方法文章

利用精子细胞对驱动蛋白-7 CENP-E 的功能评估 体内 抑制、免疫荧光与流式细胞术

DOI：

10.3791/63271

⸱

2021年12月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文报道了一种 体内 通过腹腔手术和睾丸注射 CENP-E 抑制剂 GSK923295，建立了一种研究雄性减数分裂的有价值模型。利用免疫荧光、流式细胞术和透射电子显微镜检测，我们发现 CENP-E 抑制会导致小鼠初级精母细胞中染色体排列紊乱和基因组不稳定。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在真核生物中，减数分裂对有性生殖过程中的基因组稳定性和遗传多样性至关重要。对睾丸中精母细胞的实验分析，是研究雄性减数分裂过程中纺锤体组装和染色体分离的关键。小鼠精母细胞是减数分裂机制研究的理想模型，然而目前仍缺乏高效分析精母细胞的有效方法。本文介绍了一种实用且高效的 体内 报道了小鼠精母细胞中驱动蛋白-7 CENP-E 的抑制作用。本文详细介绍了通过腹腔手术向3周龄小鼠睾丸注射特异性抑制剂GSK923295的操作步骤。此外，还描述了一系列组织取材与固定、苏木精-伊红染色、免疫荧光、流式细胞术和透射电子显微镜检查的实验方案。本文展示了 体内 抑制模型 通过 腹部手术与睾丸注射，这可能是一种研究雄性减数分裂的有力技术。我们还证明，在减数分裂Ⅰ期的初级精母细胞中，CENP-E 抑制会导致染色体排列紊乱和中期停滞。我们的 体内 抑制方法将有助于减数分裂的机制研究，为雄性生殖系的遗传修饰提供一种有效手段，并为未来的临床应用提供启示。

引言

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减数分裂是真核生物中最重要的、高度保守的进化事件之一，对配子发生、有性生殖、基因组完整性以及遗传多样性至关重要1,2,3。在哺乳动物中，生殖细胞在经历一次DNA复制后，连续进行两次细胞分裂，即减数分裂I和减数分裂II。与有丝分裂中的姐妹染色单体不同，同源染色体在减数分裂I中配对并分离到两个子细胞中4,5。在减数分裂II中，姐妹染色单体分离，且不经过DNA复制，最终形成单倍体配子6。减数分裂的任一分裂阶段若出现错误，包括纺锤体组装缺陷或染色体错误分离，均可能导致配子丢失、不育或非整倍体综合征7,8,9。

越来越多的研究表明，驱动蛋白家族马达在有丝分裂和减数分裂细胞中对染色体排列与分离、纺锤体组装、胞质分裂以及细胞周期进程的调控中发挥着关键作用10,

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方案

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所有动物实验均经福建医科大学动物护理与使用委员会审查并批准（协议编号 SYXK 2016-0007）。所有小鼠实验均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的相关规定（NIH 出版物编号 8023，1978 年修订版）。

1. GSK923295介导的CENP-E抑制小鼠模型的构建

  1. 将手术器械在 121 °C 下灭菌 30 分钟。使用紫外线-C（UVC）照射手术用超净工作台 2 小时。称量用于实验的3周龄雄性ICR（Institute of Cancer Research）小鼠，并计算所需麻醉剂剂量。
  2. 通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的组合对小鼠进行麻醉。通过角膜反射、伤害性刺激反射、呼吸频率及肌张力等多项指标综合评估小鼠的麻醉深度。确认小鼠已处于深度麻醉状态。
    注意：手术期间将动物置于加热垫上以提供体温支持 。
  3. 将小鼠四肢固定并绑在蜡盘上。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。使用实验动物专用剃毛器，剃除从小鼠下腹部至阴囊区域的体毛 。用无菌手术巾覆盖并固定手术区域。
  4. 用聚维酮碘溶液擦拭腹部腹侧区域，随后用75%乙醇重复处理三次 。使用无菌手术刀切开腹腔，切口长度小于<5 mm。
  5. 用无菌手术钳夹住....

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结果

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我们已成功构建了一个 体内 通过腹腔手术和睾丸注射GSK923295建立小鼠睾丸中CENP-E抑制模型19该方法的关键技术步骤如图所示 图1。在睾丸注射 GSK923295 持续 4 天后，取睾丸组织进行进一步分析。在对照组中，生精小管内的生精波规律且有序（图2A）。然而，在GSK923295组中，生精小管内的生精波发生改变，且在抑制CENP-E后，停滞于中期的初级精母细胞显著增加（图 2B-D）。重要的是，在抑制 CENP-E 后，若干同源染色体未能在赤道板上排列对齐图2B-D）。此外，CENP-E 抑制还导致生精小管中第一次减数分裂中期的精母细胞增加（图2E.......

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讨论

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本研究通过腹腔手术和显微注射 GSK923295，建立了小鼠睾丸中 CENP-E 抑制的体内模型。本研究所采用的腹腔手术与睾丸注射方法具有以下优势：第一，不受小鼠年龄限制，实验人员可在早期阶段（例如3周龄或更小）进行睾丸注射；第二，GSK923295 对 CENP-E 具有特异且优异的抑制效果；第三，该方法操作简便，重复性高；此外，睾丸组织的完整性得以保持，适用于在器官背景下对完整组织进行研究。

本方案中有多个关键步骤。例如，在腹部手术过程中维持无菌环境对于预防术后感染至关重要31。此外，对于不同年龄的小鼠或不同的实验动物，应根据睾丸大小及药物有效性适当调整注射剂量19,32。同时，在流式细胞术中，需掌握适当的消化时间并进行显微镜观察，以确定单细胞状态及后续的细胞群体检测。然而，本方案也存在一些局限性。当小鼠年龄小于2周时，难以通过腹部手术建立小鼠模型，主要原因在于小鼠年龄过小、术后饮食困难且存活率较.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢福建医科大学细胞骨架实验室所有成员的有益讨论。感谢福建医科大学公共技术服务中⼼流式细胞术平台林俊进的技术支持。感谢福建医科大学公共技术服务中⼼电子显微镜实验室吴明霞和周林英在电子显微镜技术方面的协助。感谢福建医科大学基础医学实验教学中心郑思怡、林颖、柯琪和宋俊的技术支持。本研究得到以下基金资助：国家自然科学基金（项目编号 82001608）、福建省自然科学基金（项目编号 2019J05071）、福建省卫生科技项目（项目编号 2018-1-69）、福建医科大学科研启动基金（项目编号 2017XQ1001）、福建医科大学高层次人才科研启动资助项目（项目编号 XRCZX2017025）以及中医研究生在线教育教学研究项目（项目编号 B-YXC20200202-06）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056
1 ml 注射器多个商业品牌可选无菌。
1.5 mL 离心管AxygenMCT-150-C
50 mL 离心管Corning430828
6 cm 培养皿Corning430166
95% 乙醇国药集团化学试剂有限公司10009164
微管蛋白兔多克隆抗体BeyotimeAF0001用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。
兔抗组蛋白 H3（磷酸化 S10）单克隆抗体Abcamab267372用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。
兔抗 TUBA4A 多克隆抗体生工生物D110022用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。
抗 SYCP3 兔单克隆抗体Abcamab175191用于免疫荧光检测。使用稀释比例为 1:100。
粘附性显微镜载玻片CITOTEST188105
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔抗体BeyotimeA0423二抗。使用稀释比例为 1:500。
硫酸铝钾国药集团化学试剂有限公司10001060
无水乙醇国药集团化学试剂有限公司100092690
抗荧光淬灭封片剂BeyotimeP0131防止荧光信号光漂白。
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
牛血清白蛋白国药集团化学试剂有限公司69003435
离心机Eppendorf5424BK745380
水合氯醛国药集团化学试剂有限公司80037516
柠檬酸上海试剂有限公司122670
胶原酶生工生物A004194-0100
盖玻片CITOTEST10212020C20 × 20 mm。厚度 0.13–0.16 mm。
DAPIBeyotimeC1006
染色缸多个商业品牌可选91347802
伊红 Y，醇溶性国药集团化学试剂有限公司71014460
乙醚国药集团化学试剂有限公司10009318
甲醛水溶液国药集团化学试剂有限公司10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
苏木精，无水国药集团化学试剂有限公司71020784
ICR 小鼠上海斯莱克实验动物有限公司
Image J 软件美国国立卫生研究院https://imagej.nih.gov/ij/荧光图像分析。
Leica 超薄切片机Leica
Leica EM UC-7 超薄切片机LeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software House用于流式细胞术结果分析。
指甲油多个商业品牌可选
中性树胶国药集团化学试剂有限公司10004160
Nikon Ti-S2 显微镜NikonTi-S2
苦味酸国药集团化学试剂有限公司J60807
Rheodyne生工生物F519160-000110 μl Rheodyne
切片石蜡国药集团化学试剂有限公司69019461
碘酸钠国药集团化学试剂有限公司80117214
手术器械多个商业品牌可选用于腹部手术。在 121 °C 下灭菌 20 分钟。
透射电子显微镜FEITecnai G2
二水合柠檬酸三钠上海试剂有限公司173970
Triton X-100国药集团化学试剂有限公司30188928用无菌 PBS 稀释，配制成 0.25% 工作液。
Tween 20国药集团化学试剂有限公司30189328用无菌 PBS 稀释，配制成 0.1% 工作液。
多聚甲醛国药集团化学试剂有限公司80096618
二甲苯国药集团化学试剂有限公司10023418

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M.

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重印与许可

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CENP E

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