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内源性Drosophila瞬时受体电位通道的纯化

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DOI：

10.3791/63260

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2021年12月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

根据INAD蛋白复合物的组装机制，本方案采用改良的亲和纯化结合竞争策略，以纯化内源性的Drosophila TRP通道。

摘要

Drosophila 光转导是目前已知最快的G蛋白偶联信号通路之一。为了确保该信号级联的特异性和高效性，钙离子（Ca2+）可通透的阳离子通道——瞬态感受器电位（TRP）通道——与支架蛋白无后电位D（INAD）紧密结合，并与眼组织特异性的蛋白激酶C（ePKC）以及磷脂酶Cβ/无感受器电位A（PLCβ/NORPA）共同形成一个大型信号蛋白复合物。然而，Drosophila TRP通道的生化特性仍不明确。基于INAD蛋白复合物的组装机制，本研究建立了一种改进的亲和纯化结合竞争策略，用于纯化内源性TRP通道。首先，将纯化的带有组氨酸（His）标签的NORPA 863-1095片段结合至镍柱（Ni-beads），作为诱饵从Drosophila 头部匀浆中捕获内源性INAD蛋白复合物。随后，向镍柱中加入过量的纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签TRP 1261-1275片段，以竞争性置换TRP通道。最后，通过尺寸排阻色谱法将上清液中的TRP通道与过量的TRP 1261-1275肽段分离。该方法使得从生物化学和结构角度研究Drosophila TRP通道的门控机制成为可能。未来还可进一步检测纯化后的Drosophila TRP通道的电生理特性。

引言

光转导是一个将吸收的光子转化为神经元电信号的过程。该过程在脊椎动物和无脊椎动物中均特异性地依赖视蛋白及其下游的G蛋白偶联信号级联反应。在 果蝇， 通过其五个PDZ结构域，支架蛋白inactivation-no-after-potential D（INAD）组织形成一个包含瞬时受体电位（TRP）通道、磷脂酶Cβ/无受体电位A（PLCβ/NORPA）以及眼特异性蛋白激酶C（ePKC）的超分子信号复合物1该超分子信号复合物的形成确保了其正确的亚细胞定位、高效性及特异性 黑腹果蝇 光转导机制。在此复合物中，光敏感的TRP通道作为NORPA的下游效应器，介导钙离子内流和感光细胞的去极化。先前的研究表明，TRP通道的开放 黑腹果蝇 TRP通道由质子、局部脂质环境的破坏或机械力介导2,3,4。该 果蝇 TRP 通道也与钙调蛋白相互作用5 并通过正反馈和负反馈受钙的调节6,7,8.

迄今为止，关于门控机制的电生理学研究 果蝇 TRP 和 TRP 样（TRPL）通道基于分离的野生型细胞的膜片钳记录和全细胞记录 黑腹果蝇 光感受器，以及在S2、SF9或HEK细胞中异源表达的通道2,9,10,11,12,13，但不作用于纯化的通道。全长蛋白的结构信息 黑腹果蝇 TRP 通道的机制仍不明确。为了在重建的膜环境中研究纯化蛋白的电生理特性，并获得全长蛋白的结构信息 果蝇 TRP通道，获得纯化的全长TRP通道是必要的第一步，类似于哺乳动物TRP通道研究中所采用的方法14,15,16,17.

最近，基于INAD蛋白复合物的组装机制18,19,20，研究人员首次开发了一种亲和纯化结合竞争策略，利用链霉亲和素磁珠从黑腹果蝇（Drosophila）头部匀浆中纯化TRP通道蛋白5。鉴于链霉亲和素磁珠容量较低且成本较高，本文介绍了一种改进的纯化方案，该方案采用带有His标签的诱饵蛋白及相应低成本的镍柱磁珠（Ni-beads），后者具有更高的结合容量。该方法将有助于从结构角度研究TRP通道的门控机制，并利用纯化的蛋白测量TRP通道的电生理特性。

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方案

1. GST标签TRP和His标签NORPA片段的纯化

  1. 纯化带有 GST 标签的 TRP 1261-1275 片段
    1. 转化 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 质粒10 进入 大肠杆菌（Escherichia coli） BL21 (DE3) 细胞采用 CaCl₂2 热激转化法21. 挑取单菌落接种于10 mL Luria Bertani（LB）培养基中，37℃过夜培养 °C. 然后，在37℃下将10 mL种子培养物扩增至1 L LB培养基中 °C.
    2. 在光密度（OD600) 细胞密度达到 0.5 时，将细胞冷却至 16 °C，并加入 0.1 mM 异丙基-β-硫代半乳糖苷 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG；终浓度）以诱导目标蛋白的过表达，并于16℃培养 °4 ℃孵育 18 小时。
    3. 过表达后，通过在 3,993 × g 离心收集 1 L 培养细胞菌体 × g 孵育20分钟，然后重悬于40 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    4. 将重悬的细胞加入预冷至4℃的高压均质机中 °C. 缓慢将匀浆器压力升至 800 bar。打开入口旋塞，使重悬的细胞循环通过具有极窄狭缝的阀门。
      注意：细胞通过由大压降和空化作用引起的高度剪切力进行匀浆。
    5. 将5 mL谷胱甘肽琼脂糖珠装入重力流层析柱中，用50 mL PBS缓冲液洗涤琼脂糖珠，共洗涤三次。
    6. 将来自高压均质机的细胞裂解液在 48,384 x g将离心后的细胞裂解液上清液（40 mL）加入重力流层析柱中已平衡的谷胱甘肽琼脂糖珠，4 ℃孵育30分钟 °C. 每10分钟重悬一次谷胱甘肽珠。
    7. 孵育30分钟后，打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。弃去流出组分。用50 mL PBS缓冲液将剩余的谷胱甘肽珠子洗涤两次。
    8. 向谷胱甘肽琼脂糖珠中加入15 mL洗脱缓冲液，孵育30分钟，每10分钟重悬一次珠子。
    9. 孵育30分钟后，将GST标签的TRP 1261-1275片段洗脱至50 mL锥形管中，并上样至尺寸排阻层析柱（制备级），该层析柱已用50 mM Tris缓冲液（pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT）平衡。
    10. 将凝胶过滤柱的洗脱流速保持在3 mL/min，以每管5 mL的速率收集洗脱出的蛋白质。
    11. 通过分析尺寸排阻柱在280 nm处的紫外吸收信号确定目标蛋白的峰，并通过SDS-PAGE凝胶电泳验证（电泳参数：浓缩胶150 V，分离胶200 V）。使用考马斯亮蓝R250染色凝胶。
    12. 使用 15 mL 超滤离心管，在 3,000 x g 条件下离心，将从凝胶过滤柱中纯化的 GST 标签 TRP 1261-1275 片段浓缩至 1 mL g 在4℃下 °在台式制冷离心机中离心。
    13. 使用比尔-朗伯定律测定浓缩蛋白的浓度。利用分光光度计在280 nm处测定GST标签的TRP 1261-1275片段的紫外吸收值。
    14. 通过将蛋白质序列导入 Protparam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）获取在 280 nm 处的消光系数。通常，1 L 表达 GST 标签 TRP 1261-1275 的培养液可获得 1 mL 浓度为 600 μM 的蛋白质（6 × 10）-7 摩尔）。参见 表1 所需材料。
  2. His标签NORPA 863-1095片段的纯化
    1. 转化 pETM.3C NORPA 863-1095 质粒20 进入 大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞采用 CaCl₂2 热激转化法21. 挑取单菌落接种于10 mL LB培养基中，37℃过夜培养 °C. 然后，在37℃下，将10 mL种子培养物扩增于1 L LB培养基中 °C.
    2. OD测定后600 当细胞密度达到0.5时，将细胞冷却至16 °C，加入0.1 mM IPTG（终浓度）以诱导目标蛋白的过表达，并于16℃继续培养 °4 ℃孵育 18 小时。
    3. 过表达后，通过在 3,993 × g 离心收集 1 L 培养细胞菌体 x g 孵育20分钟，然后在40 mL结合缓冲液中重悬。接着，在4 ℃下使用高压均质机裂解重悬的细胞 °C，如步骤 1.1.4 中所述。
    4. 将5 mL Ni-琼脂糖珠装入重力流层析柱，用50 mL结合缓冲液洗涤三次。
    5. 将来自高压均质器的细胞裂解液在 48,384 x g将离心后的细胞裂解液上清液加入重力流层析柱中已平衡的 Ni-琼脂糖微珠，4 ℃孵育 30 分钟 °C. 每10分钟重悬一次Ni-琼脂糖珠。
    6. 孵育30分钟后，打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。弃去流出组分，并用50 mL洗涤缓冲液将剩余的Ni-珠子洗涤两次。
    7. 向 Ni-beads 中加入 15 mL 洗脱缓冲液，孵育 30 分钟。每 10 分钟重悬 Ni-beads 一次。
    8. 孵育30分钟后，收集洗脱的His标签NORPA 863-1095片段至50 mL锥形管中，并上样至已用50 mM Tris（pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT）平衡的尺寸排阻层析柱（制备级）。
    9. 将凝胶过滤柱的洗脱流速保持在3 mL/min，以每管5 mL收集洗脱蛋白。
    10. 通过分析尺寸排阻柱在280 nm处的紫外吸收信号确定目标蛋白的峰，并通过SDS-PAGE凝胶电泳验证（电泳参数：浓缩胶150 V，分离胶200 V）。使用考马斯亮蓝R250染色凝胶。
    11. 使用 15 mL 超滤离心管，在 3,000 x g 条件下离心，将从凝胶过滤柱中纯化的 His 标签 NORPA 863-1095 片段浓缩至 1 mL g 4 ℃时 °在台式制冷离心机中离心。
    12. 使用比尔-朗伯定律测定浓缩蛋白的浓度。利用分光光度计在280 nm处测定His标签NORPA 863-1095片段的紫外吸收值。
    13. 通过将蛋白质序列导入 Protparam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）获取在 280 nm 处的消光系数。通常，1 L 培养的 His 标签 NORPA 863-1095 片段可获得 1 mL 浓度为 600 μM 的蛋白质（6 × 10）-7 摩尔）。参见 表 2 所需材料。

2. 准备 果蝇 头部

  1. 使用 CO2 麻醉法将成年果蝇收集到 50 mL 圆锥形离心管中22,23；立即在液氮中冷冻 10 分钟，并储存于 -80°C 冰箱中。
  2. 收集足够数量的果蝇后，手动剧烈振荡冷冻的 50 mL 圆锥形管，以分离果蝇的腿部、头部、翅膀和身体。将混合物转移至三个依次叠放的预冷不锈钢筛网（筛网目数分别为 20、30 和 40）中，并振荡筛网。
  3. 随后，由于头部无法通过 40 目筛网，使用刷子将果蝇头部从 40 目筛网上扫下，转移至 50 mL 圆锥形管中，并在 −80 °C 下保存。
  4. 持续收集果蝇及其头部，并储存在 -80 °C 冰箱中，直至达到实验所需的数量（0.5 g）。通常，收集 0.5 g 头部需要 50 mL 圆锥形管中的果蝇约 35 mL。所需材料见表 3。

3. Drosophila TRP 通道纯化

  1. 称取总计 0.5 g 头部组织，使用预冷的研钵和研杵在液氮中彻底匀浆。将匀浆后的头部组织溶于 10 倍体积/重量的裂解缓冲液（5 mL）中，4 °C 条件下在摇床中孵育 °C 下 20 分钟，然后在 20,817 x g 4℃下持续20分钟 °C.
  2. 收集离心后的上清液（"20817 g S", 图4) 并在 100,000 x g 在4℃下持续60分钟 °C. 使用离心后的上清液（"100,000 g S", 图4用于以下的下拉实验。
  3. 将1 mL Ni-琼脂糖珠加入重力流层析柱中，用10 mL双蒸水洗涤琼脂糖珠2O (ddH₂O)24 ℃下 °C，共三次。用10个柱体积的裂解缓冲液在4℃下平衡珠子三次 °C.
  4. 加入500 µ600 L µM 纯化的 His 标签 NORPA 863-1095 蛋白（3 × 10-7 将 mol) 加入 Ni 柱中，在 4 °C 下孵育 30 分钟 °C. 每10分钟重悬一次珠子。
  5. 打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。取流出组分进行SDS-PAGE分析（NORPA F， 图4在此部分，将诱饵蛋白固定于镍珠上。
  6. 用 10 柱体积（10 mL）裂解缓冲液在 4 ℃ 下洗涤 Ni-琼脂糖珠 °C，并将洗涤组分保留用于SDS-PAGE分析（洗涤1， 图4A）。重复上述步骤，并将样品保留用于SDS-PAGE分析（洗涤2， 图4A在此步骤中，去除Ni-琼脂糖珠上过量的诱饵蛋白。
  7. 加入上清液 果蝇 100,000 × g 离心后的头部匀浆 g 在4℃下通过离心将样品加入Ni柱中 °C，其中His标签的NORPA 863-1095片段已被固定。
  8. 将上清液与 Ni-beads 在 4 °C 下孵育 °在30分钟内每10分钟重悬一次珠子。然后打开柱出口活塞，分离珠子与流出组分。
  9. 收集上清液用于SDS-PAGE分析（Dro head lysis F， 图4A在此部分，通过固定在Ni-琼脂糖珠上的NORPA 863-1095片段捕获头部匀浆中的INAD蛋白复合物（INAD/TRP/ePKC）。
  10. 用 10 倍柱体积的裂解缓冲液（10 mL）在 4 ℃ 下洗涤 Ni-琼脂糖珠 °C，将重力沉淀后的上清液保留用于SDS-PAGE分析（洗涤3， 图4A）。重复上述步骤，并收集上清液用于SDS-PAGE分析（洗涤4， 图4A在此步骤中，去除Ni-琼脂糖珠上未结合的蛋白质。
  11. 加入500 µ600 L µM 的 GST 标签 TRP 1261-1275 蛋白（3 × 10-7 将 mol 加入 Ni-珠中，在 4 °C 下孵育 20 分钟 °C. 每10分钟重悬一次珠子。
  12. 从重力柱中收集洗脱组分（TRP E1， 图4B），其中含有内源性的 果蝇 TRP 通道。重复上述步骤，收集洗脱组分（TRP E2， 图4B在此步骤中，利用GST标签的TRP 1261-1275片段作为竞争剂，将TRP通道从Ni-琼脂糖珠上捕获的INAD蛋白复合物（INAD/TRP/ePKC）中洗脱下来。
  13. 用 10 倍柱体积的结合缓冲液（10 mL）洗涤 Ni-琼脂糖珠 表1) 在 4 °C，收集洗涤组分用于 SDS-PAGE 分析（洗涤 5， 图4B).
  14. 加入500 µ洗脱缓冲液 L（表1)加入Ni-琼脂糖珠中，4℃孵育20分钟 °C. 收集重力流柱的洗脱组分（NORPA E1， 图4B）。重复上述步骤，收集洗脱组分（NORPA E2， 图4B).
  15. 使用洗脱缓冲液洗脱伴随 INAD/ePKC 蛋白复合物的 His 标签 NORPA 863-1095 片段。接着，将 Ni 珠重悬于 500 µL 结合缓冲液。
  16. 将重悬的Ni-琼脂糖珠取样进行SDS-PAGE（考马斯亮蓝R250染色），以分析洗脱效率并评估洗脱缓冲液是否有效（琼脂糖珠， 图4B）。参见 表 4 所需材料。

4. 凝胶过滤层析纯化 果蝇 TRP通道

  1. 在蛋白纯化系统上安装尺寸排阻色谱柱（分析级），并用色谱柱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，2 mM DTT，0.75 mM DDM）平衡色谱柱，缓冲液需经0.45 µm滤膜过滤。
  2. 使用4 mL超滤离心管，在4 °C下以3,000 x g离心，浓缩第3.14步获得的TRP E1和E2组分。
  3. 用色谱柱缓冲液冲洗进样环，将样品加入进样环中，然后将样品注入尺寸排阻色谱柱，并以适当的流速（0.5 mL/min）洗脱蛋白。
  4. 通过280 nm处的吸光度确定目标蛋白的峰，并运行SDS-PAGE凝胶以检测纯化的内源性Drosophila TRP通道（图5）。所需材料见表5。

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结果

本文展示了一种用于纯化内源性蛋白质的蛋白质纯化方法 果蝇 TRP通道（图1).

首先，通过重组蛋白表达与纯化方法获得诱饵蛋白和竞争蛋白。随后，在体外表达带有GST标签的TRP 1261-1275片段 E. coli BL21 (DE3) 细胞在 LB 培养基中培养，并使用谷胱甘肽微珠和尺寸排阻柱进行纯化（图2). 使用考马斯亮蓝R250染色的SDS-PAGE分析对样品进行验证。在SDS-PAGE样品制备过程中， 30 µL 蛋白样品与 10 µL 4×上样染料并煮沸于 100 °C 10分钟。然后， 15 µL 煮沸后的样品分别加入到每个孔中。带有His标签的NORPA 863-1095片段也以类似方式表达于 E. coli BL21 (DE3) 细胞在 LB 培养基中培养，并通过镍珠和尺寸排阻柱纯化（图3). ...

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讨论

INAD 含有五个 PDZ 结构域，是 Drosophila 光传导机制的核心组织者。先前的研究表明，INAD 的 PDZ3 结构域以极高的特异性结合 TRP 通道的 C 末端尾部（KD = 0.3 µM）18。INAD 的 PDZ45 串联结构域与 NORPA 的 863-1095 片段具有极强的结合亲和力（KD = 30 nM）。这些发现为设计亲和纯化结合竞争策略提供了坚实的生物化学基础，使得 NORPA 的 CC-PBM 片段可作为拉下实验的诱饵，而 TRP 的 C 末端尾部（片段 1261-1275）则作为竞争性试剂发挥作用。因此，该方法的第一个关键点在于理解 INAD 复合物的组装机制，并获得足量的 NORPA 和 TRP 片段。同时，由于 TRP 通道是一种膜蛋白，需要从膜中提取并在溶液中保持稳定，因此去垢剂的使用是该方法的第二个关键点。作为一种常用于 TRP 通道结构与功能研究的去垢剂24,25，正...

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（No. 31870746）、深圳市基础研究计划（JCYJ20200109140414636）和中国广东省自然科学基金（No. 2021A1515010796）对 W. L. 的资助。我们感谢 LetPub（www.letpub.com）在本论文撰写过程中提供的语言学协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细菌菌株
BL21(DE3) 感受态细胞Novagen69450蛋白过表达
实验模型
D.melanogaster: W1118 品系布卢明顿果蝇资源中心BDSC:3605果蝇头部制备
材料
20/30/40 目不锈钢筛网九丰金属网公司GB/T6003.1果蝇头部制备
30% 丙烯酰胺-N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（29:1）LableadA3291SDS-PAGE 凝胶制备
过硫酸铵InvitrogenHC2005SDS-PAGE 凝胶制备
蛋白酶抑制剂混合物Roche05892953001蛋白酶抑制
考马斯亮蓝 R-250生工生物A100472-0025SDS-PAGE 凝胶染色
DL-二硫苏糖醇（DTT）生工生物A620058-0100凝胶过滤层析缓冲液制备
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）生工生物A500838-0500凝胶过滤层析缓冲液制备
甘氨酸生工生物A610235-0005SDS-PAGE 缓冲液制备
谷胱甘肽 Sepharose 4 快流速珠Cytiva17513202亲和层析
咪唑生工生物A500529-0001Ni柱洗脱缓冲液制备
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）生工生物A600168-0025蛋白过表达诱导
LB 培养基粉末生工生物A507002-0250大肠杆菌细胞培养
还原型 L-谷胱甘肽（GSH）Sigma-aldrichG4251-100G谷胱甘肽珠洗脱缓冲液制备
Ni-Sepharose excel 珠Cytiva17371202亲和层析
N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）生工生物A610424-001蛋白纯化用去垢剂
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE 凝胶制备
PBS生工生物E607008-0500大肠杆菌细胞匀浆缓冲液
PMSFLableadP0754-25G蛋白酶抑制
预染蛋白 MarkerThermo Scientific26619/26616预染蛋白 ladder
凝胶过滤层析柱（制备级）Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 PG 柱
凝胶过滤层析柱（分析级）Cytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL 柱
氯化钠生工生物A501218-0001蛋白纯化缓冲液制备
十二烷基硫酸钠（SDS）生工生物A500228-0001SDS-PAGE 凝胶/缓冲液制备
Tris 碱Sigma-aldrichT1503-10KG蛋白纯化缓冲液制备
超滤离心管MilliporeUFC901096/801096蛋白浓缩
设备
分析天平DENVERAPX-60果蝇头部称重
适用于 15 mL 和 50 mL 锥形离心管的台式高速冷冻离心机Eppendorf5810R蛋白浓缩
适用于 1.5 mL 离心管的台式高速冷冻离心机Eppendorf5417R匀浆后果蝇头部裂解液离心
空重力流层析柱（内径=1.0 cm）Bio-Rad738-0015TRP 蛋白纯化
空重力流层析柱（内径=2.5 cm）Bio-Rad738-0017从大肠杆菌中纯化诱饵蛋白和竞争蛋白
凝胶成像系统Bio-RadUniversal Hood II Gel Doc XR 系统SDS-PAGE 成像
高速冷冻离心机Beckman coulterAvanti J-26 XP大肠杆菌细胞/细胞裂解液离心
高压均质机UNION-BIOTECHUH-05大肠杆菌细胞匀浆
液氮罐Taylor-WhartonCX-100果蝇头部制备
蛋白纯化系统CytivaAKTA purifier蛋白纯化
冰箱（-80°C）Thermo900GP果蝇头部制备
分光光度计MAPADAUV-1200大肠杆菌细胞 OD600 测定
分光光度计Thermo ScientificNanoDrop 2000c蛋白浓度测定
超速离心机Beckman coulterOptima XPN-100 超速离心机超速离心

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TRP INAD

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