯乙烯育苗盘中取出，冲洗根部以去除附着的种植基质颗粒。
      2. 将冲洗后的植株暂时存放于装有自来水的洁净容器中，直至使用；存放时需将不同品种相互分开（图4A将幼苗每6株分为一组，用湿润的纸巾包裹后置于实验托盘中，以防止干燥。
      3. 放置 25-30 cm3 在6×12孔聚苯乙烯培养盘的每个孔底部加入土壤，并使用喷瓶润湿土壤，直至其明显湿润。
      4. 接种植物后，按照品种顺序重新栽种，依次为 Black Diamond、Charleston Grey、Calhoun Grey，然后 PI 296341 01 FR 从左到右种植。
      5. 从健康对照组开始，放置六只一组 将相同品种的健康幼苗放入含有接种物的50 mL离心管中。对于健康对照组，使用自来水代替孢子悬浮液。最后用阳性对照（Fon 3号生理小种）对植株进行接种。
      6. 进入管内后，确保植物根部接触到接种物（自来水）并暴露于其中。
      7. 将试管涡旋震荡，使植株根部浸没其中，持续30秒（图4B）。涡旋振荡后，将单株小植株放入6 x 12孔聚苯乙烯育苗盘的每个孔中。同一品种的植株应放置在同一列中。
      8. 放置后，将戴手套的手浸入含0.7%有效氯的溶液桶中消毒30秒，随后用自来水冲洗1分钟。
      9. 随后，用栽培基质覆盖已放置的植株，并轻轻固定。使用注射器或移液器，每株植株小心加入20 mL水，避免溅出。
      10. 在继续处理下一组植物之前，使用氯溶液和自来水冲洗手套，对戴着手套的双手进行再次消毒。
      11. 所有小植株移栽后，再次少量浇水，以防止接种物流失。
      12. 将植株在密闭、黑暗的环境中放置过夜，平均温度保持在 27 °C。次日将植株转移至温室中，维持平均温度为 27 °C。
  4. 接种植物的维护与护理
    1. 为防止多余的水溢出，每天少量浇水三次，持续4至5天，直至植株稳定。
    2. 每天至少检查托盘2-3次，持续至少三天，以确保浇水充分且均匀。
    3. 避免因阳光直射或遮荫导致的干燥，可通过旋转育苗盘和/或根据需要提供额外遮荫/浇水来实现。
    4. 在播种后第3天，使用20-20-20速效肥料（10 g/3.78 L），按每升水3–6 mL的用量对植株进行施肥。
    5. 授粉 每周一次，持续3至4周。
    6. 在整个步骤中保持相同的光照和环境条件。

2. 采用受害籽粒法（IKM）确定小种

  1. 籽粒接种
    1. 制备接种物。
      1. 从保存的或新采集的样品中分离并培养一株感兴趣的 F. oxysporum f. sp. niveum 菌株，接种于 qPDA 平板上，使其菌丝生长覆盖平板约一半面积。
        注意：这表明该菌株具有活性和可存活性，是后续步骤中有效侵染籽粒所必需的。
    2. 准备籽粒。
      1. 使用天平，在足够大的容器中称取 200 g 黑麦（Secale spp.）浆果（或 Maxie 品种小麦（Triticum spp.）籽粒），倒入一个或多个 1 L 玻璃锥形瓶中。向锥形瓶中加入无菌自来水，完全浸没籽粒，水位至少高出籽粒 5 cm（图 5A）。
      2. 在室温（约 24 °C）下浸泡籽粒 2 小时。倒掉水分，用包裹在纱布中的棉卷塞住瓶口，并用铝箔包裹瓶口（图 5B）。
    3. 对籽粒进行去污染处理。待籽粒充分吸水后，采用两种不同的方式两次高压灭菌，以在接种前杀灭其他不需要的微生物。
      1. 第一次灭菌时，将已准备好的锥形瓶中的籽粒在重力循环条件下（121.2 °C，1.06 kg/cm2）高压灭菌 1 小时，干燥 5 分钟。待锥形瓶冷却至室温。
      2. 第二次灭菌前，将籽粒转移至带有 0.5 µm 滤膜的小型食用菌培养袋中。排出袋内空气，然后将多余的塑料部分折叠包裹。
      3. 将袋子放入一个塑料的、可耐受高压灭菌的容器中，并用铝箔包裹容器（图 5C）。
        注意：在对袋中籽粒进行高压灭菌时，切勿使用金属容器，以免导致袋子熔化。
      4. 在重力循环条件下再次高压灭菌 1 小时，干燥 5 分钟，循环参数与前次相同。
        注意：袋子仅在第二次进行高压灭菌，而非第一次，因为若两次灭菌可能导致滤膜和接口受损。为防止滤膜上产生冷凝水，在从高压灭菌器中取出袋子前，应让其缓慢且完全冷却，因为若滤膜受潮会失去功能。
    4. 接种籽粒。
      1. 在生物安全柜内操作，使用无菌的 4 号打孔器从培养平板上活跃生长区域切取直径为 6 mm 的琼脂块。打开培养袋，采用严格的无菌技术将 5 块琼脂块放入袋中。使用无菌的 50 mL 量筒量取 35 mL 无菌自来水，加入袋中。
      2. 将袋口稍微卷起，然后用 70% 乙醇喷洒袋外表面以进行表面消毒。
        注意：切勿喷洒滤膜，因为水分会破坏其功能。
      3. 将袋口的角部向中心折叠，再在滤膜上方翻折两次以封闭袋口。使用厂家提供的夹子和透明乙烯基管固定袋口。
        注意：夹子可重复使用。
      4. 将袋子从生物安全柜中取出。
    5. 储存病原菌以促进其生长。
      1. 将袋子直立存放。确保滤膜远离袋子的对侧，以实现最大程度的气体交换（图 5D）。
      2. 在室温下培养约三周。定期翻动籽粒，以确保病原菌均匀生长。
        注意：培养袋不可重复使用。
  2. 用带菌籽粒接种西瓜幼苗
    1. 按前述方法获取西瓜种子。
    2. 确定实验分组。
      注意：实验中所需的病原菌菌株仅为待鉴定生理小种的分离物。然而，设置阴性对照和阳性对照有助于与未感染或特定感染程度的植株进行比较。
      1. 制备阴性对照时，使用按前述方法灭菌但未接种的小麦籽粒。
      2. 制备阳性对照时，使用已分类菌株接种的小麦籽粒，以便与未知分离物进行比较。
    3. 混合土壤与籽粒。
      1. 将 14 粒带菌籽粒量入一个大塑料袋中（图 5E）。用塑料花盆（直径 15 cm，高 10 cm）装满育苗基质，以确定所需基质量，然后将基质倒入袋中。在袋内形成气垫后扭紧或密封袋口。
      2. 通过多次翻转袋子混合籽粒与土壤。对于阴性对照，在另一个袋子中用洁净籽粒进行相同操作。对于阳性对照，在另一个袋子中用接种了比较菌株的籽粒进行相同操作。
      3. 将四只表面灭菌的花盆装入带菌土壤混合物。处理任何被尖孢镰刀菌（Fon）污染的土壤前，先完成阴性对照组的装盆。
    4. 播种西瓜种子。
      1. 每盆播种 6 粒种子。确保每盆仅包含同一品种的种子。将种子尖端朝上放置，以利于出苗时正常生长（图 6A）。
      2. 使用喷雾瓶将土壤表层 0.3–0.6 cm 喷湿。在每盆底部和顶部各放置一个透明塑料皿（直径 15 cm），以创造利于种子萌发的湿润环境（图 6B）。
    5. 建立培养条件。
      1. 在种子萌发前（约 5 天），每天用喷雾瓶喷水三次，保持土壤紧实但无径流。
        注意：所需水量将随植株和花盆尺寸增大而增加。
      2. 种子萌发后，将顶部塑料皿移至花盆底部。
      3. 根据需要每天浇水，以促进植株最佳生长。将植株置于 16 小时光照周期下，光照条件与前述一致，温度保持在 27 °C（± 1 °C）。

3. 采用改良盘浸法（MTDM）测定品系

  1. 接种材料的准备
    1. 建立种植条件。
      1. 将蒸汽巴氏消毒的沙子：泥炭：蛭石（4:1:1）混合基质填入48孔（3.68 cm 宽 × 5.98 cm 长 × 4.69 cm 深）育苗穴盘中，并轻压使基质略微压实。将穴盘放入塑料托盘（27.9 cm 宽 × 53.3 cm 长 × 5.1 cm 深）中。
      2. 将种子尖端（近端）朝上播种，播种深度与种子长度相等。
      3. 种子来源按先前所述方法获取。
      4. 之后，通过每180分钟喷雾20秒或每天手动浇水一次，保持基质湿润。
      5. 发芽后（约5天），每天浇水一次，并根据需要补充水分以支持幼苗生长。
    2. 准备培养基。
      1. 通过将5.625 g颗粒状琼脂 加入500 mL蒸馏水中制备qPDA培养基；再加入4.875 g马铃薯葡萄糖琼脂。充分混合各成分，高压灭菌后冷却至50 °C，然后倒入无菌培养皿中。用封口膜密封培养皿，并将平板储存于冰箱（4 °C）中备用。
      2. 制备液体培养基时，称取24 g马铃薯葡萄糖并加入1 L锥形瓶中。加蒸馏水定容至1000 mL，将瓶子置于加热板上搅拌至完全溶解。将100 mL液体培养基分装至250 mL三角瓶中。用纱布封口后进行高压灭菌。
    3. 准备接种物。
      1. 播种前7天，在五个qPDA平板上接种浸润过的滤纸28，并在培养环境中以14小时光照/10小时黑暗的光周期培养8天22。
      2. 第7天，将两个1 cm2的琼脂块转移至每个含有100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基的250 mL三角瓶中。将三角瓶置于摇床中，在14小时光照/10小时黑暗的光周期下，以200 rpm振荡培养7天。
      3. 接种当天（播种后第14天），通过四层无菌纱布过滤接种液，收集孢子。
      4. 使用血细胞计数板按先前所述方法测定三角瓶中的微分生孢子浓度。在塑料容器（40.6 cm 宽 × 67.3 cm 长 × 16.8 cm 深）中，将适量孢子悬液加入无菌水中，配制7 L接种液悬液，最终孢子浓度为1 × 106 mL−1（图7A）。
  2. 接种
    1. 播种后14天 （至少达到第一片真叶期），将带有幼苗的穴盘转移至带网托盘（26.9 cm 宽 × 53.7 cm 长 × 6.28 cm 深）。将装有幼苗的网状托盘轻轻放入盛有7 L接种液悬液的塑料容器中。每次接种一个托盘（图7B）。
    2. 让幼苗在接种液中静置15分钟。15分钟后，将含有接种后幼苗的穴盘轻轻转移至无孔托盘（27.9 cm 宽 × 53.3 cm 长 × 5.1 cm 深）中。对每个托盘重复此操作。
    3. 将无孔托盘放置于温室台面上，并根据需要浇水。维持与根浸生物测定所述相同的光照和环境条件。

4. 病害评级

  1. 选择评级的时间间隔。
    1. 对于根浸法和改良托盘浸法，在接种植株后一周开始进行评级，并在此后每周进行一次，持续四周。
      注意：在此期间，合并的数据集将包含五组观察数据。
    2. 使用籽粒法时，仅在幼苗出土后开始评级，并每周进行一次，共进行六次评级。
  2. 观察并计算发病率。
    1. 每次评级时，拍摄数码图像以记录病害发展情况。
    2. 报告枯萎和植株死亡的发病率。通过将出现症状的植株数与健康对照组比较，并将死亡植株数占该品种总植株数的比例计算出发病率。
  3. 分析结果。比较不同品种之间以及实验组之间的感染模式，若设置了对照组，则应纳入比较。

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结果

这些实验有助于确定常见栽培品种的相对抗性（表1）。随后可利用这些信息，根据当地Fon菌群的分布情况制定相应的管理建议。换句话说，如果已知某商业种植田中存在0群或1群尖孢镰刀菌，农民可选择种植“抗性”品种，例如Calhoun Gray、Sunsugar或同类品种。采用所有方法进行的生物测定结果表明，当幼苗接种1群菌株后，Black Diamond和Charleston Grey品种死亡或表现出严重症状，而Calhoun Grey和PI品种则表现出抗性（表2和图8A）。

所有方法均表明，当幼苗接种3号生理小种菌株时，几乎所有品种的植株均死亡或表现出严重症状（图8B）。这些结果表明，利用两种接种方法进行的生物测定能够成功区分尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fon）的不同生理小种。对于所有方法而言，病害植株的表现应一致，唯一的差异在于品种在空间上的分组方式：在根部浸蘸法和改良干浸法中，不同品种按培养皿的列进行排列；...

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讨论

已提出三种生理小种分型方法。每种方法均适用于特定的研究问题和实验条件。带菌籽粒接种法（土壤接种法）可能更为简单直接，特别适用于致病性评估30。使用该方法进行简单的生理小种分型非常有效。然而，在测定某一特定栽培品种抗性时，该方法的应用可能面临挑战，因为每株植物所经历的侵染程度或暴露水平可能不一致，而要测试目标栽培品种的抗性，通常需要达到相对均一且较高的病害水平。其原因在于，通过该方法产生的接种物难以准确定量，且具有活力的繁殖体比例，或到达根区的具侵染能力繁殖体数量均不易精确控制31。此外，该方法还受限于所播籽粒与根区之间距离的一致性。若籽粒距离根区过远，孢子可能无法萌发，或菌丝无法充分生长以抵达根部。

根浸法32,33 更为费力且耗时；然而，由于能够更准确地测量与植物相互作用的存活繁殖体数量，因此可以更精确地描述寄主抗性，有助于抗性筛选。此外，同一生理小种内毒力的差异也更容...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们谨向阿里博士、植物分子诊断实验室以及佐治亚大学的季平生博士致以诚挚感谢，他们的领导与支持对建立我们的Fon项目起到了重要作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% 弗勒土（Fuller’s Earth）Sigma-AldrichF200-5KG
1 L 玻璃锥形瓶（Erlenmeyer Flask）PYREX4980-1L
15 mL 离心管（falcon tubes）Fisher Scientific14-959-49B
50 mL 量筒Lab Safety Supply41121805
50 mL Eppendorf 圆底离心管Fisher Scientific05-413-921
铝箔纸Reynolds Wrap720
漂白剂Walmart587192290
本生灯Fisher Scientific03-391-301
CaCO3sigma-Aldrich239216
涂布棒（cell spreaders）Fisher Scientific08-100-11
纱布Lions Services, Inc8305-01-125-0725
透明塑料培养皿Visions Wave999RP6CLSS直径约 15 cm
用于蘑菇袋夹具的透明乙烯基软管Shroom Supply小袋用 6"，中袋用 8"，大袋用 10"
棉球Fisherbrand22-456-885无菌
乙醇Fisher ChemicalA4094100%，使用时与水混合配制成 70%
荧光灯管MaxLumeModel T5色温 2800 K，长度 24'' 或 48''
颗粒状琼脂VWR International90000-786
手持式喷雾瓶Ability One24122002容量约 0.95 L
血细胞计数板（hemacytometer）Fisher Scientific02-671-55A双室血细胞计数板
实验托盘Fisher Scientific15-236-2A
大号可密封塑料袋Ziploc43080538 cm × 38 cm
喷雾器 / 浇水壶Bar5FB10H22
蘑菇袋夹具Shroom Supply小袋用 6"，中袋用 8"，大袋用 10"
腈类手套Fisher Scientific19-130-1597D
有机黑麦粒Shroom Supply0.5 加仑或 25 磅装袋
P1000 移液器及吸头Fisher Scientific14-388-100
培养皿（Petri dishes）FisherbrandFB0875713圆形，直径 100 mm，高 15 mm
种植基质Jolly GardenerPro-Line C/B
塑料水壶BrandTechUX06008501 L 或更大
塑料种植盆Neo/SCI01-1177直径约 15 cm，高约 10 cm
塑料耐高压灭菌容器Thermo ScientificUX06010223 L
四分之一强度马铃薯葡萄糖琼脂培养基Cole-ParmerUX1420028使用粉末并结合 QPDA 配方使用
科学天平（以克为单位称量）Ohaus30208458任何可精确称量 200 g 的精密天平均可使用
4 号软木塞钻孔器Cole-ParmerNC9585352
小型蘑菇培养袋Shroom Supply带 0.5 微米过滤膜，也有中号和大号规格
园艺铲Walmart563876946
聚苯乙烯育苗盘（6 × 12 孔）SpeedlingModel TR72A
聚苯乙烯育苗盘（8 × 16 孔）SpeedlingModel TR128A
注射器（5 或 10 mL）fisher Scientific14-829-19C
计时器WalmartTM-01
100% 原味 V8 蔬菜汁Walmart564638212
涡旋振荡器Fisher Scientific02-215-418
西瓜种子 - 黑钻（Black Diamond）Willhite Seed Inc17
西瓜种子 - 卡尔霍恩灰（Calhoun Gray）Holmes Seed Company4440
西瓜种子 - 查尔斯顿灰（Charleston Gray）Bonnie Plants7.15339E+11
西瓜种子 - PI 296341-FR联系作者联系作者
小麦粒（Maxie 品种）（可选）Alachua County Feed & Seed

参考文献

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