为了获得无菌昆虫，需对其卵表面进行消毒，孵化后的幼虫随后使用无菌叶片进行饲养。该方法为无菌昆虫的制备提供了一种高效途径，无需使用抗生素或开发人工饲料，也可应用于其他食叶昆虫。
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本文内容
摘要
摘要
昆虫肠道被多种细菌定植，这些细菌可显著影响宿主的生理特征。将特定菌株引入无菌昆虫体内，是验证肠道微生物功能并阐明肠道微生物与宿主相互作用机制的有力方法。施用抗生素或对虫卵表面进行灭菌是去除昆虫肠道细菌常用的两种方法。然而，除了抗生素可能对昆虫产生不良影响外，先前的研究表明，饲喂抗生素并不能完全清除肠道细菌。因此，通常采用无菌人工饲料来维持无菌昆虫，但这一过程繁琐且劳动密集，并不能完全模拟天然食物中的营养成分。本文所述为一种高效、简便的制备和维持叶甲无菌幼虫的实验方案。 关键词：昆虫肠道，肠道微生物，无菌昆虫，叶甲，无菌幼虫，人工饲料 (Plagiodera versicolora）。具体而言，对甲虫卵表面进行灭菌处理，随后使用无菌的杨树叶饲养无菌幼虫。昆虫的无菌状态通过依赖培养和非依赖培养的检测方法进一步验证。综上，通过结合卵表面消毒与无菌培养技术，建立了一种高效且便捷的获取无菌昆虫的方法 P. versicolora为其他食叶昆虫提供了一种易于转化应用的工具。
引言
与哺乳动物类似，昆虫的消化道是食物消化与吸收的腔室。大多数昆虫肠道内定植着多种共生细菌，这些细菌依赖宿主提供的营养在肠道中生长繁殖1。肠道共生菌群对昆虫的多种生理过程具有深远影响，包括食物消化与解毒2,3,4、营养与发育5,6,7、抵御病原体与寄生生物8,9,10,11、化学通讯12,13以及行为调控14,15。有趣的是，某些肠道微生物在特定条件下可转变为兼性致病菌，或被入侵的病原体所利用从而加重感染，表明肠道细菌在某些情况下可能....
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方案
1. 昆虫饲养
- 维持 的 P. versicolora 在27 °C、相对湿度70 ± 5%、光周期16小时光照/8小时黑暗的培养室条件下饲养种群。将昆虫置于底部打孔的塑料盒中，盒内铺有湿润的吸水纸并提供新鲜的杨树枝条作为食物。定期向吸水纸喷洒清水以保持湿度，每两天更换一次枝条。
- 羽化后将成虫隔离进行产卵，饲以嫩叶以获得更多的卵。
- 收集24小时内新产的卵。将卵置于湿润的吸水纸上孵化60小时，以获得无菌幼虫。
注意：新产的卵约72小时后孵化。对卵表面进行消毒的最佳时间为孵化前一天；否则，成功孵化的卵数量将减少。
2. 无菌杨树培养
- 配制 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基以及 1 mg/mL 的 α-萘乙酸 (NAA) 储备液（参见材料表）。
- 在生物安全操作台中，将 50 µL 的 1 mg/mL NAA 储备液加入 500 mL MS 培养基中，充分振荡混匀，每瓶组织培养容器倒入约 50 mL，静置待其凝固。
- 准备好解剖刀、酒精灯和镊子；在生物安全操作台内，用酒精灯火焰对解剖刀和镊子进行灭菌处理。
- 从生长约 1 个月的杨树幼苗（无菌组织培养苗）....
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结果
生命阶段 P. versicolora 如图所示 图1成年雄性体型小于成年雌性（图1A）。在野外，该甲虫将卵成簇地产在叶片上；此处，四枚卵从叶片上分离下来（图1B）。用于无菌昆虫饲养的杨树茎段和幼苗如图所示 图2. 3号肠道rd 龄幼虫如图所示 图3，肠道节段用白色方括号标记。
尽管在所有无菌组中均未观察到细菌菌落，但在所有常规饲养组中均观察到了细菌菌落（图4），表明以组织培养的杨树叶饲喂的无菌卵孵化出的幼虫体内不含细菌。所有常规培养组均出现约 1,500 bp 的 PCR 条带，而无菌组及阴性对照组中均未观察到条带。图5)，表明.......
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讨论
制备无菌幼虫并通过重新引入特定菌株获得无菌定植幼虫，是阐明宿主-微生物相互作用机制的有力方法。新孵化的幼虫主要通过两种途径获得肠道微生物群：来自母体的垂直传播，或来自兄弟个体及环境的水平获得34。前者可通过亲代将微生物污染至卵表面而实现35。因此，通过对昆虫卵表面进行灭菌来获得无菌幼虫具有很高的可行性27,28,29。使用多种抗生素混合处理是获得无菌昆虫的另一种方法，但存在若干缺点28。相比之下，对卵表面灭菌后辅以无菌饲料，是更优的无菌昆虫培育方法23,28,29。
大多.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（31971663）和中国科协青年人才托举工程（2020QNRC001）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 注射器滤器 | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA 储存液 | a. 配制 0.1 M NaOH 溶液（将 0.8 g NaOH 溶于 200 mL 蒸馏水中）。 b. 取 0.2 g NAA 置于 250 mL 烧杯中，加入少量 0.1 M NaOH 溶液直至 NAA 完全溶解，再用蒸馏水定容至 200 mL。 c. 使用 0.22 µm 注射器滤器和 50 mL 无菌注射器过滤溶液以去除细菌，分装至 1.5 mL 离心管中，并于 -20 °C 保存。 | ||
| 1.5 mL 微量离心管 | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS 储存液 | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH 溶液 | 将 22.44 g KOH（分子量：56.1）溶于 200 mL 蒸馏水中，121 °C 高压灭菌 20 分钟。 | ||
| 250 mL 和 2,000 mL 烧杯 | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL 无菌注射器 | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL 量筒 | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE 储存液 | a. 将 242 g Tris 和 18.612 g EDTA 溶于 700 mL 蒸馏水中。 b. 用约 57.1 mL 冰醋酸调节 pH 至 7.8。 c. 用蒸馏水定容至 1,000 mL。 d. 使用时将储存液稀释为 1x TAE 缓冲液。 | ||
| 75% 乙醇 | Xingheda trade | ||
| α-萘乙酸（NAA） | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| 吸水纸 | 22.3 cm × 15.3 cm × 9 cm | ||
| 冰醋酸 | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| 琼脂 | Coolaber | 9002-18-0 | |
| 琼脂糖 | Biowest | 111860 | |
| 高压灭菌锅 | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| 珠磨式均质仪 | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA 提取试剂盒 | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| 滤纸 | Jiaojie | 直径 70 mm | |
| 凝胶电泳仪 | Bio-rad | 164-5052 | |
| 核酸染料 Gel Signal Green | TsingKe | TSJ003 | |
| 无菌杨树幼苗 | 来自中国山东省鲁东大学的山新杨 | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| 生长培养箱 | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB 琼脂培养基 | a. 将 5 g 胰蛋白胨、5 g NaCl、2.5 g 酵母提取物溶于 300 mL 蒸馏水中。 b. 定容至 500 mL，转移至 1,000 mL 三角瓶中，加入 7.5 g 琼脂。 c. 121 °C 高压灭菌 20 分钟。 | ||
| 小型离心机 | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS 基本培养基 | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| 用于无菌杨树幼苗培养的 MS 固体培养基 | a. 将 4.43 g MS 基本培养基粉末和 30 g 蔗糖溶于 800 mL 蒸馏水中。 b. 使用 pH 计，以 2 M KOH 溶液调节 pH 至约 5.8。 c. 定容至 1,000 mL，均分为两份，分别转移至两个 1,000 mL 三角瓶中，每 500 mL 加入 2.6 g 琼脂。 d. 121 °C 高压灭菌 20 分钟。 | ||
| NanoDrop 1000 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 毛笔 | 宽度 1 cm，用于收集虫卵 | ||
| 封口膜（Parafilm） | Bemis | PM-996 | |
| PCR 扩增仪 | Eppendorf | 6331000076 | |
| 培养皿 | Supin | 直径 90 mm | |
| pH 计 | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| 移液器 0.2–2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| 移液器 100–1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| 移液器 20–200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| 移液器 2–20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| 植物组织培养容器 | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| 塑料盒 | 2.35 L | ||
| 氢氧化钾（KOH） | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| 扩增细菌 16S rRNA 基因的引物 | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’，1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| 氯化钠（NaCl） | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| 氢氧化钠（NaOH） | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| 钢珠 | 0.25 mm | 用于研磨组织 | |
| 体视显微镜 | OLYMPUS | SZ61 | |
| 蔗糖 | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA Marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris 碱 | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| 胰蛋白胨 | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| 紫外透射仪 | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| 涡旋振荡器 | Scilogex | MX-S | |
| 柳树枝条 | 中国武汉沙湖公园 | ||
| 柳叶甲虫 | 中国武汉华中农业大学 | ||
| 酵母提取物 | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
参考文献
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. M....
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