利用光遗传学逆转神经可塑性并抑制大鼠的可卡因觅药行为

摘要

本文所述方法介绍了一种用于在大鼠行为相关神经环路中光遗传学逆转可卡因诱导的突触可塑性的实验流程。对丘脑-杏仁核突触进行持续的低频光刺激可诱导长时程抑制（LTD）。 在体 在可卡因暴露过的大鼠中，光遗传学诱导的LTD导致随后的线索驱动型觅药行为减弱。

摘要

本方案演示了利用光遗传学工具逆转大鼠丘脑-杏仁核环路中可卡因诱导的突触可塑性，从而减少后续可卡因觅药行为的具体步骤。在我们的研究中发现，当大鼠在视听线索配对下自我注射静脉内可卡因时，随着线索-可卡因关联的学习，丘脑内侧膝状体核（MGN）向侧杏仁核（LA）主神经元的突触输入会增强。我们假设，若能逆转这些突触上由可卡因引起的可塑性变化，便可降低由线索驱动的可卡因觅药行为。为了在活体（in vivo）条件下实现此类神经调控，我们旨在诱导突触长时程抑制（LTD），以减弱MGN-LA突触的强度。为此，我们采用了光遗传学技术，该技术可通过光来调控脑环路。通过将携带兴奋性视蛋白oChiEF的腺相关病毒（AAV）注入MGN，使oChiEF在LA中的MGN突触前末梢表达。随后，在LA区域植入光纤，并以1 Hz的频率脉冲式照射473 nm激光，持续15分钟，以诱导LTD并逆转可卡因引起的突触可塑性变化。该干预可长期降低与可卡因相关线索诱发药物寻求行为的能力。

引言

药物滥用是美国乃至全球极为严重的公共卫生问题。尽管经过数十年的深入研究，目前仍缺乏有效的治疗手段^1,2。治疗的一大障碍在于，长期用药会形成药物与环境线索之间的持久关联性记忆。再次接触与药物相关的线索会引发生理和行为反应，从而促使药物持续使用并导致复吸³。一种新型的治疗策略是采用基于记忆的干预方法，旨在调控参与药物-线索关联的神经环路。最近研究发现，外侧杏仁核（LA）的突触，特别是来自丘脑内侧膝状体核（MGN）的突触，在反复与线索关联的可卡因自我给药后会增强，且这种突触增强可支持可卡因觅药行为^4,5。因此，有研究提出，通过逆转MGN-LA突触的可塑性变化，可能减弱由线索诱发的复吸行为。

精确靶向特定脑回路突触可塑性的能力一直是该领域面临的主要挑战。传统的药理学工具在减少复吸行为方面已取得一定成效，但受限于无法调控单个突触。然而，近年来的进展 体内 光遗传学提供了克服这些局限性所需的工具，能够以时间和空间上的精确性控制神经通路^6,7,

方案

本协议中描述的实验均符合美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）制定的指南。 实验动物护理和使用指南 并经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准。所有操作均使用成年、未经处理的Sprague-Dawley大鼠进行，大鼠到达时体重为275–325 g。

1. 光纤植入物和连接线的构建

1. 按照先前发表的方案制备光纤植入物⁹。本方案中描述的实验使用了200 µm纤芯（0.5 NA）的光纤和Ø1.25 mm多模LC/PC陶瓷插芯，孔径为Ø230 µm。
   1. 使用Dremel工具在插芯的下三分之一处（靠近插芯平面端的一侧）进行划痕处理。对插芯进行划痕有助于其牢固地附着于牙科水泥，从而提高在整个实验过程中保持稳定的概率。
   2. 使用剪线钳剪取约35 mm长的光纤。使用光纤剥线工具剥去约25 mm的涂覆层，保留10 mm未剥除部分。
   3. 根据制造商说明配制热固性环氧树脂。将1 g树脂粉末溶解于100 mg固化剂中。将钝化的25号针头连接至1 mL注射器上，用注射器吸取环氧树脂，并安装钝化针头尖端。
   4. 使用台钳或夹具将插芯固定，确保平面朝上、凸面朝下。用装有环氧树脂的注射器在插芯的平面端滴加一滴环氧树脂，注意擦去插芯侧面多余的环氧树脂。
   5. ....

结果

实验顺序的时间线如图1所示。在整个行为实验过程中，可卡因输注次数以及在主动杠杆上的反应次数用于衡量可卡因觅药行为的强度。在可卡因自我给药的最初几天，主动杠杆反应次数应在每次获取阶段逐渐增加，并在第二周趋于稳定。相反，非主动杠杆的反应次数在整个实验过程中应始终保持较低水平（图2A）。在工具性消退的第一天，由于未预期到可卡因的缺失，通常会出现主动杠杆反应次数的短暂上升，导致可卡因觅药行为增强。然而，随着大鼠逐渐学习到新的反应结果关联，该反应在随后的训练阶段会逐步减少，通常在6–10天内达到较低且稳定的主动杠杆反应水平（图2B）。在自我给药或工具性消退阶段未能达到规定获取标准的大鼠将被剔除出研究，其数据不纳入最终分析。

在工具性消退后，重新暴露于与可卡因相关的线索会恢复可卡因寻求行为，导致主动杠杆按压次数增加。该现象在两组对照实验中均被观察到：注射了不含oChIEF的病毒（AAV对照）的大鼠，以及未接受激光刺激.......

讨论

如上所述，有多个关键步骤对于获得正确的实验结果至关重要。该方案可能仅对成功建立可卡因自给行为的动物有效，迄今为止，仅使用上述参数进行过测试。可卡因剂量、强化程序以及线索参数可能在不影响行为结果的前提下进行调整，但需注意，二级强化程序可能导致与杏仁核无关的可卡因寻求行为，从而可能降低该操作的效果，尽管这一点尚未被直接验证¹⁴。在整个实验流程中，有多个环节需要验证光纤构造的正确性及其功能，以确保光刺激的成功实施。必须正确刻痕光纤套管以防止其从头帽脱落，并对光纤进行抛光处理，同时检测植入物的光输出损耗不得超过30%⁹。此外，激光刺激参数也是重要的考虑因素。激光应以相对较低的功率（5–7 mW）运行。采用持续性低频刺激以诱导长时程抑制（LTD），其功能性效果可通过电生理记录测量MGN-LA突触强度来验证。最后，实验结果表明，在每组最终n=10只动物的情况下，线索诱导的复吸行为显著减少；然而，实验者应预计初始样本量需更大，因为部分动物可能需在最终分析中被排除。至关重要的是，必须验证病毒和光纤在解剖学上的正确位置及表达情况，并且仅使用经组织学确认无误的动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠溶液	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. 刺激隔离器	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	杜克大学病毒载体中心（通过 Roger Tsien）	#268	参见 Lin 等，2009；Nabavi 等，2014
AAV5.hSyn.tdTomato（对照）	杜克病毒载体核心对照		参见 Lin 等，2009；Nabavi 等，2014
人工泪液（眼用软膏）	Covetrus	70349
ATP 镁盐	Fisher Scientific	A9187
聚维酮碘	Butler Schein	38250
氯化钙	Fisher Scientific	C1016
氯化铯	Fisher Scientific	289329
氢氧化铯	Fisher Scientific	516988
甲基磺酸铯	Fisher Scientific	C1426
盐酸可卡因	美国国家药物滥用研究所药物供应中心	9041-001
冷冻切片机	Leica	CM1950
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
双通道温度控制器	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
乙醇	匹兹堡大学化学试剂库	200C5000
套管防尘帽	Thor Labs	中国台湾	用于1.25 mm尾纤套管的白色塑料防尘帽
套管对接套筒	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25，青铜，内径 1.25 mm
卡套	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm 多模 LC/PC 陶瓷插芯 Ø230 μm 孔径大小
光纤	Thor Labs	FP200URT	200 μm 芯多模光纤（0.5 数值孔径）
光纤旋转接头	Prizmatix	（从亚马逊订购）	18 mm 直径，用于光纤的 FC-FC 连接器
光纤剥除工具	Thor Labs	T12S21
含DAPI的Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6057
庆大霉素	Henry Schein	6913
GTP 钠盐	Fisher Scientific	G8877
哈密顿注射器	Hamilton	80085	10 μL 体积，26 号，2 英寸，3 型针尖
热风枪	Allied Electronics	972-6966	250 V，750-800 °F
可热固化的环氧树脂	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
肝素	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
盐酸	Fisher Scientific	219405490
异氟烷	Henry Schein	29405
盐酸氯胺酮	Henry Schein	55853	氯胺酮是一种管制物质，应根据机构指南进行操作和管理
乳酸林格液’s	Henry Schein	9846
激光器、驱动器和激光到光纤耦合器	OEM 激光系统	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW，473 nm，二极管泵浦固体激光器（一种可选方案）
L-谷胱甘肽	Fisher Scientific	G4251
利多卡因	Butler Schein	14583
光传感器	Thor Labs	PM100D	带数字显示屏的紧凑型能量计控制台
Loctite 瞬干胶	格雷格纳	5E207
硫酸镁	Sigma-Aldrich	203726
微电极放大器/数据采集	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
显微注射泵	哈佛仪器	70-4501	双注射器
显微操作仪	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
显微镜	奥林巴斯	BX51WI	用于电生理学的直立显微镜
显微镜	奥林巴斯	BX61VS	荧光显微镜载玻片扫描仪
N-甲基-D-葡糖胺	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet 牙科水泥，液体	朗氏牙科	1504BLK	黑色
Orthojet 牙科水泥，粉末	朗氏牙科	1530BLK	现代粉末，黑色
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
跳线电缆	Thor Labs	FP200ERT	多模式 FT030 管路
苦味毒剂	Fisher Scientific	AC131210010
抛光盘	Thor Labs	D50FC
抛光垫	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
抛光纸	Thor Labs	LFG5P	5 μm 砂砾
抛光纸	Thor Labs	LFG3P	3 μm 砂砾
抛光纸	Thor Labs	LFG1P	1 μm 砂砾
抛光纸	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm 砂砾
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
氢氧化钾	Fisher Scientific	P5958
甲烷磺酸钾	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
瑞马度（卡洛芬）	Henry Schein	24751
自我给药实验舱/软件	Med Associates	MED-NP5L-D1
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	1064980500
L-抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich	A7631
戊巴比妥钠	Henry Schein	24352
磷酸钠	Sigma-Aldrich	S9638
磷酸肌酸钠	Fisher Scientific	P7936
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256
不锈钢机螺钉	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm 机械螺钉，圆头，十字槽，A2 不锈钢，未处理，3 mm 长度
用于套管的立体定位适配器	Thor Labs	XCL
立体定位仪	斯托尔廷	51603
蔗糖	Sigma-Aldrich	S8501
缝合线	精细科学工具	18020-50	丝线；规格：5/0，直径：0.12 mm
TEA-氯化物	Fisher Scientific	T2265
硫脲	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond 组织粘合剂	Covetrus	001505
振动切片机	Leica	VT1200S
赛拉嗪	Butler Schein	33198