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方法文章

利用光遗传学逆转神经可塑性并抑制大鼠的可卡因觅药行为

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⸱

DOI：

10.3791/63185

⸱

2021年10月5日

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Psychiatry, Rutgers University

本文内容

摘要

本文所述方法介绍了一种用于在大鼠行为相关神经环路中光遗传学逆转可卡因诱导的突触可塑性的实验流程。对丘脑-杏仁核突触进行持续的低频光刺激可诱导长时程抑制（LTD）。 在体 在可卡因暴露过的大鼠中，光遗传学诱导的LTD导致随后的线索驱动型觅药行为减弱。

摘要

本方案演示了利用光遗传学工具逆转大鼠丘脑-杏仁核环路中可卡因诱导的突触可塑性，从而减少后续可卡因觅药行为的具体步骤。在我们的研究中发现，当大鼠在视听线索配对下自我注射静脉内可卡因时，随着线索-可卡因关联的学习，丘脑内侧膝状体核（MGN）向侧杏仁核（LA）主神经元的突触输入会增强。我们假设，若能逆转这些突触上由可卡因引起的可塑性变化，便可降低由线索驱动的可卡因觅药行为。为了在活体（in vivo）条件下实现此类神经调控，我们旨在诱导突触长时程抑制（LTD），以减弱MGN-LA突触的强度。为此，我们采用了光遗传学技术，该技术可通过光来调控脑环路。通过将携带兴奋性视蛋白oChiEF的腺相关病毒（AAV）注入MGN，使oChiEF在LA中的MGN突触前末梢表达。随后，在LA区域植入光纤，并以1 Hz的频率脉冲式照射473 nm激光，持续15分钟，以诱导LTD并逆转可卡因引起的突触可塑性变化。该干预可长期降低与可卡因相关线索诱发药物寻求行为的能力。

引言

药物滥用是美国乃至全球极为严重的公共卫生问题。尽管经过数十年的深入研究，目前仍缺乏有效的治疗手段1,2。治疗的一大障碍在于，长期用药会形成药物与环境线索之间的持久关联性记忆。再次接触与药物相关的线索会引发生理和行为反应，从而促使药物持续使用并导致复吸3。一种新型的治疗策略是采用基于记忆的干预方法，旨在调控参与药物-线索关联的神经环路。最近研究发现，外侧杏仁核（LA）的突触，特别是来自丘脑内侧膝状体核（MGN）的突触，在反复与线索关联的可卡因自我给药后会增强，且这种突触增强可支持可卡因觅药行为4,5。因此，有研究提出，通过逆转MGN-LA突触的可塑性变化，可能减弱由线索诱发的复吸行为。

精确靶向特定脑回路突触可塑性的能力一直是该领域面临的主要挑战。传统的药理学工具在减少复吸行为方面已取得一定成效，但受限于无法调控单个突触。然而，近年来的进展 体内 光遗传学提供了克服这些局限性所需的工具，能够以时间和空间上的精确性控制神经通路6,7,8通过在特定脑回路中表达光敏感视蛋白，可利用激光激活或抑制该回路。借助频率依赖性光刺激，可在行为动物中特异性调控该回路的突触可塑性。

本手稿概述了使用体内光遗传学技术操控与行为相关的MGN-LA环路的实验步骤。首先，在MGN中表达兴奋性视蛋白oChIEF，并在LA中双侧植入光纤。随后，训练动物以依赖线索的方式自我给予可卡因，从而增强MGN-LA通路。接着，使用473 nm激光进行持续的低频刺激，以诱导环路特异性的长时程抑制（LTD）。逆转由可卡因使用所引起的突触可塑性变化后，显著降低了线索触发与觅药行为相关动作的能力，且该效应持久存在。

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方案

本协议中描述的实验均符合美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）制定的指南。 实验动物护理和使用指南 并经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准。所有操作均使用成年、未经处理的Sprague-Dawley大鼠进行，大鼠到达时体重为275–325 g。

1. 光纤植入物和连接线的构建

  1. 按照先前发表的方案制备光纤植入物9。本方案中描述的实验使用了200 µm纤芯（0.5 NA）的光纤和Ø1.25 mm多模LC/PC陶瓷插芯，孔径为Ø230 µm。
    1. 使用Dremel工具在插芯的下三分之一处（靠近插芯平面端的一侧）进行划痕处理。对插芯进行划痕有助于其牢固地附着于牙科水泥，从而提高在整个实验过程中保持稳定的概率。
    2. 使用剪线钳剪取约35 mm长的光纤。使用光纤剥线工具剥去约25 mm的涂覆层，保留10 mm未剥除部分。
    3. 根据制造商说明配制热固性环氧树脂。将1 g树脂粉末溶解于100 mg固化剂中。将钝化的25号针头连接至1 mL注射器上，用注射器吸取环氧树脂，并安装钝化针头尖端。
    4. 使用台钳或夹具将插芯固定，确保平面朝上、凸面朝下。用装有环氧树脂的注射器在插芯的平面端滴加一滴环氧树脂，注意擦去插芯侧面多余的环氧树脂。
    5. 将已剥除涂覆层的光纤部分穿过插芯，使额外露出约5 mm的裸露光纤。对于LA植入物，光纤将植入到前囟腹侧7.9 mm处，因此未剥除涂覆层的光纤暴露长度应约为13 mm。
    6. 使用热风枪加热固化环氧树脂，持续约30–40秒，直至其颜色变为黑色或琥珀色。
    7. 使用金刚石刀片在插芯凸面端与光纤交界处对光纤进行划痕，并用手指轻轻敲击使光纤断开。
    8. 用止血钳夹住插芯的凸面端进行抛光，确保施加均匀压力，并依次在一系列由高至低粒度（5、3、1、0.3 µm）的抛光纸上各做20次圆形旋转抛光。
    9. 用胶带将未剥除涂覆层的光纤固定在桌面上，对已剥除部分的光纤进行划痕处理，使其超出腹侧坐标2 mm（对于LA植入物，光纤最终长度约为10 mm）。使用止血钳轻拉插芯，使光纤在划痕处均匀断裂。划痕时需小心，避免完全切断光纤，否则会损伤光纤纤芯。
  2. 制备与光纤植入物兼容的跳线电缆。本研究使用了定制设计的跳线电缆（见材料表）。或者，也可依据先前发表的方案9自行制作跳线电缆。
    注意：在耦合连接处，插芯光纤与跳线电缆光纤的直径和数值孔径（NA）必须匹配，以防止光损耗过大，否则可能导致无法充分刺激神经活动。
  3. 通过将跳线电缆或光纤植入物连接至适当的激光光源（473 nm，输出功率1 mW），并使用光传感器测量输出光强，来检测光输出情况。成功制备的光纤应能发射出同心圆状的光斑，且光损耗不超过30%。

2. 啮齿类动物静脉插管、病毒递送和光纤植入

  1. 准备动物以进行手术。
    1. 根据机构指南，使用合适的麻醉剂对大鼠进行完全麻醉。一种可选方案是盐酸氯胺酮（87.5–100 mg/kg，肌内注射）与盐酸赛拉嗪（5 mg/kg，肌内注射）。通过检测足趾夹捏反射是否消失，确认大鼠已完全麻醉。
      警告：氯胺酮为管制药品，必须根据机构规定进行操作。 
      注意：麻醉剂的肌内注射 本研究采用该方法，因其麻醉诱导速度更快、效果更可靠，优于腹腔注射。手术过程中需持续监测大鼠的呼吸频率及反应性，并全程提供保温支持。 
    2. 剃除大鼠背部大片区域的毛发（从肩胛骨上方至背部中段），以及右侧前肢下方的颈部区域和头皮部位。
    3. 将大鼠置于手术区域，并在眼睛上涂抹Puralube（人工泪液）。通过背部上方皮肤皮下注射（s.c.）按体重计算剂量的卡洛芬（carprofen，镇痛剂），然后通过背部下方皮肤皮下注射5 mL乳酸林格氏液。
    4. 使用无菌纱布蘸取聚维酮碘，在剃毛后的手术区域以打圈方式擦拭，对所有手术部位进行消毒。随后用70%乙醇重复此操作。重复交替使用聚维酮碘和70%乙醇消毒三次。 
  2. 根据已发表的方案进行静脉导管植入4,10.
    注意： 手术巾是 手术过程中未使用以避免导管植入时产生刺激。对所有器械和设备进行灭菌 使用前请佩戴无菌手套，若接触到任何非无菌表面，须立即更换手套。
  3. 导管植入后，立即将大鼠固定于立体定位仪中，以进行 AAV 注射。
    1. 在头皮部位皮下注射2%利多卡因（0.2–0.3 mL）作为局部麻醉。
      注意：在静脉导管植入过程中不使用局部麻醉，以避免对手术结果产生影响。 
    2. 将一根26号不锈钢注射套管连接至已装入1 µL浓缩AAV溶液的Hamilton注射器：AAV5-hSyn-tdTomato或AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      注意：oChIEF 是对蓝光敏感的视蛋白通道视紫红质（ChR2）的一种变体，可响应较宽范围的频率8,11，因此不仅适用于本方案中讨论的低频长时程抑制（LTD）实验，也适用于高频长时程增强（LTP）实验（本文未讨论）。oChIEF 载体由 Roger Tsien 博士惠赠，并由杜克大学病毒载体核心实验室进行包装与纯化。从注射日至LTD诱导日之间至少需要间隔3-4周，以确保内侧膝状体（MGN）轴突末梢中的病毒表达达到最佳水平。
      警告：通常情况下，腺相关病毒（AAV）被视为生物安全等级1级（BSL-1）生物体，在无辅助病毒参与其生产的情况下，自感染风险较低。其使用需获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并须始终根据机构指南穿戴适当的个人防护装备（PPE），以避免不必要的暴露。
    3. 使用解剖刀从颅骨前部向后部做一长度为0.5 mm的切口，并去除覆盖的组织以暴露颅骨表面。
    4. 将大鼠头部在前后轴上调平，并将立体定位坐标归零至前囟。
    5. 使用配备小型钻头的Dremel工具在颅骨上钻三个小孔。用螺丝刀将不锈钢螺丝（M2x4 965-A2）牢固地固定在孔中。
      注意：螺钉对于牙科水泥的充分粘合以及坚固、持久的头帽的形成至关重要。螺钉的位置应分布于颅骨的前后轴方向，并远离AAV注射位点。
    6. 根据《大鼠脑图谱》（Watson 和 Paxinos）提供的坐标，钻取双侧注射 AAV 的孔洞12 用于内侧膝状体核（MGN）内侧部；以颅骨缝交点为基准，坐标为：前后向（AP）-5.4 mm；左右向（ML）±3.0 mm；背腹向（DV）-6.6 mm。以4 mm/min的缓慢速度将注射套管插入，直至定位至MGN。以0.1 µL/min的速率注入浓缩的AAV溶液。
    7. 输注完成后，将注射套管留在原位5分钟，以使液体充分从套管周围扩散，然后缓慢将套管从脑组织中撤出。
  4. 病毒注射后立即继续植入光纤4,9 靶向MGN-LA神经末梢。
    1. 使用Dremel工具在双侧钻孔，用于靶向侧杏仁核的光纤植入（以bregma为参考，单位：mm，AP：-3.0；ML：±5.1）。
    2. 使用镊子夹住光纤植入物的套管，并将其固定在立体定位仪适配器上，以确保其牢固固定。
    3. 以 2 mm/min 的速度缓慢降低光纤，直至光纤尖端位于LA的背侧部分（DV：-7.9 mm）。
    4. 先用一层薄薄的Loctite瞬干胶将套管固定在颅骨上，再用牙科水泥加固，然后套上直径为1.25 mm的套管护套和防尘盖。
      注意：用于将套管固定在颅骨上的粘合剂的选择应 获得当地或机构的批准 动物护理与使用委员会。本研究通过多种粘合剂的反复试验，最终选用Loctite以可靠地将套管固定于颅骨上；然而，也可考虑使用其他可选替代品。 
  5. 手术后单独饲养大鼠，并提供自由获取的食物和水。根据机构指南进行术后护理。每天用含有庆大霉素（5 mg/mL）和肝素（30 USP/mL）的生理盐水冲洗导管，以保持通畅。术后至少5天，并在行为学实验开始前24小时，将大鼠的食物限制至其自由进食体重的约90%。

3. 啮齿类动物可卡因自我给药与操作性杠杆消退

注意：所有行为学实验均在标准的操作式条件反射箱中进行，箱体内一侧壁上装有两个可伸缩的杠杆，每个杠杆上方设有刺激灯，另配有音调发生器、箱内照明灯以及输注泵。

  1. 在固定比率1（FR1）强化程序下，每天对大鼠进行1小时的可卡因（2 mg/mL）自我给药训练。
    1. 每天将大鼠放入操作箱中，允许其按压杠杆。按压指定的“活动杠杆”（在左右杠杆之间平衡分配）会触发一次可卡因输注（1.0 mg/kg/次）并伴随一个复合的灯光和声音信号，持续10秒。按压指定的“非活动杠杆”则无任何程序设定的后果。
    2. 自我给药实验至少持续10天，直至大鼠连续3天每天成功获得至少8次输注。若在第20天仍未达到习得标准，则该大鼠被排除出研究。
  2. 在成功达到习得标准后，对大鼠进行每日1小时的工具性消退训练，持续6至10天。
    1. 将大鼠放入操作箱中，允许其自由按压杠杆。但此时按压活动杠杆和非活动杠杆均不再产生任何程序设定的结果。
    2. 持续每日进行工具性消退训练，直至大鼠连续两天的平均按压次数<25次。

4. 在体内的 光遗传学诱导的长时程抑制

注意：光遗传学抑制实验在工具性消退训练最后一天后的 24 小时进行。

  1. 将光纤跳线连接至473 nm蓝色激光二极管，并通过悬挂在清洁的标准啮齿类动物饲养笼（移除笼盖）上方的旋转接头固定。该装置可使啮齿类动物在光遗传学刺激期间自由活动于笼内。
  2. 根据操作说明开启激光二极管，并连接至脉冲发生器。调节参数，使开启后大鼠接受900次、每次2 ms、频率为1 Hz的光脉冲刺激。
    警告：操作激光时必须始终佩戴适当的眼部防护装备。
  3. 使用光传感器测量通过光纤跳线的光强度。调节激光强度，使光纤跳线输出的光强约为5–7 mW。
  4. 将大鼠放入清洁的饲养笼中。移除防尘盖和光纤连接套管，暴露陶瓷插芯。将光纤跳线双侧连接至光纤植入物。在长时程抑制（LTD）诱导前，让大鼠在环境中自由探索3分钟。
  5. 开启脉冲发生器以启动光遗传学刺激。
    注意：尽管可能性极低，若大鼠对刺激出现任何不良反应，应立即终止实验，并根据机构指南对大鼠实施安乐死。
  6. LTD诱导完成后，将大鼠继续留在笼中3分钟，随后放回其原饲养笼。
  7. 对照实验中，对表达AAV5-tdTomato对照病毒的大鼠采用相同的刺激程序。假刺激实验中，将光纤跳线连接至表达AAV5-oChIEF病毒的大鼠的光纤植入物，但在15分钟实验期间不给予任何刺激。

5. 测试光遗传学刺激对提示诱发的可卡因觅药行为的影响

  1. 在体内光遗传学刺激后24小时，将大鼠重新放入操作性条件反射箱中。对大鼠进行持续1小时的标准线索诱导复吸实验，以评估可卡因觅药行为。
    注意：在线索诱导复吸期间，按压主动杠杆会触发持续10秒的与可卡因相关的线索呈现，但不会给予可卡因输注。
  2. 在第一次测试至少1周后进行第二次复吸测试，以确定光遗传学诱导的长时程抑制（LTD）是否导致可卡因觅药行为的长期抑制

6. 染色、荧光及成像用于病毒表达与光纤植入位置的组织学验证

  1. 配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）和4%多聚甲醛（PFA），将两种溶液均置于冰上保存。总体积取决于实验中大鼠的数量（每只大鼠约需100 mL PBS和200 mL PFA）。
    警告：PFA 是一种有毒化学物质，且为已知致癌物。操作时需注意避免吸入以及皮肤接触。其使用和处置应遵循机构相关规定，包括佩戴适当的个人防护装备（PPE）并在化学通风橱中操作。
  2. 将蠕动泵设置为流速20 mL/min。用1×PBS填充泵的管路。在管路末端连接一支钝头20号针头。
  3. 用戊巴比妥钠（100 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行深度麻醉。通过观察其对刺激无反应来确认麻醉深度。 在继续操作前进行足趾捏压检查。
    注意：使用戊巴比妥钠是因为灌注过程需要 一种终末性操作程序。
  4. 使用手术剪在膈膜下方剪开大鼠的腹腔。沿两侧边缘向前方剪开肋骨，暴露大鼠心脏。用止血钳将肋骨前部夹起并远离心脏。剪除覆盖在心脏周围的脂肪组织。
  5. 将钝化针头插入左心室并向上推进至主动脉。在右心房剪一个小孔，以排出回流至心脏的液体。
  6. 用1×PBS对每只大鼠灌注5分钟，随后用pH 7.4的4% PFA灌注10分钟。
  7. 将大鼠断头，取出脑组织，用4% PFA后固定24 h，随后将脑组织转移至30%蔗糖溶液中浸泡2–3 d。
  8. 使用冷冻切片机将脑组织切成50 µm的切片。
  9. 将包含LA或MGN的所有切片贴附于玻璃载片上并加盖盖玻片。
  10. 使用落射荧光显微镜对图像切片进行观察，以验证AAV-oChIEF-tdTomato在内侧膝状体（MGN）中的表达及其向外侧杏仁核（LA）的投射，同时确认光纤放置位置位于LA上方。

7. 电生理实验用灌注及急性脑切片制备

注意：为验证实验动物造模的成功性，仅对部分动物进行电生理学实验。 体内 有限公司

  1. 使用 表1-34,13 中列出的试剂配制电生理溶液。用 HCl 将所有溶液的 pH 值调节至 7.4，并将渗透压调整为 300–310 mOsm/kg H2O。实验前新鲜配制溶液，并在 4 °C 下保存，最多可保存 1 周。使用过程中始终用碳氧混合气体（95% O2/5% CO2）饱和所有溶液。
  2. 根据当地或机构动物护理与使用 指南，使用异氟烷在封闭的安乐死室中对大鼠进行深度麻醉。 通过脚趾夹捏反射确认动物已完全麻醉。
  3. 用 50 mL 冰冷切割液填充一个小烧杯。用溶液填充蠕动泵的管路，并将流速调节至 20 mL/min。在管路末端连接一个钝化的 20 号针头。
  4. 打开腹腔（见步骤 6.4 和 6.5），短暂灌注切割液（最多 1–2 分钟）。
  5. 灌注后立即断头处死大鼠。取出脑组织并放入盛有 4 °C 切割液的小烧杯中，浸泡 30 秒至 1 分钟。
  6. 用刮铲转移脑组织，并迅速将其固定在振动切片机的切片槽中。用精细镊子去除软脑膜。向切片槽中加入 4 °C 切割液，以 0.37 mm/sec 的速度和 70 Hz 的频率制备杏仁核的急性冠状面切片（厚度为 250 µm）。
  7. 获得切片后，立即将每一片放入盛有切割液的孵育槽中，在 37 °C 下孵育 10–12 分钟。每只动物可获得约 5–7 片包含侧杏仁核（LA）的切片。
  8. 将切片转移至盛有室温（RT）孵育液的烧杯中，在实验前使其恢复至少>30 分钟。
    ​注意：切片在孵育液中通常可保持健康状态 4–6 小时。由于 AAV 具有荧光特性，切片需置于低光照条件下。

8. 离体 电生理记录

  1. 使用表4-5中列出的试剂配制细胞内溶液。
    注意：细胞内溶液应在实验前预先配制，可长期保存（3-12个月）于-80 °C，或短期保存（1-2个月）于-20 °C。用CsOH调节含铯细胞内溶液的pH至7.3，用KOH调节含钾细胞内溶液的pH至7.3。最终渗透压调整为290-300 mOsm/kg H2O。
  2. 用二甲基亚砜（DMSO）配制500 mM的毕叩毒素（picrotoxin）储备液。
    注意：毕叩毒素储备液应分装后于-20 °C保存。使用当天将分装样品解冻，并加入记录液中至终浓度为100 µM。
    警告：毕叩毒素是GABAA受体的非竞争性拮抗剂，因此灌注毕叩毒素具有兴奋作用。该物质经口摄入或皮肤吸收均具有严重毒性。操作毕叩毒素时必须始终穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
  3. 将脑片转移至专为电生理实验设计的 upright 显微镜上。
  4. 实验过程中，持续用加热至31-33 °C的记录液对脑片进行浴槽灌流。
  5. 使用4x物镜放大外侧杏仁核（LA）区域，再通过40x水浸物镜根据形态学特征识别主神经元。
  6. 使用玻璃电极（3-5 MΩ），内充含铯的细胞内溶液（用于电压钳实验）或含钾的细胞内溶液（用于电流钳实验），获取全细胞膜片钳记录。
  7. 在荧光显微镜下（使用RFP滤光片）识别AAV感染的MGN轴突投射，并通过连接脉冲发生器的蓝色激光（473 nm）激发光源刺激这些投射。
    警告：为减少激光暴露，准直激光束应耦合至显微镜的荧光端口，并通过物镜聚焦照射到脑片上。
    注意：在电压钳模式下，以0.1 Hz频率光刺激诱发兴奋性突触后电流（EPSCs）。接收来自AAV感染的MGN神经元输入的神经元将表现出可靠的EPSCs。
  8. 为诱导离体（ex vivo）长时程抑制（LTD），在电流钳模式下，首先以0.1 Hz频率连续记录至少10分钟的兴奋性突触后电位（EPSPs）作为稳定基线。随后施加900次、每次2毫秒的473 nm光刺激，频率为1 Hz（总时长=15分钟）。之后继续以0.1 Hz频率记录EPSPs，持续≥60分钟。

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结果

实验顺序的时间线如图1所示。在整个行为实验过程中，可卡因输注次数以及在主动杠杆上的反应次数用于衡量可卡因觅药行为的强度。在可卡因自我给药的最初几天，主动杠杆反应次数应在每次获取阶段逐渐增加，并在第二周趋于稳定。相反，非主动杠杆的反应次数在整个实验过程中应始终保持较低水平（图2A）。在工具性消退的第一天，由于未预期到可卡因的缺失，通常会出现主动杠杆反应次数的短暂上升，导致可卡因觅药行为增强。然而，随着大鼠逐渐学习到新的反应结果关联，该反应在随后的训练阶段会逐步减少，通常在6–10天内达到较低且稳定的主动杠杆反应水平（图2B）。在自我给药或工具性消退阶段未能达到规定获取标准的大鼠将被剔除出研究，其数据不纳入最终分析。

在工具性消退后，重新暴露于与可卡因相关的线索会恢复可卡因寻求行为，导致主动杠杆按压次数增加。该现象在两组对照实验中均被观察到：注射了不含oChIEF的病毒（AAV对照）的大鼠，以及未接受激光刺激...

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讨论

如上所述，有多个关键步骤对于获得正确的实验结果至关重要。该方案可能仅对成功建立可卡因自给行为的动物有效，迄今为止，仅使用上述参数进行过测试。可卡因剂量、强化程序以及线索参数可能在不影响行为结果的前提下进行调整，但需注意，二级强化程序可能导致与杏仁核无关的可卡因寻求行为，从而可能降低该操作的效果，尽管这一点尚未被直接验证14。在整个实验流程中，有多个环节需要验证光纤构造的正确性及其功能，以确保光刺激的成功实施。必须正确刻痕光纤套管以防止其从头帽脱落，并对光纤进行抛光处理，同时检测植入物的光输出损耗不得超过30%9。此外，激光刺激参数也是重要的考虑因素。激光应以相对较低的功率（5–7 mW）运行。采用持续性低频刺激以诱导长时程抑制（LTD），其功能性效果可通过电生理记录测量MGN-LA突触强度来验证。最后，实验结果表明，在每组最终n=10只动物的情况下，线索诱导的复吸行为显著减少；然而，实验者应预计初始样本量需更大，因为部分动物可能需在最终分析中被排除。至关重要的是，必须验证病毒和光纤在解剖学上的正确位置及表达情况，并且仅使用经组织学确认无误的动...

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披露

无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者希望感谢以下资助：美国公共卫生服务基金 K01DA031745（MMT）、R01DA042029（MMT）、DA035805（YHH）、F31DA039646（MTR）、T32031111（MTR）以及宾夕法尼亚州卫生部。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液Fisher ScientificNC0291799
A.M.P.I. 刺激隔离器Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato杜克大学病毒载体中心（通过 Roger Tsien）#268参见 Lin 等，2009；Nabavi 等，2014
AAV5.hSyn.tdTomato（对照）杜克病毒载体核心对照参见 Lin 等，2009；Nabavi 等，2014
人工泪液（眼用软膏）Covetrus70349
ATP 镁盐Fisher ScientificA9187
聚维酮碘Butler Schein38250
氯化钙Fisher ScientificC1016
氯化铯Fisher Scientific289329
氢氧化铯Fisher Scientific516988
甲基磺酸铯Fisher ScientificC1426
盐酸可卡因美国国家药物滥用研究所药物供应中心9041-001
冷冻切片机LeicaCM1950
D-葡萄糖Sigma-AldrichG8270
DMSOFisher ScientificBP231-1
双通道温度控制器Warner InstrumentsTC-344C
EGTAFisher ScientificE3889
乙醇匹兹堡大学化学试剂库200C5000
套管防尘帽Thor Labs中国台湾用于1.25 mm尾纤套管的白色塑料防尘帽
套管对接套筒Doric LensesF210-3011Sleeve_BR_1.25，青铜，内径 1.25 mm
卡套Precision Fiber ProductsMM-FER2007C-2300Ø1.25 mm 多模 LC/PC 陶瓷插芯 Ø230 μm 孔径大小
光纤Thor LabsFP200URT200 μm 芯多模光纤（0.5 数值孔径）
光纤旋转接头Prizmatix（从亚马逊订购）18 mm 直径，用于光纤的 FC-FC 连接器
光纤剥除工具Thor LabsT12S21
含DAPI的FluoroshieldSigma-AldrichF6057
庆大霉素Henry Schein6913
GTP 钠盐Fisher ScientificG8877
哈密顿注射器Hamilton8008510 μL 体积，26 号，2 英寸，3 型针尖
热风枪Allied Electronics972-6966250 V，750-800 °F
可热固化的环氧树脂Precision Fiber ProductsPFP-353ND-8OZ
肝素Henry Schein55737
HEPESSigma-AldrichH3375
盐酸Fisher Scientific219405490
异氟烷Henry Schein29405
盐酸氯胺酮Henry Schein55853氯胺酮是一种管制物质，应根据机构指南进行操作和管理
乳酸林格液’sHenry Schein9846
激光器、驱动器和激光到光纤耦合器OEM 激光系统BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0100 mW，473 nm，二极管泵浦固体激光器（一种可选方案）
L-谷胱甘肽Fisher ScientificG4251
利多卡因Butler Schein14583
光传感器Thor LabsPM100D带数字显示屏的紧凑型能量计控制台
Loctite 瞬干胶格雷格纳5E207
硫酸镁Sigma-Aldrich203726
微电极放大器/数据采集Molecular DevicesMULTICLAMP700B / Digidata 1440A
显微注射泵哈佛仪器70-4501双注射器
显微操作仪Sutter InstrumentsMPC-200/ROE-200
显微镜奥林巴斯BX51WI用于电生理学的直立显微镜
显微镜奥林巴斯BX61VS荧光显微镜载玻片扫描仪
N-甲基-D-葡糖胺Sigma-AldrichM2004
Orthojet 牙科水泥，液体朗氏牙科1504BLK黑色
Orthojet 牙科水泥，粉末朗氏牙科1530BLK现代粉末，黑色
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
跳线电缆Thor LabsFP200ERT多模式 FT030 管路
苦味毒剂Fisher ScientificAC131210010
抛光盘Thor LabsD50FC
抛光垫Thor LabsNRS9139" x 13"
抛光纸Thor LabsLFG5P5 μm 砂砾
抛光纸Thor LabsLFG3P3 μm 砂砾
抛光纸Thor LabsLFG1P1 μm 砂砾
抛光纸Thor LabsLFG03P0.3 μm 砂砾
氯化钾Sigma-AldrichP9333
氢氧化钾Fisher ScientificP5958
甲烷磺酸钾Fisher Scientific83000
QX-314-ClAlomone LabsQ-150
瑞马度（卡洛芬）Henry Schein24751
自我给药实验舱/软件Med AssociatesMED-NP5L-D1
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
氯化钠Sigma-AldrichS7653
氢氧化钠Sigma-Aldrich1064980500
L-抗坏血酸钠Sigma-AldrichA7631
戊巴比妥钠Henry Schein24352
磷酸钠Sigma-AldrichS9638
磷酸肌酸钠Fisher ScientificP7936
丙酮酸钠Sigma-AldrichP2256
不锈钢机螺钉WW Grainger 6GB25M2-0.40mm 机械螺钉，圆头，十字槽，A2 不锈钢，未处理，3 mm 长度
用于套管的立体定位适配器Thor LabsXCL
立体定位仪斯托尔廷51603
蔗糖Sigma-AldrichS8501
缝合线精细科学工具18020-50丝线；规格：5/0，直径：0.12 mm
TEA-氯化物Fisher ScientificT2265
硫脲Sigma-AldrichT8656
Vetbond 组织粘合剂Covetrus001505
振动切片机LeicaVT1200S
赛拉嗪Butler Schein33198

参考文献

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利用光遗传学逆转神经可塑性并抑制大鼠的可卡因觅药行为
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