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方法文章

构建无功能突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用

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DOI：

10.3791/63231

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2022年3月11日

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

本文内容

摘要

本文描述了构建Aeromonas中特定糖基转移酶或含糖基转移酶区域的空突变株，以及为确定其编码酶在糖链生物合成中的作用和功能、并阐明该糖链在细菌致病性中的作用而开展的运动性测定和鞭毛纯化实验。

摘要

原核生物中糖基化研究是一个快速发展的领域。细菌表面含有多种糖基化结构，其聚糖构成菌株特异性的条形码。这些相关聚糖在糖的组成和结构上比真核生物更为多样，在细菌与宿主的识别过程以及与环境的相互作用中具有重要作用。在致病菌中，糖蛋白参与了感染过程的不同阶段，而聚糖修饰可能影响糖蛋白的特定功能。然而，尽管在聚糖组成、结构及生物合成途径的理解方面已取得进展，但对于糖蛋白在致病性或环境相互作用中的作用仍知之甚少。此外，在某些细菌中，蛋白质糖基化所需的酶与其他多糖生物合成途径（如脂多糖和荚膜多糖生物合成途径）共享。通过突变被认为参与糖基化过程的特定基因，并研究其对目标糖蛋白表达及聚糖修饰的影响，已在多种细菌中阐明了糖基化的功能重要性。嗜温性Aeromonas具有单一的O-糖基化极性鞭毛。不同Aeromonas菌株的鞭毛聚糖在碳水化合物组成和链长方面表现出多样性。然而，迄今为止分析的所有菌株均以一种假氨基糖酸衍生物作为连接糖，修饰丝氨酸或苏氨酸残基。该假氨基糖酸衍生物是极性鞭毛组装所必需的，其缺失会影响细菌的黏附、生物膜形成和定植能力。本文详述的实验方案描述了如何通过构建无义突变体来研究基因或包含推测糖基转移酶的基因组区域在鞭毛聚糖生物合成中的作用。该方法还可用于解析相关糖基转移酶的功能以及聚糖的作用，通过将聚糖缺陷型突变体与野生型菌株进行比较即可实现这一目标。

引言

蛋白质糖基化已在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中被报道，其过程包括将糖链共价连接至氨基酸侧链上1,2在原核生物中，该过程通常发生 通过 两种主要的酶促机制： O- 和 N-糖基化3在 O-糖基化是指糖链连接到丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的羟基上。在 N-糖基化是指糖链连接到天冬酰胺（Asn）残基侧链酰胺氮上，该Asn位于三肽序列Asn-X-Ser/Thr中，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。

聚糖可以形成线性或分支结构，由通过糖苷键共价连接的单糖或多糖组成。与真核生物的聚糖相比，原核生物中的聚糖在糖的组成和结构上通常表现出更高的多样性4。此外，已发现两种不同的细菌糖基化途径，其区别在于聚糖组装并转移至受体蛋白的方式：依次糖基化和成簇糖基化5,6。在依次糖基化过程中，复杂的聚糖通过单糖的逐步添加直接在蛋白质上构建而成。而在成簇糖基化中，预先组装好的聚糖由一种特异的寡糖基转移酶（OTase）从脂质连接的寡糖上整体转移至蛋白质。这两种途径均已被证实参与了N-和O-糖基化过程7。

蛋白质糖基化在调控蛋白质的理化性质和生物学特性方面发挥着重要作用。糖链的存在可影响蛋白质与其配体的相互作用，从而影响蛋白质的生物学活性，同时也可能影响蛋白质的稳定性、溶解度、对蛋白水解的敏感性、免疫原性以及微生物与宿主之间的相互作用8,9。然而，多个糖基化参数，如糖链的数量、糖链组成、位置及连接机制，也可能影响蛋白质的功能与结构。

糖基转移酶（GTs）是复杂聚糖和糖缀合物生物合成中的关键酶。这些酶催化活化供体分子中的糖基与特定受体底物之间形成糖苷键。GTs 可以利用核苷酸和非核苷酸作为供体分子，并作用于不同的受体底物，如蛋白质、糖类、核酸和脂类10。因此，在分子水平上理解 GTs 对于揭示其作用机制和特异性至关重要，同时也有助于阐明修饰重要分子的聚糖糖组成如何与致病性相关。碳水化合物活性酶数据库（CAZy）11 根据 GTs 的序列同源性对其进行分类，由于在大多数 GT 家族中，其结构折叠和作用机制保持不变，该分类系统提供了一种预测工具。然而，有四个原因使得预测许多 GTs 的底物特异性变得困难：1）在原核生物中尚未确定决定底物特异性的明确序列基序12；2）许多 GTs 和寡糖基转移酶（OTases）表现出底物广谱性13,14；3）功能性 GTs 难以以重组形式获得高产量表达；4）供体和受体底物的鉴定过程复杂。尽管如此，近年来的突变研究已使得在理解 GTs 的催化机制和底物结合方面取得了显著进展。

在细菌中，O-糖基化似乎比 N-糖基化。该 O-糖基化位点没有显示共有序列，且其中许多 O糖基化蛋白是分泌蛋白或细胞表面蛋白，例如鞭毛蛋白、菌毛或自转运蛋白1鞭毛蛋白糖基化在受体位点数量、聚糖组成和结构上表现出变异性。例如， 伯克霍尔德菌属 spp鞭毛蛋白仅有一个受体位点，而 空肠弯曲菌，鞭毛蛋白最多可有19个受体位点15,16此外，某些细菌的聚糖仅为单个单糖，而其他细菌则具有由不同单糖组成的异质性聚糖，形成寡糖。这种异质性甚至存在于同一种物种的不同菌株之间。 幽门螺杆菌 鞭毛蛋白仅由假拟酸（PseAc）修饰17，以及 弯曲杆菌 鞭毛蛋白可被拟唾液酸的乙酰氨基甲酰化形式（PseAc）、拟唾液酸（PseAm）或军团胺酸（LegAm）以及来源于这些糖类的带有乙酰基的糖链所修饰。 N-乙酰氨基葡萄糖或丙酰基取代18,19在 气单胞菌属，鞭毛蛋白通过糖基修饰，其糖基组成从单一的PseAc酸衍生物到异源多糖不等20，且糖链与鞭毛蛋白单体的连接始终 通过 一种PseAc衍生物。

通常，鞭毛蛋白的糖基化对鞭毛丝的组装、运动性、毒力以及宿主特异性至关重要。然而，C. jejuni16、H. pylori17, 和 Aeromonas sp.21 的鞭毛蛋白除非发生糖基化，否则无法组装成鞭毛丝；而 Pseudomonas spp. 和 Burkholderia spp.15 的鞭毛蛋白则不需要糖基化即可完成鞭毛组装。此外，在某些 C. jejuni 菌株中，鞭毛糖链的糖组成改变会影响细菌与宿主的相互作用，并可能在逃避某些免疫反应中发挥作用16。自凝集是另一种受鞭毛蛋白相关糖链组成修饰影响的表型特征。较低的自凝集能力会导致微菌落和生物膜形成能力下降22。在某些细菌中，鞭毛触发促炎反应的能力与鞭毛蛋白的糖基化有关。因此，在 P. aeruginosa 中，糖基化的鞭毛蛋白比非糖基化的鞭毛蛋白诱导更强的促炎反应23。

Aeromonas 是环境中的常见革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界，使其处于“同一健康”（One Health）各个组成部分的交汇点24。嗜温性 Aeromonas 具有一根单一的极生鞭毛，该鞭毛为组成型表达。超过一半的临床分离株还在高黏度培养基或平板上可诱导表达侧鞭毛蛋白。多项研究已将这两种鞭毛类型与细菌致病的早期阶段相关联25。迄今为止报道的极鞭毛蛋白在其核心免疫原性区域的 5–8 个丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基上发生 O-糖基化，而侧鞭毛蛋白在所有菌株中均未发现 O-糖基化。尽管不同菌株的极鞭毛糖链在碳水化合物组成和链长方面表现出多样性20，但连接糖已被证实为一种假氨基糖（pseudaminic acid）衍生物。

本研究的目的是描述一种获得特定糖基转移酶（GT）或含GT的染色体区域的无效突变体的方法，以分析其在相关多糖生物合成及细菌致病性中的作用，同时研究糖链本身的生物学功能。作为示例，我们鉴定并删除了Aeromonas菌中包含GT的染色体区域，以确定其在极性鞭毛蛋白糖基化中的作用，并分析鞭毛蛋白糖链的功能。本文展示了如何删除特定GT以明确其在该糖链生物合成中的功能以及修饰后糖链的作用。尽管以Aeromonas为例进行说明，该方法原理同样适用于鉴定和研究其他革兰氏阴性菌的鞭毛糖基化岛，并分析参与其他糖类（如O抗原脂多糖）生物合成的GT的功能。

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方案

该操作流程的示意图如图1所示。

1. 鞭毛糖基化岛（FGIs）的生物信息学鉴定 气单胞菌属

  1. 为了鉴定PseAc生物合成基因簇 气单胞菌属 基因组，使用 tblastn 来自NCBI数据库的工具26首先，获取 PseC 和 PseI 的直系同源蛋白 A. piscicola AH-3（鉴定编号为 OCA61126.1 和 OCA61113.1）来自已测序数据库 气单胞菌属 菌株，然后使用 tblastn 用于搜索其翻译后的核苷酸序列的工具。
    注意： pse 基因位于两侧 气单胞菌属 FGIs，具有 pseB 和 pseC 位于簇的一端 pseI 另一端。其余部分的位置 pse 不同FGI组之间的基因可能存在差异。
  2. 鉴于许多菌株的极性鞭毛蛋白基因与FGIs相邻，可利用这一特征 tblastn 从NCBI数据库中查找与极性鞭毛蛋白FlaA和FlaB的直系同源蛋白 A. piscicola AH-3（鉴定编号为 OCA61104.1 和 OCA61105.1）及其编码基因。
  3. 此外， 气单胞菌属 参与杂多糖类糖链（II组）的生物合成27 包含多个编码参与脂肪酸合成酶的基因，例如 luxC 和 luxE. 使用 tblastn 从 NCBI 数据库中查找 LuxC 的同源蛋白 A. piscicola AH-3（鉴定编号为OCA61121.1）及其编码基因。

2. 鞭毛糖基化岛基因无效突变体的构建

注意：该诱变方法基于利用自杀型载体 pDM428（GenBank：KC795686.1）进行聚合酶链式反应（PCR）同框缺失产物的等位基因交换。pDM4 载体的复制依赖于 λ pir，并通过利用位于载体上的 sacB 基因强制实现完整的等位基因交换。

  1. PCR 同框缺失产物的构建。
    1. 设计两对引物，分别扩增目标基因或区域上游（A 和 B 引物）和下游（C 和 D 引物）的 DNA 片段（图 2B）。
    2. 确保引物 A 和 D 分别位于待删除基因或基因组区域起始位点上游和终止位点下游超过 600 bp 处。这两个引物的 5' 端需包含一个可用于在 pDM4 载体中进行克隆的内切酶限制性酶切位点。
      注意：引物 A 和 D 的 5' 端所包含的限制性酶切位点不应与 AB 或 CD 扩增子内部已有的酶切位点相同。
    3. 确保引物 B 和 C 分别位于待删除基因内部，或分别位于待删除区域的第一个和最后一个基因内部。确保两个引物（B 和 C）处于正确的阅读框内，并位于基因内部 5–6 个密码子之间。此外，确保两个引物的 5' 端均包含一段 21 bp 的互补序列（表 1），以便连接 AB 和 CD 的 DNA 扩增子。
    4. 将选定的 Aeromonas 菌株在 5 mL 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中于 30 °C 过夜（O/N）培养。使用市售的基因组 DNA 提取试剂盒，并按照制造商说明书操作（材料表）。使用分光光度计定量 2 µL 纯化后的 DNA。
      注意：以双蒸水作为空白对照，仪器设置为在 260 nm 处检测吸光度。对 2 µL 纯化 DNA 进行 3–5 次吸光度测定并计算平均值。使用比尔-朗伯定律计算 DNA 浓度，公式为 A = Ɛ·c·l，其中 "A" 为吸光度，"Ɛ" 为 DNA 的摩尔平均消光系数，"c" 为 DNA 浓度，"l" 为光程长度（具体数值请参考仪器制造商说明书）。
    5. 以 100 ng 纯化的染色体 DNA 为模板，分别使用 A-B 和 C-D 引物进行两组不对称 PCR 扩增（材料表）。A:B 和 D:C 引物对的摩尔比为 10:1（补充材料）。
      注意：不对称 PCR 可优先扩增模板的一条链而非另一条链。
    6. 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。使用 TAE 缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA）作为电泳运行缓冲液，电泳条件为 8 V/cm。在凝胶中加入溴化乙锭（0.5 µg/mL）以可视化 DNA，并使用生物成像系统观察 PCR 产物（材料表）。
    7. 使用手术刀从凝胶中切下扩增子，按照制造商说明书进行纯化（材料表），并定量。
    8. 通过 PCR 产物 3' 端的 21 bp 重叠序列将 AB 和 CD 扩增子连接（图 3）。将各 100 ng 的 AB 和 CD 扩增子与 PCR 试剂混合于 PCR 管中（pre-AD PCR），不加引物，使用热循环仪程序进行延伸（补充材料）。然后向反应体系中加入 100 µM 的 A 和 D 引物（AD PCR），扩增为单一片段（补充材料）。
    9. 使用步骤 2.1.6 中所述条件，通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物（AD 扩增子），从凝胶中切下扩增子，按照制造商说明书进行纯化，并定量扩增子（材料表）。
  2. 构建含有同框缺失的 pDM4 重组质粒。
    1. 在 30 °C 条件下，于含氯霉素（25 µg/mL）的 10 mL Luria-Bertani（LB）Miller 肉汤中过夜培养含有 pDM4 质粒的 Escherichia coli cc18λ pir 菌株。
    2. 在 4 °C 条件下以 5,000 x g 离心收集菌体，将沉淀重悬于 600 µL 无菌蒸馏水中。使用市售质粒提取试剂盒提取并纯化 pDM4 质粒，操作步骤遵循供应商说明书（材料表）。
    3. 使用一种能够切割 AD 扩增子两端及 pDM4 克隆位点的内切酶，对 1 µg pDM4 和 400 ng AD 扩增子进行 2 小时的酶切反应（图 3）。反应条件遵循酶制造商的说明书（材料表）。
    4. 使用 DNA 纯化试剂盒对酶切后的质粒和扩增子进行纯化，并按照制造商说明书进行定量（材料表）。
    5. 为防止线性化 pDM4 质粒自连，使用碱性磷酸酶去除其 5' 末端的磷酸基团，操作遵循制造商说明书（材料表）。然后对处理后的质粒进行纯化，并按照步骤 2.1.4 所述方法使用分光光度计进行定量（材料表）。
    6. 将 150 ng 酶切并经碱性磷酸酶处理的 pDM4 与 95–100 ng 酶切后的 AD 扩增子以 1:4 的摩尔载体:插入片段比例混合。在 15 µL 体系中进行连接反应，操作步骤遵循制造商说明书（材料表）。
    7. 在 20 °C 过夜或 4 °C 过周末孵育。孵育结束后，在 70 °C 下灭活 T4 DNA 连接酶 20 分钟。
    8. 通过电穿孔法将连接产物导入 Escherichia coli MC1061λpir 菌株中。使用电转化感受态细菌和 2 mm 间隙的电穿孔比色皿。
  3. E. coli 电转化感受态细胞的制备及 pDM4 重组质粒的电穿孔
    1. 将单个 E. coli MC1061λpir 菌落接种至 Luria-Bertani（LB）Miller 肉汤中，于 30 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。
    2. 取 2 mL 菌液接种至 18 mL LB 肉汤中，于 30 °C 振荡培养（200 rpm），直至光密度（OD600）达到 0.4–0.6。
    3. 在 4 °C 条件下以 5,000 x g 离心 15 分钟收集菌体。弃去上清液，将沉淀重悬于 40 mL 冰冷的蒸馏 H2O 中。
    4. 重复此洗涤步骤两次，以彻底去除培养基中的盐分。最后将沉淀重悬于 4 mL 冰冷的蒸馏 H2O 中，并将 1 mL 悬液分别转移至四个锥形 1.5 mL 微量离心管中。
    5. 在 4 °C 条件下以 14,000 x g 离心 5 分钟收集菌体。小心弃去上清液（勿扰动沉淀），将每个沉淀重悬于 100 µL 冰冷的蒸馏 H2O 中。
    6. 向每管中加入 3–3.5 µL 连接混合物，冰上孵育 5 分钟。然后将每管内容物转移至预冷的 2 mm 间隙电穿孔比色皿中，施加 2 kV、129 Ω、时间常数约 5 ms 的电脉冲。
      注意：电穿孔比色皿需预先在冰上预冷。整个操作过程中需保持细菌处于冰上。
    7. 电穿孔后，向四个比色皿中各加入 250 µL SOC 培养基以恢复细胞，将内容物转移至一个培养管（约 1 mL），于 30 °C 振荡（200 rpm）培养 1 小时。
    8. 将转化后的细胞涂布于添加氯霉素（25 µg/mL）的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，以确保平板上生长的所有菌落均含有质粒骨架。
    9. 从含氯霉素的 LB 琼脂平板上挑取若干菌落，于 30 °C 过夜培养。菌落生长后，使用位于 pDM4 克隆位点两侧的引物 pDM4for 和 pDM4rev，以裂解的菌落为模板，通过 PCR 检测缺失构建体是否插入 pDM4（表 1 和 补充材料）。
    10. 用无菌牙签挑取一个菌落，浸入含有 15 µL 1% Triton X-100、20 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM EDTA pH 8.0 的 1.5 mL 离心管中。将离心管于 100 °C 孵育 5 分钟，然后置于冰上 1 分钟。
    11. 在微量离心机中以 12,000 x g 离心 10 分钟，使细菌和碎片沉淀。取 1 µL 上清液作为模板进行 PCR 反应（材料表）。引物对的退火温度为 50 °C，PCR 反应需添加 10% DMSO（补充材料）。
    12. 将 PCR 扩增出目标产物的菌落接种于含氯霉素（25 µg/mL）的 10 mL LB 肉汤中，于 30 °C 过夜培养。按照步骤 2.2.1–2.2.2 所述方法从培养物中提取质粒。使用 pDM4 引物进行测序，操作遵循制造商说明书（材料表）。
  4. 将同框缺失导入 Aeromonas 菌株
    注意：pDM4 重组质粒需通过三亲接合（图 4）导入选定的 Aeromonas 菌株。Aeromonas 菌株必须具有利福平抗性，以便在三亲接合后进行筛选。因此，将选定菌株在 30 °C 的 TSB 培养基中过夜培养，分别取 2 mL、4 mL 和 6 mL 培养物，在 5,000 x g 条件下离心 15 分钟，将每个沉淀重悬于 100 µL TSB 中，并涂布于含利福平（100 µg/mL）的 TSA 平板上。
    1. 在 30 °C 条件下，分别于含 25 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂（供体菌株）、含 100 µg/mL 利福平的 TSA 琼脂（受体菌株）和含 80 µg/mL 萘啶酮酸的 LB 琼脂（辅助菌株）上过夜培养含有 pDM4 重组质粒的 E. coli MC1061λpir（供体菌株）、具有利福平抗性的 Aeromonas 菌株（受体菌株）以及含有 pRK2073 质粒的 E. coli HB101（辅助菌株）。
    2. 菌落生长后，用无菌牙签分别从三个 LB 试管（各含 150 µL LB）中轻柔地悬浮相同数量的供体、受体和辅助菌株菌落（10–15 个菌落）。
    3. 然后，在无抗生素的 LB 琼脂平板上，以受体:辅助:供体 = 5:1:1 的比例（50 µL 受体，10 µL 供体，10 µL 辅助）混合三种细菌悬液，共两滴。将平板倒置，在 30 °C 过夜培养。使用不含重组质粒的供体菌株作为接合阴性对照。
      注意：辅助菌株携带接合质粒 pRK2073，可协助 pDM4 质粒转入 Aeromonas。切勿使用涡旋振荡器悬浮供体、受体和辅助菌株，以免破坏菌毛。
    4. 向 LB 琼脂平板中加入 1 mL LB 肉汤，用无菌玻璃涂布器涂布，获得细菌悬液。用移液器将细菌悬液转移至 1.5 mL 锥形微量离心管中，剧烈涡旋。
    5. 为筛选含有 pDM4 重组质粒的受体菌落，取 100 µL 收集的细菌悬液涂布于含利福平（100 µg/mL）和氯霉素（25 µg/mL）的 LB 琼脂平板上。
    6. 在微量离心机中以 5,000 x g 离心 15 分钟，分别收集 200 µL 和 600 µL 样品，将沉淀重悬于 100 µL LB 肉汤中，并涂布于含利福平（100 µg/mL）和氯霉素（25 µg/mL）的 LB 琼脂平板上。所有平板于 30 °C 培养 24–48 小时。
    7. 挑取生长的菌落，转移至含利福平（100 µg/mL）和氯霉素（25 µg/mL）的 LB 平板，于 30 °C 过夜培养。然后通过氧化酶试验29 确认菌落为 Aeromonas，并通过使用 E 和 F 引物的 PCR 检测确认 pDM4 重组质粒已插入特定染色体区域（第一次重组）（补充材料），E 和 F 引物结合于 A 和 D 引物扩增区域之外（材料表）。如步骤 2.3.11 所述，使用 1 µL 裂解菌落作为模板。
    8. 为完成同框缺失的等位交换，促使整合了自杀质粒的菌落发生第二次重组。将重组菌落在 2 mL 含 10% 蔗糖、不含抗生素的 LB 培养基中于 30 °C 过夜培养。
    9. 取步骤 2.4.8 的细菌培养物 100 µL 涂布于含蔗糖（10%）的 LB 琼脂平板上。同时涂布不同稀释度（10-2–10-4）的培养物各 100 µL，于 30 °C 过夜培养。
    10. 为确认 pDM4 的丢失，挑取菌落并分别转移至含和不含氯霉素（25 µg/mL）的 LB 平板，于 30 °C 过夜培养，筛选对氯霉素敏感的菌落。
    11. 使用 E-F 引物对和 1 µL 裂解菌落作为模板，通过 PCR 分析敏感菌落（材料表 和 补充材料），选择 PCR 产物大小与缺失构建体相符的菌落。

3. 运动性检测

注意：在某些具有糖基化鞭毛的细菌物种中，糖基化水平或聚糖组成的改变会影响鞭毛蛋白的组装，通常表现为运动能力降低或完全丧失运动能力。因此，对缺失突变体进行了两种运动能力检测。

  1. 液体培养基中的运动性检测
    1. 在 25–30 °C 条件下，将 Aeromonas 菌株于 1 mL TSB 培养基中过夜培养。将显微镜盖玻片粘附至凹面载玻片时，用牙签尖端蘸取少量硅胶，在盖玻片四角各涂一小滴。随后，在盖玻片中央滴加 1 µL Aeromonas 培养物，并加入一滴新鲜 TSB 培养基（2 µL）混匀。
    2. 将凹面载玻片盖在盖玻片上，使凹槽对准液滴，轻轻按压后将整个玻片翻转倒置。
    3. 使用光学显微镜（材料表）配合浸油和 100 倍物镜，通过明场显微镜观察分析细菌的游动运动性。
      ​注意：应使用 Aeromonas 野生型菌株作为阳性对照；阴性对照可选用无鞭毛细菌，如 Klebsiella。
  2. 半固体培养基中的运动性检测
    1. 在 25–30 °C 条件下，将 Aeromonas 菌株于 TSB 培养基（1 mL）中过夜培养。随后，取 3 µL 培养物接种至软琼脂平板（1% 胰蛋白胨、0.5% NaCl、0.25% 细菌琼脂）中央，平板正面向上，于 25–30 °C 过夜培养。
    2. 使用直尺测量细菌从平板中心向边缘在琼脂中扩散的距离。

4. 鞭毛纯化

  1. 分离锚定在细菌表面的鞭毛
    1. 在25-30 °C条件下，将气单胞菌（Aeromonas）菌株于TSB培养基（10 mL）中过夜培养。随后将菌液转接到含TSB培养基（900 mL）的锥形瓶中，于25-30 °C、200 rpm振荡条件下继续过夜培养。
    2. 在4 °C条件下以5,000 × g离心20分钟，弃上清。将菌体沉淀重悬于20 mL 100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.8）中。
    3. 为去除锚定的鞭毛，将上述悬液加入直径为2-3 mm的玻璃棒，在涡旋振荡器上剪切3-4分钟，然后反复（至少六次）通过21号针头的注射器进行剪切。
    4. 在4 °C下进行两次连续离心以沉淀细菌：首先以8,000 × g离心30分钟，弃去上清；再以18,000 × g离心20分钟。收集含有游离鞭毛的上清液。
    5. 将上清液在4 °C下以100,000 × g超速离心1小时，将沉淀物重悬于150 µL含2 mM EDTA的100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.8）中。该沉淀物即为鞭毛丝。
    6. 取步骤4.1.5中重悬的沉淀物5-10 µL，在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析，并用考马斯亮蓝染色检测蛋白质。
      注：请遵循制造商关于蛋白质电泳及凝胶染色的操作说明。以野生型菌株纯化的鞭毛作为糖基化鞭毛蛋白的阳性对照。通过氯化铯（CsCl）密度梯度离心进一步纯化富集的鞭毛组分。
  2. 采用氯化铯梯度纯化鞭毛。
    1. 将12.1 g CsCl溶于27 mL蒸馏水（H2O）中。
    2. 将富集的鞭毛组分（150 µL）转移至薄壁超透明离心管（14 mm × 89 mm）（材料表），并加入12 mL CsCl溶液至充满。
    3. 在4 °C条件下，使用水平转子以60,000 × g超速离心48小时（材料表）。
    4. 用注射器从CsCl梯度中收集鞭毛条带，并在含2 mM EDTA的100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.8）中透析。随后通过12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色（步骤4.1.6）或质谱分析透析后的鞭毛样品。

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结果

该方法提供了一个有效的系统，用于在 Aeromonas 的基因或染色体区域中构建无效突变体，以研究其对鞭毛糖基化及鞭毛丝功能的影响（图1）。

该方案首先通过生物信息学方法鉴定出假定的鞭毛糖基化区域（FGIs）以及该区域内编码糖基转移酶（GTs）的基因。 气单胞菌，FGIs 的染色体位置基于三类基因的检测：参与伪氨基糖生物合成的基因（pseI 和 pseC极性鞭毛蛋白基因，以及 luxC极生鞭毛被单一拟唾液酸衍生物糖基化的菌株，例如 A. 嗜水气单胞菌 AH-130，其在GTs之间不含有编码GTs的基因 pse 位于FGI I组中的基因27属于该 FGI 组的大多数菌株在此区域附近均含有极生鞭毛蛋白基因。相比之下，那些极生鞭毛被杂多糖聚糖糖基化的菌株，例如 A. piscicola AH-...

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讨论

该方法的关键早期步骤是鉴定参与鞭毛糖基化的区域以及推测的糖基转移酶（GTs），因为这些酶具有高度同源性，并参与多种生物学过程。对相关序列的生物信息学分析 气单胞菌属 公共数据库中的基因组分析显示，该区域毗邻极性鞭毛区域2，后者在许多菌株中包含鞭毛蛋白基因以及参与假氨基乳酸生物合成的基因27这使得开发一种用于检测鞭毛糖基化岛的指南成为可能 气单胞菌属 可用于鉴定其他含有假氨基酸衍生物作为鞭毛糖链成分的细菌中的相应区域。此外，尽管本方法描述了如何分析参与鞭毛糖基化的基因簇，但也可用于研究编码可能参与不同革兰氏阴性菌鞭毛形成、旋转或调控相关蛋白的基因。

在生成PCR框内缺失时，B和C引物的设计也十分重要。这些引物应分别位于所选基因或待删除区域起始密码子下游5-6个密码子处（B引物）和终止密码子上游5-6个密码子处（C引物），并且不应破坏开放阅读框。此外，另一个需要考虑的重要因素是用于生成AB和CD扩增子的同源区域长度。本方案建议两个扩增子各自包含600-800 bp的同源区域。较短的同源区域会使第一次重组...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了加拿大国家研究委员会、西班牙经济与竞争力部的国家研发计划（Plan Nacional de I + D）以及加泰罗尼亚自治区政府（生物技术参考中心，Generalitat de Catalunya）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 循环测序即用反应试剂盒Applied Biosystems4337455用于测序
AccuPrime Taq DNA 聚合酶，高保真Invitrogen12346-086用于扩增 AB、CD 和 AD 片段
琼脂糖Conda-Pronadise8008用于 DNA 电泳
碱性磷酸酶，小牛肠（CIAP）PromegaM1821用于去除 5’ 端的磷酸基团
Bacto 琼脂Becton Dickinson214010用于运动性分析
BamHIPromegaR6021用于内切核酸酶限制性酶切
BglIIPromegaR6081用于内切核酸酶限制性酶切
BioDoc-It 成像系统UVP用于 DNA 可视化的生物成像系统
Biotaq 聚合酶BiolineBIO-21040用于菌落筛选
氯化铯ApplichemA1126,0100用于鞭毛纯化
氯霉素ApplichemA1806,0025用于三亲杂交
Cytiva illustra GFX PCR DNA 和凝胶条带纯化试剂盒Cytivia28-9034-71用于 PCR 扩增子和 DNA 片段的纯化
EDTAApplichem131026.1211用于 DNA 电泳
电穿孔比色皿，2 mm 间隙VWR732-1133用于转化
溴化乙锭ApplichemA1152,0025用于 DNA 可视化
HyperLadder 1 Kb 标记物BiolineBIO-33053DNA 标记物
Invitrogen Easy-DNA 基因组 DNA 纯化试剂盒Invitrogen10750204用于细菌染色体 DNA 纯化
LB Miller 琼脂（Luria-Bertani 琼脂）Condalab996用于 Escherichia coli 培养
LB Miller 肉汤（Luria-Bertani 肉汤）Condalab1551用于 Escherichia coli 培养
Nanodrop ND-1000NanoDrop Technologies Inc用于 DNA 定量的分光光度计
利福平ApplichemA2220,0005用于三亲杂交
SOC 培养基Invitrogen15544034用于电穿孔后细胞恢复
壮观霉素ApplichemA3834,0005用于三亲杂交
SW 41 Ti 摆动桶转子Beckman331362用于鞭毛纯化
T4 DNA 连接酶Invitrogen15224017用于连接反应
胰蛋白胨大豆琼脂Condalab1068用于气单胞菌培养
胰蛋白胨大豆肉汤Condalab1224用于气单胞菌培养
胰蛋白胨Condalab1612用于运动性分析
TrisApplichemA2264,0500用于 DNA 电泳和鞭毛纯化
Triton X-100ApplichemA4975,0100用于细菌裂解
超透明离心管（14 mm × 89 mm）Beckman344059用于鞭毛纯化
Veriti 96 孔热循环仪Applied Biosystems用于 PCR 反应
Zyppy 质粒小提 II 试剂盒Zymo ResearchD4020用于质粒 DNA 的提取

参考文献

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无效突变体构建鞭毛糖基化气单胞菌菌株基因缺失极性鞭毛质谱分析游动能力聚糖生物合成
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