构建无功能突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用

摘要

本文描述了构建Aeromonas中特定糖基转移酶或含糖基转移酶区域的空突变株，以及为确定其编码酶在糖链生物合成中的作用和功能、并阐明该糖链在细菌致病性中的作用而开展的运动性测定和鞭毛纯化实验。

摘要

原核生物中糖基化研究是一个快速发展的领域。细菌表面含有多种糖基化结构，其聚糖构成菌株特异性的条形码。这些相关聚糖在糖的组成和结构上比真核生物更为多样，在细菌与宿主的识别过程以及与环境的相互作用中具有重要作用。在致病菌中，糖蛋白参与了感染过程的不同阶段，而聚糖修饰可能影响糖蛋白的特定功能。然而，尽管在聚糖组成、结构及生物合成途径的理解方面已取得进展，但对于糖蛋白在致病性或环境相互作用中的作用仍知之甚少。此外，在某些细菌中，蛋白质糖基化所需的酶与其他多糖生物合成途径（如脂多糖和荚膜多糖生物合成途径）共享。通过突变被认为参与糖基化过程的特定基因，并研究其对目标糖蛋白表达及聚糖修饰的影响，已在多种细菌中阐明了糖基化的功能重要性。嗜温性Aeromonas具有单一的O-糖基化极性鞭毛。不同Aeromonas菌株的鞭毛聚糖在碳水化合物组成和链长方面表现出多样性。然而，迄今为止分析的所有菌株均以一种假氨基糖酸衍生物作为连接糖，修饰丝氨酸或苏氨酸残基。该假氨基糖酸衍生物是极性鞭毛组装所必需的，其缺失会影响细菌的黏附、生物膜形成和定植能力。本文详述的实验方案描述了如何通过构建无义突变体来研究基因或包含推测糖基转移酶的基因组区域在鞭毛聚糖生物合成中的作用。该方法还可用于解析相关糖基转移酶的功能以及聚糖的作用，通过将聚糖缺陷型突变体与野生型菌株进行比较即可实现这一目标。

引言

蛋白质糖基化已在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中被报道，其过程包括将糖链共价连接至氨基酸侧链上^1,2在原核生物中，该过程通常发生 通过 两种主要的酶促机制： O- 和 N-糖基化³在 O-糖基化是指糖链连接到丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的羟基上。在 N-糖基化是指糖链连接到天冬酰胺（Asn）残基侧链酰胺氮上，该Asn位于三肽序列Asn-X-Ser/Thr中，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。

聚糖可以形成线性或分支结构，由通过糖苷键共价连接的单糖或多糖组成。与真核生物的聚糖相比，原核生物中的聚糖在糖的组成和结构上通常表现出更高的多样性⁴。此外，已发现两种不同的细菌糖基化途径，其区别在于聚糖组装并转移至受体蛋白的方式：依次糖基化和成簇糖基化^5,6。在依次糖基化过程中，复杂的聚糖通过单糖的逐步添加直接在蛋白质上构建而成。而在成簇糖基化中，预先组装好的聚糖由一种特异的寡糖基转移酶（OTase）从脂质连接的寡糖上整体转移至蛋....

方案

该操作流程的示意图如图1所示。

1. 鞭毛糖基化岛（FGIs）的生物信息学鉴定 气单胞菌属

1. 为了鉴定PseAc生物合成基因簇 气单胞菌属 基因组，使用 tblastn 来自NCBI数据库的工具²⁶首先，获取 PseC 和 PseI 的直系同源蛋白 A. piscicola AH-3（鉴定编号为 OCA61126.1 和 OCA61113.1）来自已测序数据库 气单胞菌属 菌株，然后使用 tblastn 用于搜索其翻译后的核苷酸序列的工具。
   注意： pse 基因位于两侧 气单胞菌属 FGIs，具有 pseB 和 pseC 位于簇的一端 pseI 另一端。其余部分的位置 pse 不同FGI组之间的基因可能存在差异。
2. 鉴于许多菌株的极性鞭毛蛋白基因与FGIs相邻，可利用这一特征 tblastn 从NCBI数据库中查找与极性鞭毛蛋白FlaA和FlaB的直系同源蛋白 A. piscicola AH-3（鉴定编号为 OCA61104.1 和 O....

结果

该方法提供了一个有效的系统，用于在Aeromonas的基因或染色体区域中产生无效突变，这些基因或区域可能影响鞭毛的糖基化以及鞭毛丝的功能（图1）。

该方案首先通过生物信息学方法鉴定假定的鞭毛糖基化区域（FGI）以及位于该区域内的糖基转移酶（GT）编码基因。Aeromonas 中 FGI 的染色体位置确定依赖于三类基因的检测：参与假拟烯酸生物合成的基因（pseI 和 pseC）、极鞭毛素基因以及 luxC。极鞭毛仅被一种假拟烯酸衍生物糖基化的菌株，例如 A. hydrophila AH-1³⁰，其位于 FGI I 型组²⁷ 内的 pse 基因之间不存在编码 GT 的基因。大多数属于该 FGI 组的菌株在此区域旁侧具有极鞭毛素基因。相反，极鞭毛被异源多糖型糖链糖基化的菌株，例如 A. piscicol.......

讨论

该方法的关键早期步骤是鉴定参与鞭毛糖基化的区域以及推测的糖基转移酶（GTs），因为这些酶具有高度同源性，并参与多种生物学过程。对相关序列的生物信息学分析 气单胞菌属 公共数据库中的基因组分析显示，该区域毗邻极性鞭毛区域2，后者在许多菌株中包含鞭毛蛋白基因以及参与假氨基乳酸生物合成的基因²⁷这使得开发一种用于检测鞭毛糖基化岛的指南成为可能 气单胞菌属 可用于鉴定其他含有假氨基酸衍生物作为鞭毛糖链成分的细菌中的相应区域。此外，尽管本方法描述了如何分析参与鞭毛糖基化的基因簇，但也可用于研究编码可能参与不同革兰氏阴性菌鞭毛形成、旋转或调控相关蛋白的基因。

在生成PCR框内缺失时，B和C引物的设计也十分重要。这些引物应分别位于所选基因或待删除区域起始密码子下游5-6个密码子处（B引物）和终止密码子上游5-6个密码子处（C引物），并且不应破坏开放阅读框。此外，另一个需要考虑的重要因素是用于生成AB和CD扩增子的同源区域长度。本方案建议两个扩增子各自包含600-800 bp的同源区域。较短的同源区域会使第一次重组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 循环测序即用反应试剂盒	Applied Biosystems	4337455	用于测序
AccuPrime Taq DNA 聚合酶，高保真	Invitrogen	12346-086	用于扩增 AB、CD 和 AD 片段
琼脂糖	Conda-Pronadise	8008	用于 DNA 电泳
碱性磷酸酶，小牛肠（CIAP）	Promega	M1821	用于去除 5’ 端的磷酸基团
Bacto 琼脂	Becton Dickinson	214010	用于运动性分析
BamHI	Promega	R6021	用于内切核酸酶限制性酶切
BglII	Promega	R6081	用于内切核酸酶限制性酶切
BioDoc-It 成像系统	UVP		用于 DNA 可视化的生物成像系统
Biotaq 聚合酶	Bioline	BIO-21040	用于菌落筛选
氯化铯	Applichem	A1126,0100	用于鞭毛纯化
氯霉素	Applichem	A1806,0025	用于三亲杂交
Cytiva illustra GFX PCR DNA 和凝胶条带纯化试剂盒	Cytivia	28-9034-71	用于 PCR 扩增子和 DNA 片段的纯化
EDTA	Applichem	131026.1211	用于 DNA 电泳
电穿孔比色皿，2 mm 间隙	VWR	732-1133	用于转化
溴化乙锭	Applichem	A1152,0025	用于 DNA 可视化
HyperLadder 1 Kb 标记物	Bioline	BIO-33053	DNA 标记物
Invitrogen Easy-DNA 基因组 DNA 纯化试剂盒	Invitrogen	10750204	用于细菌染色体 DNA 纯化
LB Miller 琼脂（Luria-Bertani 琼脂）	Condalab	996	用于 Escherichia coli 培养
LB Miller 肉汤（Luria-Bertani 肉汤）	Condalab	1551	用于 Escherichia coli 培养
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Technologies Inc		用于 DNA 定量的分光光度计
利福平	Applichem	A2220,0005	用于三亲杂交
SOC 培养基	Invitrogen	15544034	用于电穿孔后细胞恢复
壮观霉素	Applichem	A3834,0005	用于三亲杂交
SW 41 Ti 摆动桶转子	Beckman	331362	用于鞭毛纯化
T4 DNA 连接酶	Invitrogen	15224017	用于连接反应
胰蛋白胨大豆琼脂	Condalab	1068	用于气单胞菌培养
胰蛋白胨大豆肉汤	Condalab	1224	用于气单胞菌培养
胰蛋白胨	Condalab	1612	用于运动性分析
Tris	Applichem	A2264,0500	用于 DNA 电泳和鞭毛纯化
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	用于细菌裂解
超透明离心管（14 mm × 89 mm）	Beckman	344059	用于鞭毛纯化
Veriti 96 孔热循环仪	Applied Biosystems		用于 PCR 反应
Zyppy 质粒小提 II 试剂盒	Zymo Research	D4020	用于质粒 DNA 的提取