昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治制剂，其重要性日益凸显。本研究利用农业谷物产品，成功实现了对两种南非分离的Metarhizium robertsii和M. pinghaense菌株产生大量具有强感染活性的繁殖体的规模化生产，可用于防治害虫的商业化应用。
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方法文章
昆虫病原真菌 Metarhizium robertsii 和 Metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用
本文内容
摘要
摘要
绿僵菌属（Metarhizium anisopliae）复合种的昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治剂日益受到重视。由于害虫对化学杀虫剂的抗性不断增强，人们对杀虫剂对人类健康产生的负面影响以及农药造成的环境污染日益关注，全球正积极推动寻找新型可持续的作物保护与害虫防控策略。此前已有研究尝试大规模培养如球孢白僵菌（Beauveria bassiana）等昆虫病原真菌（EPF）物种。然而，针对金龟子绿僵菌（Metarhizium robertsii）和平壤绿僵菌（M. pinghaense）的大规模培养研究仍十分有限。本研究旨在大量生产具有较强抗逆性的南非分离株 M. robertsii 和 M. pinghaense 感染性繁殖体，以满足商业化应用需求。实验选用三种农业谷物——燕麦片、大麦片和大米——作为EPF固态发酵的培养基质。采用两种接种方法：分生孢子悬浮液和液态芽生孢子菌液，用于接种固态基质。结果显示，使用分生孢子悬浮液接种的效果相对较差，因在固态基质上观察到的污染水平高于芽生孢子接种法。燕麦片被发现不适合作为 M. robertsii 和 M. pinghaense 的生长基质，因未能从该基质中收获到干燥的分生孢子。大麦片有利于 M. robertsii 分生孢子的生产，而不利于 M. pinghaense 的生产，从该基质中平均收获了 1.83 g ± 1.47 g 的干燥 M. robertsii 分生孢子，而 M. pinghaense 分生孢子产量为零。大米颗粒则有利于两种菌株 M. pinghaense 和 M. robertsii 的分生孢子大规模生产，分别从该基质中平均收获 8.2 g ± 4.38 g 和 6 g ± 2 g 的分生孢子。
引言
昆虫病原真菌（EPF）作为重要农业害虫生物防治中的作物保护制剂，其重要性日益凸显1,2。这类天然存在于土壤中的昆虫病原菌，可在多种害虫种群中引发流行病3。EPF 具有宿主特异性，对非靶标物种造成危害的风险相对较低，且对环境无毒4。EPF 具有独特的侵染机制，可在宿主体内繁殖并持续存在于其周围环境中1。它们主要通过无性孢子攻击宿主，孢子附着于宿主表皮并穿透进入血腔，在其中侵染并增殖。宿主最终因血淋巴营养物质耗尽或真菌释放的毒性代谢产物引起的毒血症而死亡。随后，在适宜的环境条件下，真菌会从宿主尸体的体表长出（显性真菌感染）5,6。
人们对化学残留物对人类健康、环境污染以及害虫抗药性发展的负面影响日益关注，这推动了全球减少化学杀虫剂投入并寻找作物保护和害虫防治替代性、创新性及可持续策略的行动6,7,8。这为开发基于微生物的杀....
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方案
1. 真菌菌株来源
- 使用南非分离的两种真菌菌株 M. pinghaense 5 HEID（GenBank 登录号：MT367414/MT895630）和 M. robertsii 6EIKEN（MT378171/MT380849）, 采自南非西开普省的苹果园。
- 在添加1 g酵母提取物的60 g沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDAY）上培养每种虫生真菌分离物 10 µL 链霉素
注意：将EPF培养物在严格控制的温度下孵育，温度为± 25 °C 在暗处。
2. Metarhizium pinghaense 和 M. robertsii 分生孢子悬液接种
- 固体基质的制备
- 选用两种农产品，即燕麦片和大麦片，作为两种虫生真菌分离株的培养基质，并使用灭菌袋（305 mm × 660 mm）作为发酵袋。
- 使用一段小型聚氯乙烯废管（1000 mm × 50 mm），在灭菌袋的开口端制作发酵袋的颈部，并使用灭菌胶带将管道固定在袋子上。
- 用无菌棉塞封闭管道，以在发酵过程中实现充分的气体交换。
- 分别称取200 g干燥的燕麦片和大麦片，放入发酵袋中，向每个袋中加入100 m....
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结果
在真菌培养物的干燥过程中，随着时间的推移，观察到 M. pinghaense 和 M. robertsii 在大米培养基上的培养物干重逐渐减少，而在培养物完全干燥后，其质量则基本保持不变或变化极小（图5）。图6 展示了收获的 M. pinghaense 和 M. robertsii 干燥分生孢子粉末。
图 5：在10天内，以大米.......
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讨论
在农业生态系统中，成功整合微生物制剂用于重要农业害虫的生物防治，首先依赖于在实验室条件下能否成功且便捷地大规模生产昆虫病原体。虫生真菌（EPF）的大规模生产对于在病虫害综合管理（IPM）项目中大规模应用和获取基于生物防治的EPF产品至关重要9,10,11,12,13。不同虫生真菌菌株的大规模生产成效受培养基或生产基质营养成分的影响，这些营养成分显著影响所产生的分生孢子的特性，包括其致病效力、抗干燥能力、田间持效性以及分生孢子产量8,19,20,21。因此，在培养.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Hort Pome、Hort Stone以及产业技术与人力资源计划（THRIP：TP14062571871）对本项目的资助。
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 吐温 20 | Lasec | 添加至分生孢子悬浮液中，使真菌孢子能够与水充分混合 | |
| 20 mL 麦克弗森瓶 | Lasec | 用于制备分生孢子悬浮液 | |
| 铝箔 | 用作 250 mL 三角瓶棉塞的覆盖材料 | ||
| 高压灭菌器 | 用于对分生孢子生产过程中所用材料和成分进行灭菌 | ||
| 高压灭菌袋 | Lasec | 发酵袋或固体基质容器 | |
| 高压灭菌指示胶带 | Lasec | 用于固定发酵袋上的聚氯乙烯管 | |
| 棕色牛皮纸袋 | 用于干燥农业谷物上的分生孢子培养物 | ||
| 本生灯 | Labnet (Labnet International, Inc.) | 用于对实验器械（手术刀片、接种环及三角瓶瓶口）进行火焰灭菌 | |
| 透明边缘试验筛 | 用于将真菌分生孢子从农业谷物基质中分离出来 | ||
| 玉米浆 | SIGMA | 66071-94-1 | 芽生孢子液体培养基的成分之一 |
| 脱脂棉 | Lasec | 用作发酵袋瓶口的塞子 | |
| 杜兰玻璃实验瓶 | Neolab | 用于高压灭菌 SDA 培养基和蒸馏水 | |
| 电工胶带 | 用于缠绕并密封筛网接头，防止分生孢子粉尘逸出 | ||
| ENDECOTTS 试验筛 | 用于将真菌分生孢子从农业谷物基质中分离出来 | ||
| 耐热锥形瓶，窄口，250 mL | Lasec | 芽生孢子液体培养基的载体 | |
| 乙醇（99%） | Lasec | 用于对手术刀片和接种环进行灭菌 | |
| 压片大麦 | Health Connection Wholefoods | 农业谷物，作为 M. pinghaense 和 M. robertsii 分生孢子的固体基质生长培养基 | |
| 压片燕麦 | Tiger brands | 农业谷物，作为 M. pinghaense 和 M. robertsii 分生孢子的固体基质生长培养基 | |
| 葡萄糖 | Merck | 芽生孢子液体培养基的成分之一 | |
| 培养箱/恒温培养箱 | 用于真菌分生孢子培养物的培养 | ||
| 血细胞计数板 | 用于测定分生孢子浓度 | ||
| 接种环 | Lasec | 用于采集孢子以接种液体培养基，促进芽生孢子生长 | |
| 厨房擀面杖 | 用于操作固体谷物基质床 | ||
| 层流柜 | ESCO Laminar Flow Cabinet | 在基质接种过程中提供无菌环境 | |
| Metarhizium pinghaense 分生孢子 | Stellenbosch University | 5HEID | 用于大规模培养 Metarhizium pinghaense 分生孢子的培养物 |
| Metarhizium robertsii 分生孢子 | Stellenbosch University | 6EIKEN | 用于大规模培养 Metarhizium robertsii 分生孢子的培养物 |
| 显微镜 | ZEIZZ (Scope. A1) | 用于测定分生孢子浓度及分生孢子活力 | |
| 旋转摇床 | IncoShake- LABOTEC | 用于芽生孢子的生产过程 | |
| 预煮米 | Spekko | 农业谷物，作为 M. pinghaense 和 M. robertsii 分生孢子的固体基质生长培养基 | |
| 青霉素-链霉素 | SIGMA | 添加至 SDA 培养基中以防止细菌污染 | |
| 培养皿 | Lasec | SDA 培养基的容器 | |
| 移液器及移液器吸头 | Labnet (BioPette PLUS) | 用于量取液体成分 | |
| 聚氯乙烯 Marley 排水管 | 用于为发酵袋制作瓶口 | ||
| 磷酸氢二钾（K2HPO4） | SIGMA-ALDRICH | 芽生孢子液体培养基的成分之一 | |
| 橡胶圈 | 用于将手术纸固定在发酵袋的聚氯乙烯管瓶口上 | ||
| 沙氏葡萄糖琼脂（SDA） | NEOGEN Culture Media | 用于培养 Metarhizium pinghaense 和 Metarhizium robertsii 孢子的培养基 | |
| 无菌蒸馏水 | 用于水合农业谷物及制备分生孢子悬浮液 | ||
| 防滑垫 | 用于将筛网固定在振动筛分仪上 | ||
| 手术刀片 | Lasec | 用于从真菌培养物上刮取孢子 | |
| 手术纸 | Lasec | 用于覆盖发酵袋的聚氯乙烯管口和棉塞 | |
| 振动筛分仪 | 用于将分生孢子从农业谷物基质上振落 | ||
| 涡旋混合器 | Labnet (Labnet International, Inc.) | 用于在麦克弗森瓶中混合分生孢子悬浮液 | |
| 酵母提取物 | Biolab | 添加至 SDA 培养基中以促进孢子萌发和生长 | |
| 自封袋 | GLAD | 用于储存收获的真菌分生孢子 |
参考文献
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F.
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