Masarimycin的合成：一种革兰氏阳性菌生长的小分子抑制剂

摘要

本文提供了一种制备抑菌性二酰胺类化合物马萨里霉素的详细方案，该小分子探针通过靶向细胞壁降解来抑制枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的生长。文中展示了其作为化学探针在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和肺炎链球菌（S. pneumoniae）中的协同/拮抗作用实验及形态学研究中的应用。

摘要

细菌细胞壁中的肽聚糖（PG）是一种独特的高分子结构，赋予细胞特定形态并提供对外界环境的保护。要理解细胞生长与分裂，关键在于了解PG降解如何影响其生物合成及细胞壁组装过程。近年来，已有通过引入修饰的糖类或氨基酸对PG进行代谢标记的研究报道。尽管可利用小分子抑制剂对生物合成步骤进行化学干预，但用于研究自溶素介导的PG降解的化学生物学工具仍较为匮乏。细菌自溶素是一类广泛存在的酶，参与肽聚糖高度协调的降解过程。本文提供了一种小分子探针masarimycin的详细制备方案，该探针为N-乙酰葡糖胺酶LytG的抑制剂 枯草芽孢杆菌， 以及细胞壁代谢在 肺炎链球菌抑制剂的制备 通过 提供了微波辅助与经典有机合成方法。阐述了其作为研究革兰氏阳性菌在生物学测定中生理学特性的工具的适用性。

引言

肽聚糖（PG）是一种网状聚合物，在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均能界定细胞的形态与结构^1,2该杂聚物是由短肽交联的氨基糖组成的基质。^3,4,5,6 由交替连接的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）通过β-(1,4)糖苷键组成的骨架结构（图1)¹连接在MurNAc的C-3乳酸基团上的是肽桥。肽聚糖的代谢涉及一套高度协调的生物合成与降解酶系统，以将新组分整合到细胞壁中^7,8PG的降解由一类统称为自溶素的酶来完成⁹ 并根据所断裂的化学键特异性进一步分类。自溶素参与多种细胞过程，包括细胞生长、细胞分裂、运动性、肽聚糖成熟、趋化性、蛋白质分泌、遗传感受态、分化以及致病性^10,

方案

1. 通用方法

注意：所有化合物均购自常规供应商，未经进一步纯化即直接使用。

1. 在预涂硅胶 XG F254 的铝板上进行薄层色谱（TLC）分析。通过紫外灯下观察或浸入显色剂中检测斑点 p-anisaldehyde 染色，或通过暴露于 I₂ 蒸气
2. 在400 MHz波谱仪上记录所有核磁共振（NMR）谱图。
   注意： ¹氢-核磁共振（H-NMR）和 ¹³C-NMR 谱以残留溶剂峰为参照。耦合常数以 [Hz] 表示，化学位移以 [ppm] 表示。
3. 使用配备大气压固体分析探针的紧凑型质谱仪，记录麻沙米星的大气压化学电离（APCI）质谱图。

2. 马萨里霉素制备的一般步骤

注意：以下步骤需在通风橱中进行。

1. 分别在甲醇中配制每种反应物的 0.1 M 溶液：环己胺、环己基甲醛， o-碘苯甲酸和环己基异氰化物³⁵.
   警告：环己胺、环己基异氰酸酯和环己基甲醛具有可燃性，可引起皮肤腐蚀，并可能导致经口、经皮、吸入或生殖毒性。请将这些化合物远离明火、高温表面及....

结果

马萨里霉素是一种小分子抑菌剂，可抑制 B. subtilis 和 S. pneumoniae 并已被证明可抑制外切型GlcNAcase LytG B. subtilis^35,37 并靶向细胞壁 S. pneumoniae³⁷马萨里霉素可通过经典有机合成或微波辅助有机合成方法高效制备，产率范围为55%–70%。其中，微波辅助合成具有显著缩短反应时间的优势。与传统合成方法需5–6小时相比，微波辅助合成可在2–3小时内完成，同时保持相当的产率。快速柱层析可实现马萨里霉素的高效纯化，获得高纯度产物。补充图1-2）。结构归属来自 ¹H 和 ¹³C NMR 谱图及代表性谱图见于 补充图3-4.

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讨论

马萨里霉素是一种对B. subtilis³⁵ 和 S. pneumoniae³⁷生长具有单微摩尔级抑菌活性的抑制剂。在B. subtilis中，已证实马萨里霉素可抑制GlcNAcase LytG³⁵，而在S. pneumoniae细胞壁中的确切分子靶点尚未被确定³⁷。采用经典有机合成或微波法合成马萨里霉素，均可获得较高产率和高纯度的产物。马萨里霉素产率偏低通常归因于环己基甲醛的氧化。为避免此问题，建议将环己基甲醛在惰性气氛下的干燥器中保存。醛基氧化为相应的羧酸时，可在瓶中观察到白色固体。购买小量环己基甲醛并避免长期储存，可显著减少该问题的发生。

由于存在混合物，马萨里霉素结构的核磁共振归属较为复杂 顺式 和 转 酰胺键的不同形式以及其周围的阻转异构体 o-碘苯基 环结构导致多个.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-碘苯甲酸	SIGMA-ALDRICH	I7675-25G	腐蚀性，刺激性，浅黄色至橙棕色粉末
2-丙醇	SIGMA-ALDRICH	109827-4L	易燃，刺激性，无色液体
乙腈	SIGMA-ALDRICH	34851-4L	易燃，刺激性，无色液体
铝背板硅胶板	Sorbtech	4434126	铝背板上的XG F254硅胶
氘代氯仿	SIGMA-ALDRICH	151823-50G	核磁共振溶剂
紧凑型质谱仪	Advion-Interchim	Advion CMS	配备APCI离子源和常压固体分析探针的紧凑型质谱仪
Corning Costar 96孔平底培养板-无菌	fisher chemical	07-200-90	用于协同/拮抗作用检测
盖玻片	fisher chemical	12-547	用于显微镜观察
环己烷甲醛	CHEM-IMPEX INT'L INC.	24451	易燃，刺激性，无色至粉红色液体
环己基异氰化物	SIGMA-ALDRICH	133302-5G	刺激性，无色液体，具有极难闻的气味
环己胺	SIGMA-ALDRICH	240648-100ML	腐蚀性，易燃，刺激性，无色液体（除非被污染）
乙酸乙酯	SIGMA-ALDRICH	537446-4L	易燃，刺激性，无色液体
闪式硅胶柱（12g）	Advion-Interchim	PF-50SIHP-F0012	用于masarimycin纯化的闪式硅胶柱（12g）套装
甲醛	SIGMA-ALDRICH	F8775-25ML	显微镜固定剂
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H8651-25G	显微镜固定液用缓冲剂
己烷，异构体混合物	SIGMA-ALDRICH	178918-4L	对环境有害，易燃，刺激性，危害健康，无色液体
高性能紧凑型质谱仪	Advion	expression	常压固体分析探针（ASAP），低分辨率
High Vac	eppendorf	Vacufuge plus	利用离心力和温度辅助的真空系统
盐酸	SIGMA-ALDRICH	258148-2.5L	腐蚀性，刺激性，无色液体
盐酸	SIGMA-ALDRICH	320331-2.5L	强酸
浸油	fisher chemical	12-365-19	用于显微镜观察
碘，重升华晶体	Alfa Aesar	41955	对环境有害，刺激性，危害健康，深灰色/紫色晶体
Mestre Mnova	MestreLab Research		核磁共振谱图处理软件
甲醇	SIGMA-ALDRICH	439193-4L	易燃，有毒，危害健康，无色液体
亚甲蓝	SIGMA-ALDRICH	M9140-25G	用于细胞壁染色的显微镜染料
含5%绵羊血的Mueller-Hinton琼脂平板	fisher chemical	B21176X	肺炎链球菌的培养基
Mueller-Hinton肉汤	fisher chemical	DF0757-17-6	肺炎链球菌的培养基
显微镜载玻片	fisher chemical	22-310397	用于显微镜观察
微波合成实验室工作站	MILESTONE	START SYNTH	需在通风橱中使用的设备，配备合成转盘
核磁管	SIGMA-ALDRICH	Z562769-5EA	5 mm 核磁管，600 MHz
核磁共振（NMR）	Bruker	Ascend 400	大型超导磁体（400 MHz）
奥普托欣	fisher chemical	AAB21627MC	盐酸乙基氢可酮
培养皿	Celltreat	229695	用于制备细菌培养用琼脂平板
Primo Star明场/相差显微镜，配备ERc5s相机	Zeiss		用于形态学研究
puriFlash	interchim	XS520plus	快速色谱纯化系统
刃天青	SIGMA-ALDRICH	R7017-1G	用于协同/拮抗作用检测
旋转蒸发仪	Heidolph	Hei-VAP Value "The Collegiate"	溶剂蒸发装置
碳酸氢钠	SIGMA-ALDRICH	S6014-500G	刺激性，白色粉末
氯化钠	fisher chemical	S271-1	晶体状，无色
氯化钠	SIGMA-ALDRICH	S5886-500G	用于枯草芽孢杆菌的培养和LB培养基的制备
硫酸钠	SIGMA-ALDRICH	7985592-500G	无水，颗粒状，白色
胰蛋白胨	fisher chemical	BP1421-500	用于枯草芽孢杆菌的培养和LB培养基的制备
Whitney DG250工作站	Microbiology International	DG250	厌氧工作站。使用的厌氧气体混合物：5% 氢气，10% 二氧化碳，其余为氮气
酵母提取物	fisher chemical	BP1422-500	用于枯草芽孢杆菌的培养和LB培养基的制备
Zen Lite（蓝色）软件	Zeiss		用于获取显微图像