小鼠后肢坏疽模型中足垫血管系统的高分辨率三维成像

摘要

本方案描述了一种独特且具有临床相关性的外周动脉疾病模型，该模型通过结合股动脉和股静脉电凝以及给予一氧化氮合酶抑制剂，在FVB小鼠中诱导后肢坏疽。随后采用心脏内灌注DiI的方法，对足垫血管系统进行高分辨率的三维成像。

摘要

外周动脉疾病（PAD）是由于长期暴露于动脉粥样硬化危险因素而导致的重要致病原因。患有其最严重形式——慢性肢体威胁性缺血（CLTI）的患者，日常生活能力受到显著影响，包括慢性疼痛、无痛行走距离受限以及难以愈合的伤口。目前已在多种动物中建立了用于研究PAD的临床前模型，但小鼠后肢缺血模型仍是应用最广泛的。这些模型对缺血性损伤的反应可能存在显著差异，具体取决于小鼠品系、动脉阻断部位、数量及方法。本方案描述了一种独特的方法，通过结合股动脉和股静脉电凝术与一氧化氮合酶（NOS）抑制剂给药，可在Friend病毒B（FVB）小鼠中稳定诱导足垫坏疽，其组织缺失情况与CLTI相似。尽管仍推荐使用激光多普勒灌注成像（LDPI）等传统方法评估再灌注情况，但本方法采用经心内灌注脂溶性染料1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）标记血管系统。随后通过整体组织共聚焦激光扫描显微镜成像，可实现足垫血管网络的高分辨率三维（3D）重建，从而补充传统后肢缺血模型中再灌注评估手段。

引言

外周动脉疾病（PAD）是由动脉粥样硬化导致四肢血流减少的一种疾病，在美国影响约650万人，在全球影响约2亿人¹。PAD患者会出现肢体功能下降和生活质量降低，而患有CLTI（PAD最严重形式）的患者截肢和死亡风险显著增加，5年死亡率接近50%²。在临床实践中，踝肱指数（ABI）<0.9的患者被认为患有PAD，而ABI <0.4且伴有静息痛或组织缺损的患者则被诊断为CLTI³。症状表现因人而异，即使ABI相似，症状也可能受到日常活动水平、肌肉对缺血的耐受性、解剖结构差异以及侧支循环发育程度不同的影响⁴。指端和肢体坏疽是所有导致CLTI的血管闭塞性疾病中最严重的表现形式，属于干性坏死，可使软组织呈木乃伊样改变。除动脉粥样硬化性PAD外，该情况也可出现在糖尿病患者、患有血栓闭塞性脉管炎（Buerger病）或雷诺现象（Raynaud现象）等血管炎性疾病患者，以及终末期肾病背景下发生钙化防御（calciphylaxis）的患者中^5,6。

已开发出多种临床前模型用于研究外周动脉疾病/慢性肢体威胁性缺血（PAD/CLTI）的发病机制，并评估潜在治疗方法的有效性，其中最常用....

方案

本方案中描述的所有动物实验均经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。研究使用了8至12周龄的FVB小鼠，包括雄性和雌性。

1. L-NAME 溶液的配制

1. 在超净工作台的无菌条件下，将 1 g L-NAME 粉末（见材料表）溶于 20 mL 无菌水中，配制 L-NAME 储存液，终浓度为 50 mg/mL。将储存液分装为 300–500 µL 每份，于 -20 °C 保存，最长可保存 3 个月。
2. 配制 L-NAME 工作液时，在无菌条件下将一份 L-NAME 储存液解冻，并用 PBS 按 1:4 比例稀释，得到终浓度为 10 mg/mL 的工作液。
3. 配制 PBS（pH 7.4）：将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.23 g NaH₂PO₄ 溶于 800 mL 蒸馏水中，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1,000 mL，经 0.22 µm 瓶顶滤器过滤。
   ​注意：每克体重腹腔注射 4 µL L-NAME 工作液 相当于给予 40 mg/kg 的 L-NAME 剂量。使用过程中 L-NAME 工作液应置于冰上，且每日需使用新解冻的储存液分装物配制新鲜稀释液....

结果

本方案详细描述了一种在易感FVB小鼠足垫中通过股动脉和股静脉凝固联合给予一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，诱导缺血和组织丢失的可靠方法。图1展示了小鼠后肢血管系统的解剖结构，并标出了股动脉和股静脉凝固的位置（黄色X），即位于股外侧旋动脉（LCFA）近端以及隐腘交界处近端。手术中需明确识别股外侧旋动脉，并以该结构为参照，确保所有手术操作中凝固位置的一致性。如文中所述，在手术前2小时以及术后第1至第3天，小鼠还需腹腔注射40 mg/kg的L-NAME，以维持组织内高水平的氧化应激。图2显示了术后一周该模型可能出现的组织丢失程度差异，每张图像右下角记录了Faber评分⁹。

在股动脉和静脉凝固诱导缺血后5天和20天，对FVB小鼠进行DiI灌注，以评估后肢再灌注情况。 图3A 展示小鼠解剖后暴露胸腔的解剖结构。将蝴蝶针插入左心室以开始心脏灌注。注意左心室颜色较右心室略显.......

讨论

尽管小鼠后肢缺血是研究外周动脉疾病（PAD）和慢性肢体威胁性缺血（CLTI）中新血管生成最常用的临床前模型，但缺血的严重程度和恢复情况在不同小鼠品系之间存在显著差异，且受动脉阻断的具体部位、数量及方法的影响。股动脉结扎联合腹腔注射L-NAME可稳定地在FVB小鼠中诱导后肢坏疽¹¹。相同处理在C57BL/6小鼠中仅导致后肢缺血而无组织丢失，而在BALB/c小鼠中，仅通过股动脉结扎即可诱导足部或腿部的自截。因此，在对缺血损伤反应介于中间水平的FVB小鼠中，采用上述股动脉凝固联合术后给予L-NAME的技术，提供了一种独特且可重复的足垫坏疽模型，类似于导致CLTI最严重表现的疾病所呈现的病理状态。该模型所观察到的组织丢失程度可从少数缺血性趾甲至多个坏疽性足趾不等，但极少进展至足部或腿部的自截，从而允许对肢体再灌注和功能进行纵向评估。与BALB/c小鼠中坏疽迅速发生、肢体自截通常在一周内完成不同，该FVB小鼠坏疽模型的组织丢失发生较迟。股动脉凝固可急性限制后肢血流，而术后第0至3天给予L-NAME所导致的氧化应激累积则较为缓慢，萎缩性改变的峰值出现在术后7至14天之间。因此，该模型提供了更优的治疗时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小型长尾夹	办公用品商店
布托啡诺（缓释型）
蝶形针（25 G，带鲁尔锁）	VWR	10148-584
共聚焦激光扫描显微镜	Leica	TCS SP5
DiI（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）	Invitrogen	D282
电灼设备	Gemini Cautery System	5917
乙醇（100%）	VWR	89370-084
Fiji（ImageJ）软件	NIH		使用版本 2.1.0。可免费下载，无需许可证。
泡沫活检垫	Fisher Scientific	22-038-221
福尔马林（中性缓冲，10%）	VWR	89370-094
FVB 小鼠	Jackson Laboratory	001800
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528
HCl（1 M）	Sigma-Aldrich	13-1700
Imaris 软件	Oxford Instruments		使用版本 9.6.0。
异氟烷	Pivetal	NDC 46066-755-04
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
氯胺酮
L-NAME（Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐）	Sigma-Aldrich	N5751
激光多普勒血流成像仪	MoorLDI	moorLDI2-HIR	使用 moorLDI V5 软件。
显微镜载玻片（25 × 75 × 1 mm）	VWR	48311-703
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaOH	Sigma-Aldrich	S8263
针头（27 G）	BD	305109
聚维酮碘棉签（10%）	Medline	MDS093901ZZ
外科手术器械	Roboz Surgical		推荐使用精细镊子、持针器、弹簧剪和止血钳。
缝线（5-0 可吸收）	DemeTECH	G275017B0P
注射器（10 mL）	BD	305482
三通阀	Cole-Parmer	19406-49
血管分析插件			可免费下载，无需许可证。参见参考文献：Elfarnawany（2015）。
赛拉嗪