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优化的骨骼取样方案用于从考古遗存中提取古DNA

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DOI：

10.3791/63250

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2021年11月30日

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1Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for the Science of Human History, 2School of Human Evolution and Social Change, Arizona State University, 3Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology

本文内容

摘要

本方案介绍了一系列最佳实践操作流程，用于从五个不同的骨骼部位上八个推荐的解剖学取样位置（特定骨骼元素上的具体位置）采集中世纪个体的骨粉样本（放射性碳测年校准后2-sigma范围约为公元1040-1400年）。

摘要

本文所述方法旨在最大限度提高从古代考古遗存中回收人类DNA的可能性，同时减少所需取样材料的用量。该方法通过靶向解剖学取样部位实现，这些部位在全骨骼范围内DNA回收的比较分析中已被证实可获得最丰富的古代DNA（aDNA）。先前研究表明，这些实验方案能够最大限度提高从考古遗存中成功回收古代人类及病原体DNA的概率。Parker等人于2020年对来自德国佩森附近废弃中世纪定居点克拉考尔贝格（Krakauer Berg）墓地的11名个体、多个骨骼部位的aDNA保存状况进行了广泛调查，评估了DNA产量。该墓地经放射性碳测年确定为中世纪（约公元1040–1400年，校准后2-sigma范围）。研究发现，涵盖五个骨骼部位（pars petrosa、恒磨牙、胸椎、远端指骨和距骨）的这八个取样位点成功获得了高质量的古代人类DNA，其产量显著高于所有骨骼部位和个体的总体平均水平。所得DNA产量足以满足大多数常见下游群体遗传学分析的需求。我们的研究结果支持在绝大多数涉及从考古遗存中分析古代人类DNA的研究中优先选用这些解剖学取样部位。采用这些方法将有助于最小化对珍贵考古标本的破坏。

引言

为获取和分析DNA而对古代人类遗骸进行取样本质上具有破坏性1,2,3,4。样本本身是珍贵的标本，应尽可能保持其形态学完整性。因此，必须优化取样方法，以避免对不可替代的材料造成不必要的破坏，并最大限度地提高实验成功的概率。目前的最佳实践技术主要基于少量研究，这些研究仅限于法医学调查5,6、并非以优化取样为主要目标的古代标本研究7，或使用非人类遗骸8或仅针对极少数解剖学取样部位的研究（本文中“解剖学取样部位”指从骨骼单元的特定区域钻取骨粉，用于后续DNA分析）9,10。本文所介绍的取样方案是在首次针对多个个体的多种骨骼单元开展的大规模系统性DNA保存研究中优化而成的11。所有样本均来自德国萨克森-安哈尔特州佩森附近废弃中世纪定居点克拉考尔贝格（Krakauer Berg）教堂墓地发掘出的11名个体的骨骼单元（详细的样本人口学信息见表1），因此，若用于此地理和时间范围之外的样本，可能需要进行适当调整。

个体性别死亡时估计年龄14C 测年（公元，日历年代 2-西格玛）
KRA001男性25–351058–1219
KRA002女性20–221227–1283
KRA003男性251059–1223
KRA004男性151284–1392
KRA005男性10–121170–1258
KRA006女性30–401218–1266
KRA007女性25–301167–1251
KRA008男性201301–1402
KRA009男性未知1158–1254
KRA010男性251276–1383
KRA011女性30–451040–1159

表1：11例样本个体的遗传学性别、考古学推断的死亡年龄估计值以及放射性碳测年（14C 校准后2-sigma范围）。 本表格改编自 Parker, C. 等人，202011。

这些方案可从五个骨骼部位（包括pars petrosa）的八个解剖采样位置相对简便且高效地制备骨粉，同时将实验室引入的DNA污染控制在较低水平。在这五个骨骼部位中，已确定其中四个骨骼部位上的七个解剖采样位置可作为破坏性采集岩骨锥体的可行替代方案11,12。这些位置包括恒磨牙的牙骨质、牙本质和牙髓腔；从胸椎椎体及上椎切迹处采集的皮质骨；从远节指（趾）骨远端膨大部底面及骨干获取的皮质骨；以及距骨外侧部分致密的皮质骨。尽管目前已有多种广泛应用的方法用于pars petrosa4,12,13,14、牙本质及牙髓腔1,2,15的取样，但有关从牙骨质16、椎体、下椎切迹和距骨成功制备骨粉的已发表方法却较难获取。因此，本文展示了优化后的采样方案，涵盖岩骨锥体（步骤3.1）；成人磨牙的牙骨质（步骤3.2.1）、牙本质（步骤3.2.2）和牙髓（步骤3.2.3）；椎体皮质骨（步骤3.3.1）和上椎弓（步骤3.3.2）；远节指（趾）骨（步骤3.4）以及距骨（步骤3.5），以促进这些骨骼部位在古DNA和法医学研究中的更广泛应用。

方案

本文所展示的所有研究均遵循德国耶拿马克斯·普朗克人类历史科学研究所关于处理古代人类遗骸的指导方针。在执行本方案的任何步骤之前，请确保遵守您所在地区所有相关的本地/州/联邦伦理要求，包括获取开展科学研究以及对人类遗骸进行破坏性取样的许可。所有操作和化学品储存均应按照各机构的安全指南进行。

1. 样品处理前的注意事项

  1. 处理样本时应格外谨慎，因为古代遗存是不可复制且有限的资源（例如，取样应尽可能减少浪费，若可能，所有遗存应在使用后归还给相应的合法提供机构）。
  2. 所有操作步骤均应在洁净室环境中进行，最好在专门的古DNA实验室完成17,18,19。使用个人防护装备（PPE），包括带帽兜的一次性无菌微孔防护服、无菌手套（两副）、外科口罩、护目镜，以及无菌鞋套或带防滑底的无菌覆盖鞋（参见 材料表）。应频繁更换手套，尤其是在处理不同样本之间。
  3. 尽可能使用漂白剂/DNA去污溶液/乙醇并结合紫外线照射（波长：254 nm）对所有设备和表面进行彻底清洁和消毒（例如钻头、钻机、台钳/夹具等）。最后，强烈建议定期进行符合人体工学的休息（若可能，每2-3小时一次），以避免因洁净室环境导致过度疲劳。
    注意：所有骨骼遗存应在取样前进行适当记录（例如拍照、称重，若条件允许，进行显微CT扫描、三维成像等）（本稿件未涵盖相关记录工作的具体方案）。所有取样操作可在各次取样之间暂停，样本可长期保存于干燥、温度可控（25 °C）、无菌的环境中。

2. 预处理

  1. 在生成骨粉之前，应对所有解剖学取样部位进行去污染处理，以最大限度降低污染风险18。
    注意：使用漂白剂和/或表面去除法（表面去除步骤见3.3.2步骤中的“注意”）对样本进行去污染的有效性，在古DNA研究人员中仍存在争议8,19,20,21,22,23,24,25，因为这两种方法均可能影响总体DNA得率，尤其是在高度降解的样本中。因此，以下步骤被视为可选步骤，此处列出是因为本文所呈现的代表性结果所涉及的所有样本均采用了这些处理方法。建议根据每个样本集的分子应用目的、年代、稀有程度以及形态学降解水平，逐案决定是否采用这些预处理方案。
    1. 所有取样操作均应在专用洁净室中进行，并在配备紫外灯的聚合酶链式反应（PCR）工作台或生物安全柜内完成，操作时关闭气流。在实验台表面铺上无菌铝箔，以收集任何散落的骨粉或碎片。
    2. 在丢弃铝箔前，确保回收所有骨碎片（用于归还）。每次处理不同骨骼单元之间应更换铝箔。将使用过的铝箔丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
    3. 用无尘、干燥且无菌的擦拭巾轻轻擦拭解剖学取样部位，尽可能去除松散的污垢或碎屑（参见材料表）。将使用过的擦拭巾丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
    4. 用浸有稀释商用漂白剂（约0.01% v/v，用超纯无DNase/RNase水稀释）的无菌擦拭巾擦拭清洁后的表面，并静置孵育5分钟。将使用过的擦拭巾丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
      警告：漂白剂是一种强腐蚀性和高反应性的化学物质，使用前必须采取适当的安全防护措施。
    5. 用浸有超纯无DNase/RNase水的无菌擦拭巾尽可能去除解剖学取样部位残留的漂白剂。将使用过的擦拭巾丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
    6. 将所有清洁后的解剖学取样部位暴露于紫外辐射下30分钟（波长：254 nm），然后在室温下完全干燥。确保在继续取样或重新储存前，解剖学取样部位已彻底干燥，这不仅有助于更顺利地生成骨粉，还可防止样本进一步降解（如霉变）。
      警告：紫外线辐射可能对眼睛造成伤害。
    7. 立即进行取样，或将骨骼单元储存在干燥、温度受控（25 °C）的无菌环境中。

3. 骨粉制备

注意：以下方案旨在用于遵循 Dabney 等人 2019 年方案26 进行的 DNA 提取。

  1. 采样 岩部
    注意：本方案改编自 Pinhasi 等人 2019 年所述的实验步骤4 为方便使用而在此提供。本方案并不代表当前取样过程中破坏性最小的最新方法 岩部因此，建议采用 Sirak 等人 2017 年所述的实验方案。13 Orfanou 等，202014 对于形态保存至关重要的样品。
    1. 在配备紫外灯（波长：254 nm）的PCR工作台或生物安全柜内进行所有取样操作，操作时关闭气流，并在专用洁净室内完成。在实验台表面铺覆无菌铝箔，以收集散落的骨粉或骨碎片。
    2. 确保在丢弃铝箔前回收所有骨碎片及尽可能多的骨粉（用于归还）。每次取样后更换铝箔。将使用过的铝箔丢弃至可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
    3. 使用灭菌的钳子或台钳固定干燥且已去污的部件。
    4. 切开 岩部 沿上部对半切开 岩裂 （参见 图1) 使用配备0.6 mm刀片的标准珠宝锯（参见 材料表以中等速度操作，避免过热（参见步骤 3.1.6 下方的注释）。
      警告： 岩部 非常致密，因此可能难以切割。务必确保部件被牢固夹紧，以防受伤。任何断裂的锯片应丢弃至指定的锐器容器中。
    5. 取下岩骨部分的夹子，回收并保存任何松散或多余的组织材料。
    6. 将称量纸放入无菌称量皿中
    7. 握住岩骨部分，切面朝向称量盘倾斜，置于称量纸上。在面神经管与乳突窦之间的致密皮质骨（外观比周围组织更光亮，参见 图1) 使用配备小钻头的牙科钻（参见 材料列表）并调节至中等转速和中等扭矩，以研磨成骨粉。
      注意：钻孔/切割时应以低至中等速度进行短时间间歇操作，以避免骨组织过热，从而防止DNA被破坏或损伤。据经验，当岩骨致密部分开始过热时，可能会产生类似煎培根的气味。此时应立即停止钻孔/切割，并让骨组织充分冷却后再继续操作。
    8. 重复钻取，直至称量纸上收集到约 50–100 mg 的粉末，使用精度至少为 0.01 mg 的密闭天平称量（参见 材料表).
      注意：建议尽可能收集100 mg骨粉，以便进行两次重复DNA提取，每次使用50 mg。然而，由于解剖取样部位本身的限制（例如远节指骨、牙髓腔）或形态学保存的需要，此目标并不总能实现。对于其他部位（如牙骨质），可获得的材料可能远少于50 mg。但已有研究表明，牙骨质、牙髓腔和远节指骨均能获得较高含量的内源性DNA11,27,28尽管提取过程中骨粉的初始投入量较低。
    9. 将粉末从称量纸转移至已标记的2 mL低吸附安全锁扣管中，用于提取或储存。样品储存于-20 °C，无限期地。
    10. 将剩余的骨骼/过量粉末储存于干燥、温度可控（25 °C无菌环境，直至完成返回/遣返。
    11. 将所有废弃物置于可高压灭菌的生物危害袋或容器中处理。每次取样之间，根据需要使用漂白剂/DNA去污溶液/乙醇以及紫外线（波长：254 nm）照射对所有可重复使用的设备（如钳子、钻头、钻机、锯子等）进行灭菌/去污。

用于分析的骨样本；标注图像显示侧向切割位置和取样区域，并附有标尺。
图1：包含pars petrosa的颞骨。（A）切割前样本，显示岩骨锥体和sulcus petrosa的位置。（B）切割后岩骨部分，突出显示需钻取的致密区域。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 恒磨牙取样
    注意：对于恒磨牙的取样，需预先选择 原位 理想情况下，应选用根部融合且无龋齿、釉质裂纹或过度磨损的磨牙，以获得最佳效果。去除所有牙石样本后，储存于 -20 °C 用于未来可能进行的口腔微生物组分析（本流程未涵盖）。
    1. 牙骨质取样
      1. 在配备紫外灯（波长：254 nm）的PCR工作台或生物安全柜内进行所有取样操作，操作时关闭气流，并在专用洁净室内完成。在台面上铺覆无菌铝箔，以收集任何散落的骨粉或骨碎片。
      2. 确保在丢弃铝箔前回收所有骨碎片及尽可能多的骨粉（用于归还）。每次取样后更换铝箔。将使用过的铝箔丢弃至可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
      3. 将一张称量纸放入无菌称量盘中。
      4. 用可调节扳手等手持夹具夹住已消毒的磨牙的釉质部分，牙根朝下，置于称量盘上方固定 材料表).
      5. 使用牙科钻机安装金刚石边缘的圆形切割轮。将钻机调至中等转速/扭矩档位，以约-角度轻轻接触根部边缘20°.
      6. 向下刮擦至托盘中，以去除/收集根部最外层的黄色物质（牙骨质）。当较浅的（白色）牙本质材料开始显露时，停止收集。
        注意：必须使切割钻头的旋转方向与收集盘的位置相匹配，以避免粉末气溶胶化，并防止样本完全偏离收集盘造成浪费。牙骨质中的DNA含量尤为丰富；然而，其通常的采样量远小于其他解剖部位的样本（约7–20 mg）。11,27,28.
      7. 使用精度至少为 0.01 mg 的密闭天平，称量并记录收集在称量纸上粉末的质量（参见 材料表).
      8. 将粉末从称量纸转移至2 mL低吸附安全锁管中用于提取。储存于-20 °C，无限期地。
    2. 牙髓腔取样
      1. 在收集完牙骨质后（如需要），使用珠宝锯沿釉牙骨质界对磨牙进行切割，以去除牙冠（参见 图2).
      2. 将一张新的称量纸放入一个新的称量盘中。
      3. 将冠部固定在手持夹具或台钳中，置于称量盘上方。持握切割面倾斜向下，使用配备细径钻头的牙科钻机进行钻取或刮取，作为第一次操作（参见 材料表) 沿冠部牙髓腔边缘（见 图2).
        注意：仅收集牙髓腔内部的初次冲洗液，并标记为牙髓组织（典型产量为5-15 mg）；进入牙齿更深层的部分均视为牙本质。
      4. 将牙齿翻转，使下部朝下，用锤子轻敲夹具，并在称量纸上收集释放出的粉末。
      5. 使用精度至少为 0.01 mg 的密闭天平，记录称量纸上收集的粉末重量（参见 材料列表).
      6. 将粉末从称量纸转移至2 mL低吸附安全锁扣管中用于提取。储存于-20 °C，无限期地。
    3. 牙本质取样
      1. 将一张新的称量纸放入一个新的称量盘中。
      2. 将冠部样本置于称量盘上方（参照步骤 3.2.2.3），钻取并收集额外的 50–100 mg 牙本质，使用封闭式精度为 0.01 mg 的天平进行称量（见 材料表) 以相同方式从髓室内部进行进一步的牙本质取样（参见 图2).
      3. 将骨粉从称量纸转移至2 mL低吸附安全锁扣管中用于提取。储存于-20 °C，无限期地。
      4. 将剩余的牙齿碎片/多余粉末储存于干燥、温度可控（25 °C无菌环境，直至完成返回或遣返。
      5. 将所有废弃物置于可高压灭菌的生物危害袋或容器中处理。每次取样之间，根据需要使用漂白剂/DNA去污溶液/乙醇以及紫外线（波长：254 nm）对所有可重复使用的设备（如钳子、钻头、钻机、锯子等）进行灭菌/去污。

显示牙骨质、牙根、牙髓腔和牙本质及其测量值的牙齿结构示意图。
图 2：永久性磨牙采样前处理。（A）采样前的预处理磨牙，显示牙冠、牙骨质（牙根的淡黄色层）以及牙骨质-釉质交界处的切割位置。（B）采集牙骨质后的同一颗磨牙，显示在牙骨质-釉质交界处的切口位置。（C）切割并采样后的磨牙，显示牙冠内牙髓腔和牙本质的解剖学采样位置。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 胸椎取样
    1. 椎体取样
      1. 所有取样操作均须在配备紫外灯（波长：254 nm）的PCR工作台或生物安全柜内的专用洁净室中进行，且气流应关闭。在实验台表面铺上无菌铝箔，以收集散落的骨粉或骨碎片。
      2. 在丢弃铝箔前，确保回收所有骨碎片及尽可能多的骨粉（用于归还）。每次取样后更换铝箔，并将使用过的铝箔丢弃至可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
      3. 将一小张称量纸放入标准称量盘中。
      4. 用夹具或台钳固定椎骨，使椎体朝外。
      5. 将椎骨置于称量盘上方，椎体倾斜向下。使用配备小直径钻头的牙科钻（见材料表），调至低速高扭矩模式，沿椎体松质骨周围皮质骨的最外缘（下缘和上缘）进行钻取（见图3）。
      6. 将钻头在皮质层上刮擦，使骨粉落入标准称量盘中，直至收集到50–100 mg材料，使用精度为0.01 mg的密闭天平进行称量（见材料表）。
      7. 将称量纸上的骨粉转移至2 mL低吸附安全锁扣管中用于提取。可长期储存于-20 °C。
    2. 上椎弓取样
      注：此步骤为可选。使用配备小直径钻头的牙科钻（见材料表），沿表面刮擦去除上椎弓皮质骨的最外层19。此方法不建议用于椎体取样，因为椎体的皮质骨层通常非常薄，该过程可能导致其完全耗尽（见第2节中的注）。
      1. 将一小张称量纸放入标准称量盘中。
      2. 用台钳固定椎骨，使椎突朝外，上部朝下。
      3. 手持椎骨，上部朝下，置于称量盘上方，使用配备小直径钻头的牙科钻（见材料表），调至低速高扭矩模式，向上钻入由棘突与椎板融合形成的V形切迹中心（见图3）。
      4. 当阻力明显下降时停止钻取。略微改变钻取位置并重复操作，直至收集到50–100 mg骨粉，使用精度为0.01 mg的密闭天平进行称量（见材料表）。
      5. 将称量纸上的骨粉转移至2 mL低吸附管中用于提取。可长期储存于-20 °C。
      6. 将剩余骨组织或多余骨粉储存于干燥、温度可控（25 °C）的无菌环境中，直至归还。
      7. 所有废弃物应丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。每次取样之间，根据需要使用漂白剂/DNA去污染溶液/乙醇及紫外线（波长：254 nm）照射对所有可重复使用的设备（如夹具、钻头、钻机、锯子等.）进行灭菌/去污染处理。

椎骨解剖图，标注椎体和上位椎弓，用于教学。
图3：胸椎椎体及上位椎弓皮质骨的解剖采样位置。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 远节指骨取样
    注意：此步骤为可选。使用配备细径钻头的牙科钻，沿骨干和/或末节指骨远端甲粗隆表面刮除并弃去最外层的皮质骨19。对于皮质骨过薄的样本或未成年个体遗骸，该操作可能无法实施（参见第2节中的“注意”）。
    1. 所有取样操作均应在专用洁净室中进行，并在配备紫外灯（波长：254 nm）的PCR工作台或生物安全柜内完成，操作时关闭气流。在实验台面上铺覆无菌铝箔，以收集散落的骨粉或骨碎片。
    2. 在丢弃铝箔前，确保回收所有骨碎片及尽可能多的骨粉（用于归还）。每次取样后更换新的铝箔，并将使用过的铝箔丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
    3. 将一小张称量纸放入标准称量盘中。
    4. 将样本固定于手持夹具或台钳中，使骨的上面朝上。
    5. 将样本置于称量盘上方，使用配备细径钻头的牙科钻（见材料表），从甲粗隆和骨干的下面开始，钻取皮质骨最外层致密部分产生的骨粉（见图4）。
    6. 当钻取阻力明显下降时即停止钻取，因这表明已进入较疏松的松质骨区域。从初始钻孔位置向外周扩展重复该过程，直至收集到至少50–100 mg骨粉，使用精度为0.01 mg的密闭天平进行称量（见材料表）。
    7. 将称量纸上的骨粉转移至2 mL低吸附、安全锁扣管中用于后续提取。可长期保存于-20 °C条件下。
    8. 将剩余骨组织或多余骨粉储存于干燥、温度可控（25 °C）的无菌环境中，直至归还或返还。
    9. 所有废弃物应丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。每次取样之间，应对所有可重复使用的设备（如夹具、钻头、钻机、锯子等）使用漂白剂、DNA去污染溶液、乙醇及紫外照射等方式进行灭菌/去污染处理。
      注意：对于较小的样本（例如未成年个体样本），可取样的皮质骨量可能远低于建议的50–100 mg。然而，即使取样量较少，该解剖部位已被证明富含DNA11。

显示骨干和远端小梁处致密皮质骨取样位置的骨碎片示意图，比例尺为5 cm。
图4：远节指骨，显示骨干及远端小梁下侧致密皮质骨的分布位置。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 距骨取样
    1. 所有取样操作均须在专用洁净室内的配备紫外灯（波长：254 nm）的PCR工作台或生物安全柜中进行，且操作时气流应关闭。在实验台表面铺覆无菌铝箔，以收集可能散落的骨粉或骨碎片。
    2. 在丢弃铝箔前，确保回收所有骨碎片及尽可能多的骨粉（用于归还）。每次取样后更换新的铝箔，并将使用过的铝箔丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
    3. 将一小张称量纸放入标准称量盘中。
    4. 将样本固定于手持夹具或台钳中，使穹顶面朝上。
    5. 手持距骨，使其穹顶面朝上，内侧面朝向操作者，置于称量盘上方。使用牙科钻机（配备细径钻头，参见材料表），以低速高扭矩设置，从距骨颈部刮取皮质骨，深度约为1 mm（见图5）。
    6. 轻微改变钻取位置并重复操作，直至收集到约50–100 mg的骨粉，使用精度为0.01 mg的密闭天平进行称量（参见材料表）。
    7. 将称量纸上的骨粉转移至2 mL低吸附管中，用于后续提取。可长期储存于-20 °C条件下。
    8. 将剩余骨组织或多余骨粉储存于干燥、温度可控（25 °C）的无菌环境中，直至完成归还或返还程序。
    9. 所有废弃物应丢弃至可高压灭菌的生物危害袋或容器中。每次取样之间，须根据具体情况使用漂白剂、DNA去污溶液、乙醇及紫外线（波长：254 nm）照射对所有可重复使用的设备（如夹具、钻头、钻机、锯子等）进行灭菌或去污染处理。

骨骼解剖学研究，标注的距骨内侧颈面，比例尺，考古学分析。
图 5：距骨皮质骨回收的取样区域。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：距骨的皮质骨极少（仅为一层薄的外层）。取材时不仅应采集表面，还应包括其下方的致密松质骨层。

结果

在另一项研究中11从11名个体每个解剖采样部位获得的骨粉中，采用针对钙化组织中短片段DNA优化的标准DNA提取方案提取DNA2单链文库随后被构建28 在 HiSeq 4000 平台（75 bp 双端测序）上进行测序，每个样本测序深度约为 20,000,000 条读长。随后使用 EAGER 分析流程对获得的序列数据进行内源性人类 DNA 含量评估。29 （BWA 设置：种子长度为 32，错配罚分为 0.1，比对质量过滤阈值为 37）。所有代表性结果均采用与 Parker 等 2020 年研究相同的指标进行报告。11 为保持一致性。文库来自样品粉末部分的 岩部 平均而言，产生的内源性DNA高于所调查的其他23个解剖采样部位中的任何一个（图6A-B）。本方案中提供的其余七个解剖采样部位（恒磨牙的牙骨质、牙髓腔初次冲洗液及牙本质；胸椎椎体和上椎弓的皮质骨；远端指骨远端丛状突的皮质骨；以及距骨颈部的皮质骨）获得了次高的产量（这些解剖采样部位之间的产量差异无统计学意义； 图6A-B；补充文件1： 内源性DNA预建库）。这些替代取样部位均能稳定产生足以满足标准群体遗传学分析（如线粒体分析和单核苷酸多态性（SNP）分析）所需的DNA产量。来自所有解剖取样部位文库的重复率均较低（簇因子 < 1.2（平均值），计算方法为所有比对读段数与唯一比对读段数的比值， 表2；补充文件1：ClusterFactor），表明所筛选的所有文库均具有极高的复杂度。类似地，外源性人类DNA污染的平均估计值较低，平均为 < 2%（雄性样本中X染色体污染，n = 7，由ANGSD报告）30 除上椎弓外的所有解剖采样位置（平均估计污染率为2.11%，其中一份样本因属异常值被剔除；KRA005：19.52%，见 表2；补充文件1：污染）。平均片段长度（过滤去除所有读段后） < 30 bp）在从牙髓腔和牙本质采集的材料中最低，其他解剖采样部位之间无显著差异（分别为55.14 bp和60.22 bp，相较于平均中位数62.87，成对p值 < 0.019, 表2；补充文件1：平均片段长度）。此外，牙齿和胸椎各自包含多个解剖学取样位点，这些位点均观察到较高的内源性DNA得率，因此特别适合作为替代材料 岩部.

显示人类DNA比例和唯一比对读段的DNA回收与比对分析，箱线图。
图6：所有筛选样本的人类DNA含量。 黑色线条表示总体均值，红色线条表示中位数（实线：人类DNA比例，虚线：每百万条测序读段中比对到人类基因组的唯一读段数）。在所有分析中，平均人类DNA比例高于总体均值（8.16%）的各个解剖采样位置均以颜色标注。（A）比对到hg19参考基因组的读段比例。蓝色虚线表示根据分析流程的比对参数所计算的理论最大值（使用Gargammel31模拟从hg19参考基因组随机分布的5,000,000条读段，并加入模拟损伤）。对于平均人类DNA比例高于总体均值的样本，图中报告了其个体均值（黑色X）和中位数（红色圆圈）。置信区间表示排除统计异常值后的上下限。（B）每百万测序读段（75 bp双端测序）中唯一比对到hg19参考基因组的读段数量。置信区间表示排除统计异常值后的上下限。本图改编自Parker, C. 等，202011。请点击此处查看此图的放大版本。

表2：所有解剖采样部位的平均重复水平（比对上的读段数/唯一读段数）、平均片段长度与中位片段长度，以及X染色体污染估计值。 误差以均值的标准误表示。本表改编自 Parker, C. 等，202011。

采样地点平均重复因子（#比对上的读段数 / #唯一比对上的读段数）平均片段长度（bp）X染色体污染的平均估计比例
岩骨锥体1.188 ± 0.00665.40 ± 1.360.000 ± 0.003
牙骨质1.197 ± 0.02867.28 ± 1.760.011 ± 0.003
牙本质1.188 ± 0.06160.22 ± 2.370.002 ± 0.007
牙髓1.179 ± 0.02455.14 ± 2.900.013 ± 0.006
远节指骨1.191 ± 0.04965.95 ± 1.080.013 ± 0.005
椎体1.194 ± 0.03766.14 ± 1.030.008 ± 0.003
上椎弓1.19 ± 0.01763.02 ± 1.230.021 ± 0.009*
距骨1.198 ± 0.01068.20 ± 1.240.011 ± 0.003
*样本 KRA005 因偏离值被移除，其数值为 0.1952

代码可用性
本研究中使用的所有分析程序和R模块均可从其相应作者处免费获取。所有自定义的R代码可根据要求提供。

数据可用性
用于计算代表性结果的所有原始数据均可在欧洲核苷酸档案库（European Nucleotide Archive ENA）中免费获取（登录号 PRJ-EB36983），或见Parker, C. 等人11的补充材料。

补充文件 1。 请点击此处下载该文件。

讨论

目前，在古人类群体遗传学研究中，优先选择从pars petrosa（步骤2.1）取样。然而，pars petrosa往往难以获取，因为它在多种骨骼评估中具有重要价值（例如，群体历史32、胎儿死亡年龄估算33以及性别鉴定34）；此外，历史上为DNA分析而取样pars petrosa可能造成严重的破坏性3,4（包括本文所介绍的方案，尽管目前已有多种新型微创取样方案13,14被广泛采用，以缓解这一问题）。更为复杂的是，直到最近之前，学界尚未开展大规模、系统性的人体骨骼各部位DNA提取效果研究11，因此当无法获取岩骨锥体时，确定合适的取样策略极具挑战性。

本文提供的方案通过一系列优化的DNA取样操作流程，有助于缓解这一挑战，这些流程适用于考古学和法医学骨骼遗骸的DNA取样，包括pars petrosa以及另外四种骨骼元素上的七个替代解剖取样部位。所包含的关键步骤均旨在最大限度地减少因取样效率低下（步骤2.1.6和3.2.1.3）或在钻孔/切割过程中样品过热（步骤3.1.6）而导致的DNA丢失或损伤。此外，本方案中多次指出，可能需要修改或省略预处理步骤，以确保在高度降解的样本中获得最佳效果。还应注意的是，即使在本文所列的选定骨骼部位中，仍存在多种可能的替代取样技术（特别是针对pars petrosa13,14），并且本文提出的尚未被充分开发的解剖取样部位仍有很大的进一步优化空间（例如， 距骨：步骤2.5，以及椎骨：步骤2.3）。

还需要注意的是，这些实验方案的设计与测试均基于形态保存良好（形态学保存状况优良）的古代青少年至成年个体遗骸，旨在进行内源性人类DNA分析。所呈现的结果可能不适用于降解程度更高的材料、其他保存环境、婴儿遗骸、非人类遗骸，或病原体与微生物组的研究，因为这些方案在更多情境下的应用仍需进一步探索。此外，本文所介绍的替代骨骼样本（牙齿、椎骨、远端指骨和距骨）在混合遗骸中可能难以准确归属到单一个体，因此有必要从多个骨骼部位取样，以确保样本来源的单一性。尽管存在这些局限性，广泛公开这些实验方案有助于缓解样本选择与处理过程中存在的部分异质性问题，为未来各类人类遗骸的古DNA/法医学研究提供一个通用且经过定量优化的框架。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

作者谨向马克斯·普朗克人类历史科学研究所的实验室工作人员致以诚挚感谢，感谢他们在本实验方案的开发与实施过程中提供的帮助。若无古多·布兰特博士、伊丽莎白·尼尔森博士、安特耶·维塞戈特和弗朗西斯卡·阿隆的贡献与辛勤工作，本研究将无法完成。本研究由马克斯·普朗克学会、欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下资助，资助协议编号分别为771234 - PALEoRIDER（WH, ABR）和起始资助编号805268 CoDisEASe（授予KIB）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#16 牙科钻头NTIH1-016-HP示例钻头
0.6 mm 带锯条Fisher Scientific50-949-097珠宝锯用锯条
22 mm 金刚石切割轮KahlaSKU 806 104 358 514 220Dremel 切割附件
市售漂白剂Fisher ScientificNC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme 铝箔Fisher Scientific15-078-29X
DNA LoBind 管（2 mL）Eppendorf22431048
Dremel 225-01 柔性轴附件Dremel225-01Dremel 柔性延长杆
Dremel 4300 旋转工具Dremel4300示例电钻
Dremel 夹头和螺母套件Dremel4485用于各种 Dremel 工具附件/钻头的转接器
Eagle 33 加仑红色生物危害废物袋Fisher Scientific17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL 微量离心管Fisher Scientific13-698-792
乙醇（分子生物学级）Millipore Sigma1.08543
FDA 批准的 2 级外科口罩Fisher Scientific50-206-0397个人防护装备
Fisherbrand 舒适型腈手套Fisher Scientific19-041-171X个人防护装备
Fisherbrand 安全护目镜Fisher Scientific19-130-208X个人防护装备
Granger 固定式台虎钳Fisher ScientificNC1336173台式虎钳
Invitrogen UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水Fisher Scientific10-977-023
珠宝锯Fisher Scientific50-949-231
Kimwipes 纸巾Sigma-AldritchZ188956
Labconco Purifier Logic 生物安全柜Fisher Scientific30-368-1101
LookOut DNA EraseMillipore SigmaL9042-1L
中号称量舟Heathrow ScientificHS120223
MSC 10 件套钳子/夹具组Fisher Scientific50-129-5352杂项 夹具/虎钳，用于在钻孔/切割时牢固固定样品
Sartorius Quintix 半微量天平Fisher Scientific14-560-019封闭式天平
带连体头罩的 Tyvek 防护服Fisher Scientific01-361-7X个人防护装备
称量纸Heathrow ScientificHS120116

参考文献

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DNA
优化的骨骼取样方案用于从考古遗存中提取古DNA
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