体外 使用分析、下拉和伴侣测定表征组蛋白伴侣

摘要

该协议描述了一系列方法，包括分析体积排阻色谱以研究组蛋白伴侣寡聚化和稳定性，下拉测定以揭示组蛋白伴侣 - 组蛋白相互作用，AUC用于分析蛋白质复合物的化学计量，以及组蛋白伴侣测定以在 体外功能表征假定的组蛋白伴侣。

摘要

组蛋白与DNA结合形成真核染色质。染色质的基本单位是核小体，由组蛋白八聚体组成，由核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4的两个拷贝组成，被DNA包裹。八聚体由两个拷贝的H2A/H2B二聚体和一个拷贝的H3/H4四聚体组成。高电荷的核心组蛋白容易与细胞质和细胞核中的几种蛋白质发生非特异性相互作用。组蛋白伴侣形成一类多样化的蛋白质，将组蛋白从细胞质穿梭到细胞核中，并帮助它们沉积到DNA上，从而协助核小体组装过程。一些组蛋白伴侣对 H2A/H2B 或 H3/H4 具有特异性，有些则作为两者的伴侣。该协议描述了如何串联使用体 外 实验室技术，例如下拉测定，分析体积排阻色谱，分析超离心和组蛋白伴侣测定，以确认给定的蛋白质是否具有组蛋白伴侣的功能。

引言

由DNA和组蛋白组成的核小体形成染色质的结构单元并调节几个关键的细胞事件。核小体被动态地重新定位和重塑，使DNA能够被复制、转录^和翻译等各种过程所访问1^，2。高度碱性的组蛋白要么倾向于与细胞环境中的酸性蛋白质相互作用，要么发生聚集，从而导致各种细胞缺陷³，^4，5。一组称为组蛋白伴侣的专用蛋白质有助于组蛋白从细胞质转运到细胞核，并防止异常组蛋白-DNA聚集事件^6，7。从根本上说，大多数组蛋白伴侣以生理离子强度将组蛋白储存并转移到DNA上，从而有助于核小体^8，9的形成。一些组蛋白伴侣对组蛋白低聚物H2A/H2B或H3/H4¹⁰有明确的偏好。

组蛋白伴侣的特征基于它们组装依赖或独立于DNA合成的核小体的能力¹¹。例如，染色质组装因子-1 （CAF-1） 是依赖性的，而组蛋白调节因子 A （HIRA） 独立于 DNA 合成^12，13。同样，组蛋白伴侣的核质蛋白家族参与精子染色质脱缩和核小体组装¹⁴。核小体组装蛋白（NAP）家族成员在体外促进核小 体 样结构的形成，并参与细胞质和细胞核之间的组蛋白穿梭¹⁵。核质蛋白和NAP家族蛋白都是功能性组蛋白伴侣，但没有任何结构特征。从本质上讲，没有单一的结构特征允许将蛋白质分类为组蛋白伴侣¹⁶。使用功能和生物物理测定以及结构研究最适合表征组蛋白伴侣。

这项工作描述了将蛋白质表征为帮助核小体组装的组蛋白伴侣的生物化学和生物物理方法。首先，采用分析体积排阻色谱法分析组蛋白伴侣的寡聚状态和稳定性。接下来，进行下拉测定以确定组蛋白伴侣-组蛋白相互作用的驱动力和竞争性质。然而，由于蛋白质的形状及其复合物会影响它们在色谱柱中的迁移，因此使用分析体积排阻色谱无法准确计算这些相互作用的流体动力学参数。因此，使用分析超速离心，它提供了溶液内大分子特性，包括准确的分子量、相互作用的化学计量和生物分子的形状。过去的研究已广泛使用体外组蛋白伴侣测定来功能表征组蛋白伴侣，例如yScS116 17，DmACF¹⁸，ScRTT106p¹⁹，HsNPM1²⁰。组蛋白伴侣测定也用于在功能上表征蛋白质作为组蛋白伴侣。

方案

1. 分析体积排阻色谱法阐明组蛋白伴侣的低聚状态和稳定性

1. 组蛋白伴侣寡聚状态分析
   1. 在4 °C下平衡24 mL分析体积排阻色谱（SEC）柱与1.2柱体积（CV），即28.8 mL脱气SEC缓冲液[20 mM的Tris-HCl（pH 7.5），300 mM NaCl和1 mM的β-巯基乙醇（β-ME）]（参见 材料表）。
      注意:色谱柱类型、缓冲液组成和缓冲液pH值可根据感兴趣的蛋白质进行选择。对于24 mL色谱柱，样品进样体积不应超过500 μL。此外，柱压需要保持在5MPa以下。
   2. 从更高浓度的蛋白质储备液中，在脱气的SEC缓冲液中制备500 μL 0.5 mg/mL蛋白质样品，并使用500 μL进样环将其注入预平衡柱中。允许色谱运行以0.2-0.3mL / min的等度流速进行，SEC缓冲液在4°C下进行。
   3. 通过测量280nm波长处的吸光度来监测蛋白质的洗脱曲线。当处理缺乏芳香族残基的蛋白质时，测量214nm处的吸光度。
   4. 使用蛋白质的洗脱体积，使用标准校准曲线²¹计算其近似分子量（以kDa为单位）。
      注意:校准曲线是通过将已知分子量蛋白质的保留体积与其各自分子量（log Mr）的对数作图来制备的，使用相同的色谱柱洗脱。
2. 组蛋白伴侣热稳定性分析
   1. 取 500 μL 0.5 mg/mL 在脱气 SEC 缓冲液（与 1.1.1 中使用的相同）中制备的蛋白质样品在单独的微量离心管中，并在水浴中将每个管加热至 20 °C 至 90 °C（20 °C、40 °C、60 °C 和 90 °C）之间的特定温度范围 10 分钟。
   2. 随后，将热处理后的样品在4°C下以16，200× g 离心10分钟，用微量移液管收集上清液，并使用500μL进样环将每个样品单独进样到分析柱中，用SEC缓冲液在4°C下预平衡。
   3. 允许色谱运行以0.2-0.3mL / min的等度流速进行，SEC缓冲液在4°C下进行。
   4. 观察洗脱峰的位置和高度，并寻找不同样品的其他峰的外观。
3. 组蛋白伴侣化学稳定性分析
   1. 为了检查组蛋白伴侣的盐稳定性，将 500 μL 0.5 mg/mL 蛋白质样品在 Tris 缓冲液 [20 mM Tris-HCl （pH 7.5） 和 1 mM β-ME] 中制备，并在单独的微量离心管中补充增加浓度的 NaCl（300 mM、600 mM、1 M、1.5 M 和 2 M）在单独的微量离心管中孵育 30 分钟。 将样品在4°C下以16，200× g 离心10分钟并保留上清液。
   2. 接下来，使用500 μL进样环将不同NaCl浓度的蛋白质样品单独加载到分析柱中，分析柱中用1.2 CV （28.8 mL）的相应缓冲液预平衡，在4 °C时含有增加的NaCl浓度。
   3. 允许色谱运行以0.2-0.3mL / min的等度流速进行，在4°C下加入1CV（24mL）的相应缓冲液。
   4. 观察洗脱峰的位置和高度，并寻找不同样品的其他峰的出现。
   5. 同样，对于尿素稳定性分析，将 500 μL 0.5 mg/mL 蛋白质样品在 Tris 缓冲液 [20 mM Tris-HCl （pH 7.5） 和 1 mM β-ME] 中制备，并补充有增加尿素浓度（1 M、2 M、3 M、4 M 和 5 M）在单独的微量离心管中在室温下孵育 16 小时。在室温下以16，200× g 离心样品10分钟并保留上清液。
   6. 接下来，使用 500 μL 进样环将尿素处理的蛋白质样品单独加载到与 1.2 CV （28.8 mL） 含有不同尿素浓度的相应缓冲液在室温下预平衡的分析柱中。
   7. 让色谱运行以0.2-0.3 mL / min的等度流速进行，在室温下加入1 CV （24 mL）的相应缓冲液。
      注意:不要在较低温度下使用含有尿素的缓冲液进行实验，因为尿素容易结晶并损坏色谱柱。
   8. 观察洗脱峰的位置和高度，并寻找不同样品的其他峰的外观。

2. 基于盐梯度的下拉测定，以了解有助于组蛋白低聚物和组蛋白伴侣之间复合物形成的相互作用类型

1. 对于下拉测定的每个反应，将 40 μL Ni-NTA 树脂移液到离心柱中，并用无菌双蒸馏水洗涤。随后，用100 CV（4 mL）平衡缓冲液[20 mM的Tris-HCl（pH 7.5），300 mM的NaCl，10 mM的咪唑，10 μg/ mL的BSA和1 mM的β-ME]平衡树脂（参见 材料表）。
   注意:下拉也可以在 1.5 mL 微量离心管中进行。
2. 通过在平衡缓冲液中将 5 μM His标记组蛋白伴侣与 20 μM 组蛋白 H2A/H2B 二聚体或 H3/H4 四聚体混合来制备样品。将样品在冰上孵育1小时。
   注意:H2A / H2B二聚体和H3 / H4四聚体由重组人组蛋白²¹制备，并且通过分析超速离心（AUC）根据估计的分子量确认低聚物的完整性。相同的组蛋白低聚物已用于下面提到的所有实验。
3. 将样品加载到具有步骤2.1中的Ni-NTA树脂的单独的预平衡离心柱中，每个离心柱标记特定的盐浓度，并将色谱柱在4°C下保持30分钟。 将色谱柱以1000× g 离心1分钟。
4. 接下来，用含有不同盐浓度（即300 mM、500 mM、600 mM、700 mM、800 mM、900 mM和1 M NaCl）的100 CV （4 mL）洗涤缓冲液[20 mMTris-HCl（pH 7.5）、50 mM咪唑、0.2%吐温-20和1 mM β-ME]洗涤色谱柱。用具有特定盐浓度的缓冲液洗涤每根色谱柱。
5. 在盐洗步骤之后，使用100 μL洗脱缓冲液[20 mM的Tris-HCl（pH 7.5）、300 mM的NaCl、300 mM的咪唑和1 mM的β-ME]从不同的色谱柱中洗脱蛋白质。
6. 随后，将洗脱的样品置于18%SDS-PAGE²² 中，并在用考马斯亮蓝R250染色后可视化凝胶（参见 材料表）。或者，您可以直接将树脂上样到SDS-PAGE凝胶上，而不是从Ni-NTA树脂中洗脱结合的蛋白质。
   注意:平衡、洗涤和洗脱缓冲液组合物和pH值可以根据感兴趣的蛋白质进行修改。

3. 竞争性下拉测定，以确定组蛋白伴侣对 H2A/H2B 或 H3/H4 的偏好

1. 按照步骤2.1中所述制备离心柱
2. 将 5 μM 组蛋白伴侣与 20 μM H 2 / H 2 B 二聚体在 300 μL 平衡缓冲液（在步骤 2.1 中制备）中在冰上孵育 30 分钟。
   注意:可以根据已知的结合化学计量数据选择反应中组蛋白低聚物与组蛋白伴侣的比例;如果没有可用的信息，请使用五倍过量的组蛋白。
3. 在4°C下以16，200× g 离心组蛋白伴侣-H2A / H 2B复合物5分钟以除去任何沉淀物。接下来，将样品加载到用平衡缓冲液（在步骤2.1中制备）预先平衡的离心柱上，并在4°C下孵育30分钟。
4. 用 100 CV （4 mL） 洗涤缓冲液 [20 mM Tris-HCl （pH 7.5）、300 mM NaCl、50 mM 咪唑、0.2% 吐温-20 和 1 mM β-ME] 洗涤色谱柱，以去除过量的 H2A/H2B 二聚体。接下来，将组蛋白伴侣-H2A / H 2 B复合物与20-60μM的H 3 / H 4四聚体混合，并在冰上孵育30分钟。
5. 用100 CV （4 mL）洗涤缓冲液（在步骤3.4中制备）重洗色谱柱以除去任何未结合的H3 / H4四聚体，并使用洗脱缓冲液（在步骤2.5中制备）洗脱样品。将洗脱的样品置于18%SDS-PAGE中，并在用考马斯亮蓝R250染色后可视化。
   注意:该测定可以逆转，其中首先，H3 / H4四聚体可以与伴侣混合，允许复合物与Ni-NTA珠结合，然后将复合物与不同浓度的H 2A / H 2B二聚体一起孵育。

4. 分析超速离心-沉降速度（AUC-SV）实验分析组蛋白伴侣与组蛋白之间的结合化学计量

1. AUC 的样品制备
   1. 通过7 kDa截止透析管²³分别透析重组组蛋白H2A / H2B二聚体，H3 / H4四聚体和组蛋白伴侣，与透析缓冲液[20mM的Tris（pH 7.5），300mM的NaCl和1mM的β-ME]（参见 材料表）。为了尽量减少由于缓冲液不匹配引起的背景误差，对透析缓冲液进行广泛的透析，最好在24小时内进行三次透析。
      注意:蛋白质样品的初始OD 280应具有高两到三倍的值，以实现0.3-0.5的最终OD₂₈₀。这样做本质上是为了消除稀释的影响。
   2. 使用分析体积排阻色谱法（如步骤1所述）用透析缓冲液单独纯化H 2 / H2B二聚体，H3 / H4四聚体和组蛋白伴侣。保存运行中的缓冲液，以便稍后准备进一步稀释液，并用作AUC单元中的参考。
2. AUC 的样品装载
   1. 使用步骤 4.1.1 中的透析缓冲液将纯化的蛋白质混合在 450 μL 的最终体积中，以达到 0.3-0.6 的 OD₂₈₀ 。将组蛋白伴侣与 H2A/H2B 二聚体或 H3/H4 四聚体混合，在单独的反应管中形成复合物。将蛋白质混合物孵育2-3小时。
      注意:或者，可以使用分析超速离心机中的干涉光学扫描系统获取沉降数据。另外，为了混合纯化的蛋白质，固定组蛋白伴侣浓度并将其与增加浓度的组蛋白低聚物一起孵育以获得精确的化学计量。
   2. 使用分析超速离心机的吸光度检测器将细胞与双扇区中心件和石英窗口组装用于AUC-SV实验，如前所述详细^描述24。
   3. 将 400 μL 样品溶液和 420 μL 透析缓冲液填充到细胞的两个扇区（分别为样品扇区和参比扇区）中。
      注意:在参比扇区中使用更大体积的缓冲液，以使参比弯月面保持在样品弯月面上方。但是，在使用光学干涉系统时，请以相等的体积填充两个扇区。
   4. 称量并准确平衡电池，并将它们装入四位钛转子中（参见 材料表）。使用单元格底部和转子提供的标记对齐单元格。将转子装入离心机中，盖上盖子并形成真空，直到压力降至Hg以下，转子温度稳定到20°C（通常需要2-2.5小时）。
      注意:AUC 操作参数包括实验温度、转子速度、扫描间隔以及要收集的扫描次数。在SV实验的情况下，扫描间隔是根据蛋白质的分子量给出的;较小的蛋白质需要更大的扫描间隔。转子速度也根据蛋白质的预期分子量设定，实验在20°C下进行。 在280nm处监测吸光度数据。
   5. 为了获得精确的化学计量，保持组蛋白伴侣浓度恒定，并与增加浓度的组蛋白低聚物一起孵育以达到饱和。
3. AUC 数据分析
   1. 如前所述执行数据分析²⁵.简而言之，使用SEDNTERP²⁶ 程序计算缓冲液组分的密度和粘度（参见 材料表）。类似地，根据蛋白质的氨基酸组成计算蛋白质的部分比体积，也使用 SEDNTERP。
   2. 将数据从AUC机器加载到程序SEDFIT²⁷ 中，并定义弯月面（红线），单元格底部（蓝线）和数据分析边界（绿线）。选择连续 C（s） 分布作为模型。
   3. 接下来，将最大分辨率设置为100;设置沉降系数（S），最小值:0，最大值:10-15;最初将摩擦比设置为 1.2，并选择浮点以从数据中得出比率;对于 1 西格玛正则化，将置信水平（F 比;确定正则化的大小）设置为 0.68;设置从 SEDNTERP 获得的部分比容、缓冲密度和缓冲液粘度值。
   4. 按 RUN 允许软件求解拉姆方程²⁷。如果存在严重的数据不匹配，请调整参数。调整参数后，按 FIT 优化所有参数。根据均方根偏差 （RMSD） 值评估拟合质量，该值应小于 0.01 个信号单位。
   5. 通过选择选项估计峰的分子量:在主工具栏的显示功能中显示峰"Mw in c（s）"，这将提供有关分子/复合物"s"的信息。

5. 质粒超螺旋测定确认组蛋白伴侣功能

1. 核小体组装反应
   1. 将 2 μM H3/H4 四聚体和 4 μM H2A/H2B 二聚体与增加浓度的组蛋白伴侣 （1-6 μM） 在组装缓冲液 [20 mM 的 Tris HCl （pH 7.5）、1 mM DTT、1 mM 的 MgCl₂、0.1 mg/mL 的 BSA 和 100 mM 的 NaCl] 中混合至最终体积为 50 μL。 将混合物在4°C孵育30分钟。
   2. 同时，在单独的反应中，在组装缓冲液中预处理500ng负超螺旋pUC19质粒与1μg拓扑异构酶I酶（参见 材料表），最终体积为50μL，并在30°C孵育30分钟。
      注意:拓扑异构酶I通过产生单链切口来松弛超螺旋双链质粒DNA。可以使用真核来源的拓扑异构酶I酶，例如市售的小麦胚芽拓扑异构酶I或重组表达的 黑腹果蝇 拓扑异构酶I。
   3. 接下来，合并H3 / H4四聚体，H 2A / H 2 B二聚体，组蛋白伴侣混合物（来自步骤5.1.1），松弛的质粒DNA反应混合物（来自步骤5.1.2），并在30°C下进一步孵育90分钟。
      注意:为测定设置两个对照反应;一个具有组蛋白伴侣和松弛质粒DNA（但不是组蛋白），另一个具有组蛋白低聚物和松弛质粒DNA（但不是组蛋白伴侣）。
   4. 通过加入 100 μL 2x 终止缓冲液（40 mM EDTA、2% SDS 和 0.4 mg/mL 蛋白酶 K）停止组装反应，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
      注意:终止缓冲液通过结合组蛋白的变性和蛋白水解使质粒DNA脱蛋白。
2. 苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀
   1. 在含有步骤5.1.4的反应混合物的管中加入等体积的Tris饱和苯酚并充分混合，然后在室温下以16，200× g 离心10分钟。
   2. 用微量移液管轻轻收集具有质粒DNA的上层水相，并与等体积的氯仿混合。涡旋混合物并在室温下以16，200× g 离心10分钟。
      注意:在此步骤中可以包括异戊醇，以避免水相和有机相之间的模糊界面。
   3. 接下来，收集上层水相，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH 5.5）和2.5体积的冰冷乙醇（见 材料表）。通过将试管倒置3-4次将溶液充分混合，并将混合物在-20°C冰箱中保持30分钟，以完全沉淀质粒DNA。
   4. 将步骤5.2.3中的样品在16200× g 下离心10分钟，轻轻弃去上清液。在室温下保持试管打开，直到微量乙醇蒸发，将沉淀的质粒DNA留在试管中。
3. 进行琼脂糖凝胶电泳以观察质粒超卷效应。
   1. 将步骤5.2.4中沉淀的质粒DNA溶解在无菌双蒸水中。
   2. 在1x Tris-乙酸-EDTA （TAE）缓冲液（40 mM的Tris，20 mM的乙酸和1 mM的EDTA）中分离样品（参见 材料表）。
   3. 用0.2-0.5μg/mL浓度的溴化乙锭染色凝胶，并在紫外线下观察以观察凝胶上的DNA条带。

结果

对拟 南芥 FKBP53蛋白的重组N端核质结构域进行SEC分析。将洗脱峰体积与标准曲线作图，以确定其低聚状态。SEC分析结果表明，该结构域以五聚体的形式存在于溶液中，分子量约为58 kDa（图1A，B）。此外，结合分析SEC分析核蓝蛋白结构域的热稳定性和化学稳定性。与保持在20 °C的样品相比，在高达90 °C的温度下进行热处理的核蓝蛋白样品的洗脱体积和峰高没有明显变化，表明该结构域具有高度的热稳定性（图1C）。同样，核质蛋白结构域显示出高达2 M的NaCl盐稳定性（图1D）和高达4 M的尿素稳定性（图1E）。然而，核质蛋白五聚体开始以更高的尿素浓度解离。

使用梯度盐洗法进行下拉测定以确定有助于组蛋白伴侣（AtFKBP53的核蓝蛋白结构域）与组蛋白低聚物H2A / H2B二聚体和H3 / H4四...

讨论

这项工作演示并验证了一套全面的方案，用于推定组蛋白伴侣的生化和生物物理表征。本文使用重组表达和纯化的NAP家族蛋白AtNRP1和AtNRP2以及AtFKBP53的N端核质蛋白结构域来证明方案。同一组实验可以很好地用于描述来自任何生物体的以前未表征的组蛋白伴侣的功能属性。

协议部分的第一部分涉及研究组蛋白伴侣的寡聚状态和稳定性。一些报告表明，组蛋白伴侣在其寡聚状态下表现出相当大的多样性。例如，人CAF-1以单体²⁹的形式存在。NAP家族成员以二聚体或四聚体^29，30，31的形式存在。核质蛋白揭示五聚体和通常的脱汞寡聚状态^32，33。分析SEC实验可以确定组蛋白伴侣的寡聚状态，AUC-SV实验可以证实这一点。已知几种组蛋白伴侣在各种热和化...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸（冰酸）	Sigma	A6283
丙烯酰胺	MP 生物医学	814326
琼脂糖	MP 生物医学	193983
AKTA Pure 25M FPLC	Cytiva	29018226	蛋白质纯化仪器
过硫酸铵 （APS）Sigma		A3678
An-60Ti 转头	贝克曼库尔特	361964	用于分析超速离心的转子
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma	A7030
氯仿	Sigma	C2432
考马斯亮蓝 R 250	Sigma	1.15444
透析管（7 kDa 截止值）	Thermo Fisher	68700	用于透析蛋白质样品
二硫苏糖醇 （DTT）	MP Biomedicals	100597
DNA 加载染料	New England Biolabs	B7025S
EDTA 二钠盐	MP Biomedicals	194822
电子天平	岛津	ATX224R
乙醇	Sigma	E7023
溴化乙锭 （EtBr）	Sigma	E8751
凝胶 Doc系统	Bio-Rad	12009077	用于染色后的凝胶成像
水平凝胶电泳仪	Bio-Rad	1704405	琼脂糖凝胶电泳仪
盐酸 （HCl）	Sigma	320331
咪唑	MP 生物医学	102033
氯化镁 （MgCl2）	Sigma	M8266
微量移液器	Eppendorf	Z683779	用于微量微量移液器
Mini-PROTEAN 电泳系统	Bio-Rad	1658000	SDS 仪器
PAGE N，N-亚甲基-双丙烯酰胺	MP Biomedicals	800172
Nano 滴	Thermo Fisher	ND-2000	用于测量蛋白质和 DNA 浓度
Ni-NTA 琼脂糖	Invitrogen	R901-15	用于沉降测定的树脂珠
Optima AUC 分析超速离心机	Beckman Coulter	B86437	超速离心仪
pH 计	梅特勒-托利多	MT30130863
酚	Sigma	P4557
质粒分离试剂盒	Qiagen	27104
蛋白酶 K	Sigma-Aldrich	1.07393
pUC19	Thermo Fisher	SD0061	用于超螺旋测定
冷冻高速离心机	Thermo Fisher	75002402
SDS-PAGE 蛋白质标记物	Bio-Rad	1610317
SEDFIT			用于分析超速离心数据的免费软件程序分析
SEDNTERP			用于估计缓冲液粘度和密度以及蛋白质部分比体积的免费软件
程序 SigmaPrep 离心柱	Sigma	SC1000	用于沉降分析
乙酸钠	Sigma	S2889
氯化钠 （NaCl）	默克	S9888
十二烷基硫酸钠 （SDS）	MP生物医学	102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	28990944	分析体积排阻层析柱
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721	分析体积排阻层析柱
TEMED	Sigma	1.10732
拓扑异构酶 I	Inspiralis	WGT102	酶 用于质粒超螺旋测定
Tris 碱	Merck	T1503
吐温-20	Sigma	P1379
尿素	MP Biomedicals	191450
水浴	Nüve	NB 5	用于蛋白质样品的热处理
&β;-巯基乙醇 （β-ME）	Sigma	M6250