本实验方案描述了通过1H-NMR波谱法对游离及蛋白结合的精氨酸和甲基化精氨酸进行制备与定量检测的方法。
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摘要
摘要
许多蛋白质中的结合态精氨酸常发生甲基化修饰，通过改变蛋白质的理化性质及其与其他分子（包括其他蛋白质或核酸）的相互作用，从而调控其功能。本文介绍了一种易于实施的实验方案，用于定量检测精氨酸及其甲基化衍生物，包括非对称性二甲基精氨酸和对称性二甲基精氨酸（分别为ADMA和SDMA）以及单甲基精氨酸（MMA）。在从生物体液、组织或细胞裂解液中分离蛋白质后，本方案描述了一种简单的组织匀浆、蛋白质沉淀及蛋白质水解方法。由于水解产物中含有大量其他成分，如其他氨基酸、脂质和核酸，因此必须采用固相萃取（SPE）进行纯化。SPE可手动操作，使用离心机完成，也可借助移液机器人自动进行。本方案对ADMA的检测灵敏度约为100 nmol/L。由于SPE存在饱和效应，精氨酸的检测上限为3 mmol/L。综上所述，该方案提供了一种从生物样本制备到基于核磁共振（NMR）检测的稳健方法，并为研究精氨酸甲基化组时的成功操作提供了有价值的提示和注意事项。
引言
近二十年来，精氨酸残基的甲基化被确认为蛋白质重要的翻译后修饰之一，影响着转录调控、信号转导等多种基本生物学过程1。参与调控精氨酸甲基化的主要蛋白是蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）2。精氨酸的主要甲基化产物包括ω-(NG,NG)-不对称二甲基精氨酸（ADMA）、ω-(NG,N'G)-对称二甲基精氨酸（SDMA）以及ω-NG-单甲基精氨酸（MMA）2。
PRMTs 利用 S-腺苷-L-甲硫氨酸将甲基转移至蛋白质结合精氨酸的末端胍基（具有两个等价的氨基）上1。可区分两种主要酶：I 型和 II 型酶均可催化第一步甲基化反应生成单甲基精氨酸（MMA），该产物因此失去其对称性。在此之后，I 型酶（如 PRMT1、2、3、4、6、8）以 MMA 为底物生成非对称二甲基精氨酸（ADMA），而 II 型酶（主要是 PRMT5 和 PRMT9）则生成对称二甲基精氨酸（SDMA）。PRMT1 是首个从哺乳动物细胞中分离得到的蛋白质精氨酸甲基转移酶3。然而，PRMTs 在进化上高度保守4，存在于其他动物中，....
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方案
本研究以酵母蛋白水解物作为样品。整个实验流程详见图1。
1. 材料与试剂的准备
- 甲醇/水：将两份99%的甲醇（MeOH）与一份H2O混合，配制成甲醇/水溶液（记为MeOH/H2O）。将纯甲醇和MeOH/H2O储存于-20 °C，以减少醇类挥发并提高样品稳定性。
- 盐酸（HCl）：用浓盐酸（12.0 mol/L 或 37%）稀释配制9 mol/L和0.1 mol/L的HCl溶液。较高浓度（9 mol/L）的溶液用于蛋白质水解，较低浓度（0.1 mol/L）的溶液用于固相萃取。
警告：操作应在通风橱内进行。 - 配制固相萃取用的洗脱替代溶液，其中含10%饱和氨水溶液（储备液：30% w/w 氨水）、50%甲醇和40%水（v/v）。
- NMR缓冲液：将5.56 g磷酸氢二钠（Na2HPO4，0.08 mol/L）、0.4 g三甲基硅丙酸-2,2,3,3-d4钠盐（TSP，5 mmol/L）和0.04%（w/v）叠氮化钠（NaN3）溶于500 mL重水（D2O）中，并用HCl或NaOH调节pH至7.4（见材料表）。每次....
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结果
在本实验室中，通常使用二维 J 分辨（JRES）虚拟去耦核磁共振谱的 1H 一维投影图进行峰归属和定量分析36。图3 展示了采用本固相萃取（SPE）方案纯化的酵母蛋白水解物的代表性 JRES 谱图。尽管两种物质浓度差异很大，仍可在细胞基质中实现分离和定量。根据特定甲基（-CH3）或亚甲基（-CH2-）基团在相应化学位移处的质子数目，1H-NMR 谱法可实现精确定量。如方案中所述（步骤0），相对于精氨酸，对甲基化精氨酸衍生物进行相对定量，足以用于观察生物学过程，例如在基因敲低/过表达、营养成分变化或抑制剂处理等调控条件下，精氨酸甲基化水平的变化。
如先前研究所示27，L-精氨酸和ADMA可通过其在3.25 ppm和3.02 ppm处不同的特征化学位移得以良好区分。SDMA和MMA的甲基质子在D2O（步骤1.4中所述的NMR.......
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讨论
以下部分主要关注该方法本身；精氨酸甲基化的生物学意义已在引言部分进行描述。
首先，不同硬度的组织可能需要调整样品裂解条件：来自细胞培养物（包括细菌、酵母等）以及脑、幼嫩肝脏、平滑肌等组织的细胞可迅速实现匀浆化。对于硬度较高的组织（包括老年个体的肝脏、动脉、骨骼等），匀浆需进行两次（参见步骤 3.2.3）。然而，即使存在部分不溶性残留物，也不应重复进行更多次匀浆。此时应将样品在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟，并收集上清液用于后续分析（以最小化样品降解）。
在每个样品需要冷冻的步骤（最初加入甲醇后，以及分别在步骤 3.3、3.4 或 3.5）或冻干后（步骤 4.4 和 6.1），样品可在进一步处理前保存数天。此外，步骤 3.4 中的上清液（均质化后；在图 1中标识为 "(1)"）也可保存以用于进一步分析，例如测定除甲基化精氨酸以外的其他代谢物36,
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作得到了奥地利科学基金（FWF）项目 P28854、I3792、doc.funds BioMolStruct DOC 130、DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz（旗舰项目 DYNIMO）、奥地利研究促进署（FFG）项目 864690 和 870454、格拉茨综合代谢研究中心、奥地利2016/2017年基础设施计划、施蒂利亚州政府（Zukunftsfonds）以及福建医科大学高层次人才启动基金（XRCZX2021020）的资助。我们感谢医学研究中心提供细胞培养设施的使用权限。F.Z. 在格拉茨医科大学分子医学博士项目框架内接受了培训。Q.Z. 在格拉茨医科大学代谢与心血管疾病博士项目框架内接受了培训。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TSP） | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL 圆底离心管 | Greiner Bio One | 115101 | |
| 32% 氨水溶液 | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz 核磁共振波谱仪，配备 TXI 探头 | Bruker | - | |
| 冷冻离心机，例如 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| 氯仿 ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | SpeedVac 系统用导热流体 |
| 重水（D2O） | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| 六氘代二甲基亚砜（d6-DMSO） | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| 干燥室 | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN 培养管，13 × 100 mm，GL 14，9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards 深度真空油泵 RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | SpeedVac 系统组成部分 |
| Eppendorf 1.5 mL 离心管 | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson 移液机器人 GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-精氨酸 | AppliChem | A3675 | |
| 甲醇 ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q 超纯水系统 | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1 cc/30 mg，1 mL 固相萃取小柱 | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 组织匀浆仪 | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys 匀浆管（研磨管） | VWR International | 432-0351 | |
| Precellys 1.4 mm 氧化锆珠 | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap 加热、搅拌与蒸发模块 | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| 适用于 1.5 mL 离心管的转子，FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant 冷冻捕集阱 | Thermo Scientific | 15996161 | SpeedVac 系统组成部分 |
| Savant SpeedVac 真空浓缩仪 SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | SpeedVac 系统组成部分；配备适用于 1.5 mL 离心管的转子 |
| 带 PTFE 密封垫的螺口玻璃瓶盖，DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| 海沙 | Roth | 8441.3 | |
| 短螺纹玻璃小瓶，1.5 mL，ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Roth | K305.1 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | VWR | BDH7363-4 | |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0（软件） | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-不对称二甲基精氨酸（ADMA） | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-单甲基精氨酸（MMA） | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-对称二甲基精氨酸（SDMA） | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
参考文献
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and w....
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