猪外周血血液生长内皮细胞（BOEC）的表征

Abstract

内皮是一种动态的综合结构，在血管生成、止血、炎症和体内平衡等许多生理功能中起重要作用。内皮在动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等病理生理学中也起着重要作用。内皮细胞形成血液和淋巴管的内层，在结构和功能上表现出异质性。各种小组已经评估了来源于人外周血的内皮细胞的功能，重点是来源于造血干细胞或成熟血液生长内皮细胞（或内皮集落形成细胞）的内皮祖细胞。这些细胞为治疗和疾病建模提供了自体资源。异种细胞可以提供另一种治疗来源，因为它们的可用性和同质性通过使用在类似条件下饲养的遗传相似的动物来实现。因此，已经提出了一种从猪外周血中分离和扩增高度增殖的血液生长内皮细胞的稳健方案。这些细胞可用于多种应用，如心血管组织工程、细胞治疗、疾病建模、药物筛选、研究内皮细胞生物学以及 体外 共培养，以研究异种移植中的炎症和凝血反应。

Introduction

内皮是一种高度复杂的动态结构，是血管壁的重要组成部分。它排列在血管的内表面，在循环血液和周围组织之间提供物理界面。已知这种异质结构执行各种功能，例如血管生成，炎症，血管调节和止血¹，²，^3，4。人脐静脉内皮细胞是一种被广泛研究的细胞类型，用于评估内皮细胞的功能。然而，患者特异性批次变异性、表型不一致和最小分裂效率表明需要确定可以改善所有这些特征的细胞来源⁵。

获得原代内皮细胞的均质群体在技术上可能具有挑战性，并且原代内皮细胞不具有高增^殖能力6。因此，为了研究血管再生和评估病理生理过程，各个小组试图获得和评估来自外周血的不同类型的内皮细胞，例如内皮祖细胞（EPC）或血液生长内皮细胞（BOEC）⁶，⁷，^8，9.纺锤形的早期EPC起源于造血干细胞（HSC），具有有限的生长效力和有限的血管生成能力，无法产生成熟的内皮细胞。此外，它们与炎性单核细胞非常相似。此外，它们进一步分化成功能性、增殖、成熟的内皮细胞的能力^{仍有争议6}，⁷，^9，10。外周血单核细胞 （PBMC） 的连续培养可产生称为晚期生长 EPC、BOEC 或内皮集落形成细胞 （ECFC^{） 的}二次细胞群6，⁷，^9，10。Medina等人在2018年承认EPC的局限性，其命名的模糊性，以及与EPC¹¹下连续分组的许多不同细胞类型普遍缺乏一致性。相比之下，BOEC因其在血管修复，健康和疾病以及细胞治疗中的作用而得到认可。这些细胞的进一步研究和治疗使用将依赖于方案，以一致地从循环祖细胞中获取这些细胞类型。

BOEC等原代细胞可用作替代细胞，以获得高度增殖的成熟内皮细胞⁶。BOEC在表型上与早期EPC不同，并表现出典型的内皮特征，例如鹅卵石形态以及粘附连接和洞穴的表达¹²。Hebbel等人的基因分析¹³，^14，15发现BOEC或ECFC是真正的内皮细胞，因为它们促进微血管和大血管的形成。因此，BOEC可以用作评估病理生理过程和遗传变异的工具¹⁶。它们也被认为是血管再生细胞疗法的极好细胞来源¹⁷。因此，一个标准化的方案来持续获得这些高度增殖的细胞是必不可少的。

虽然BOEC为研究人类病理生理和遗传变异提供了强大的工具，但更同质的BOEC来源可能会提供更强大和可靠的实验和治疗结果。通过使用来自在相似条件下饲养的遗传相似动物的异种细胞源，可以实现卓越的同质性¹⁸。虽然异种细胞来源容易引发宿主免疫反应，但正在开发免疫调节策略，目的是产生免疫相容的动物和动物产品，包括细胞。特别是猪，是外周血的丰富来源，由于与人类的解剖和生理相似性，通常用于研究医疗设备和其他疗法。因此，本研究完善了从猪外周血中分离和扩增高度增殖的BOEC的方案。下面详述的方案是一种从相对少量的血液中获取大量 BOEC 的简单可靠的方法。培养物可以通过多次传代扩增，以从单个血液样本中产生数百万个细胞。

Protocol

所有动物研究均由威斯康星医学院和妙佑医疗国际各自的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。

注意:在这项研究中，使用了约克郡/兰德雷斯/杜洛克杂交家猪（Sus homeus），雄性和雌性，40-80公斤，3-6个月大。

1.猪外周血采集

1. 准备材料。
   1. 在无菌盐水中将肝素溶液稀释至100U / mL。
   2. 向两个 50 mL 锥形管和两个 60 mL 注射器中各加入 3-4 mL 肝素溶液。
   3. 将未稀释的肝素溶液 （1，000 U/mL） 吸入延长管中。
   4. 将 19 G 针头连接到充满肝素的延长管的一端，将含肝素的 60 mL 注射器连接到另一端。
2. 根据机构政策麻醉猪
   1. 肌内注射阿托品（0.05 mg/kg）、替他明/唑拉西泮（2-5 mg/kg）和甲苯噻嗪（2 mg/kg）以诱导麻醉。
      注意:一旦动物失去知觉并且下颌肌肉不僵硬，就可以实现充分的麻醉。
   2. 将动物仰卧，并在两侧放置卷起的毛巾以提供稳定性。
   3. 在眼睛上涂抹眼药膏以防止麻醉时干燥。
   4. 麻醉期间提供热支持，包括毯子、加热垫和/或加热手术台。
3. 用甜菜碱磨砂液清洁股骨腹股沟区域。
4. 用 19 G 针刺穿股静脉或动脉，缓慢 （~1-2 mL/s） 将 50 mL 血液吸入注射器。
   注意:绘制太快会损坏单元格。
5. 将针头留在原位，立即扭结延长管并断开 60 mL 注射器
6. 将血液缓慢转移到含肝素的 50 mL 锥形管中。
7. 盖紧 50 mL 锥形管，轻轻倒置几次以混合，然后放在冰上。
8. 将剩余的含肝素的 60 mL 注射器连接到延长管，解开延长管，然后慢慢将另外 50 mL 的血液吸入注射器。
9. 立即从动脉或静脉中取出针头，并将延长管中的剩余血液缓慢抽入注射器。
10. 断开 60 mL 注射器与延长管的连接，然后将血液缓慢转移到剩余的含肝素的 50 mL 锥形管中。
11. 盖紧 50 mL 锥形管，轻轻倒置几次以混合，然后放在冰上。
12. 对猪的股骨腹股沟区域施加压力止血。
13. 根据机构政策回收猪。持续监测动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位并返回常规的住房/狗窝区域。

2. 单核细胞的分离

1. 在四个 50 mL 锥形管中用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以 1:1 的比例稀释血液。
   注意:这项工作需要使用无菌技术在细胞培养罩中进行，以避免污染细胞培养物。
2. 将 25 mL 室温即用型密度梯度溶液加入 8 个 50 mL 锥形管中。
3. 通过保持管与移液器尖端的锐角，沿着含有 50 mL 锥形管的每个密度梯度溶液的内部非常缓慢地移取 25 mL 血液/盐水溶液。
   注意:血液溶液应轻轻地分层在密度梯度溶液的顶部，并保持明确的界面。
4. 在560× g 和室温（RT）下离心管30分钟。
   注意:为获得最佳效果，请尽可能禁用离心机制动器。
5. 使用细移液管小心地从每个试管中收集血沉棕黄层（密度梯度溶液上方和透明血浆下方的单核细胞浑浊层），并均匀分布到两个新的 50 mL 锥形管中。丢弃含有管的密度梯度溶液。
   注意:收集尽可能多的血沉棕黄层，同时尽可能少地收集密度梯度溶液和等离子体。

3. 细胞的洗涤和电镀

1. 用纤连蛋白涂覆 6 孔板。
   1. 通过在无菌水中将其稀释至1mg / mL来制备人血浆纤连蛋白的储备溶液。将等分试样储存在-20°C。
   2. 通过将 600 μL 纤连蛋白储备溶液稀释在 3 mL PBS 中，制备 3.6 mL 纤连蛋白工作溶液。
   3. 将 600 μL 纤连蛋白工作溶液转移到 6 孔板的每个孔中，轻轻摇动直至均匀涂覆。
   4. 等待30分钟，让纤连蛋白涂覆孔，然后轻轻地从每个孔中吸出溶液。
2. 在等待纤连蛋白包被的同时，清洗单核细胞
   1. 在试管中加入多达 45 mL 的 PBS
   2. 在560× g 和4°C下用低制动器离心5分钟。从两个管中吸出上清液。
   3. 将每个细胞沉淀重悬于 25 mL PBS 中。
   4. 重复第二次洗涤。
3. 将每个细胞沉淀重悬于 5 mL PBS 中，并向每个试管中加入 15 mL 0.8% 氯化铵溶液。
   注意:此步骤是裂解剩余的红细胞。
4. 在冰上孵育10分钟。
5. 像以前一样用PBS加满试管并在560× g 和4°C下用低制动器离心5分钟。从两个管中吸出上清液。
6. 将每个细胞沉淀重悬于25 mL PBS中，并重复洗涤第二次。
7. 将每个细胞沉淀重悬于 6 mL EGM-2 培养基中，该培养基补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1x 抗生素/抗真菌溶液，其中含有 10，000 U/mL 青霉素、10 mg/mL 链霉素和 25 μg/mL 两性霉素。
   注意:EGM-2培养基由补充有200μL氢化可的松的EBM-2培养基，2mL人成纤维细胞生长因子（hFGF-B），500μL血管内皮生长因子（VEGF），500μL胰岛素样生长因子重组类似物（R₃ IGF-1），500μL抗坏血酸，500μL人表皮生长因子（hEGF）， 每 500 mL 500 μL 庆大霉素/两性霉素和 500 μL 肝素。
8. 轻轻地将 2 mL 的细胞悬液转移到纤连蛋白包被的 6 孔板的每个孔中，轻轻摇动直至均匀包被。
   注意:目标是接种尽可能多的细胞，以最大限度地增加将形成的内皮集落的数量。

4. 细胞培养

1. 将细胞在37°C，5%CO₂和100%湿度下孵育。
2. 第二天，向每个孔中轻轻加入 1 mL 新鲜培养基。
   注意:重要的是要温和，不要干扰松散粘附在纤连蛋白涂层上的细胞。
3. 第二天，通过从每个孔中轻轻吸出 1.5 mL 培养基并用 1.5 mL 新鲜培养基替换来进行半培养基更换。
4. 在接下来的5天中的每一天，轻轻地对每个孔进行完整的培养基更换（每孔2 mL新鲜培养基）。
5. 之后，每周轻轻更换培养基三次。
6. 在低功率（4倍物镜）光学显微镜下定期观察细胞培养物。
   注意:贴壁血液生长内皮细胞（BOEC）集落将在接种后7-10天开始出现在孔中。非贴壁细胞类型将随着培养基的变化而被丢弃，其他贴壁细胞类型将随着BOEC菌落的生长而逐渐消散。
7. 当~70%-80%汇合时，将BOEC传入纤连蛋白包被的T-75烧瓶中，并继续每周更换培养基三次。
   注意:接种密度可以通过将菌落传代到T25烧瓶中来控制。后续传代不需要纤连蛋白包衣，培养基更换次数可减少到每周两次。
8. 来自传代1-3的细胞可用于实验或转移到冷冻培养基中并储存在液氮中以备将来使用。

Results

从培养开始到观察到BOEC菌落，观察培养细胞的形态（图1）。较小的贴壁细胞群开始附着在培养皿上并生长，而非贴壁细胞随着培养基的变化而被移除（图1B）。菌落在第6天首次出现，作为从中心点向外放射状增殖的内皮样细胞的集合（图1D）。随着培养的进行，细胞集落变得更加致密，并显示出类似于成熟内皮细胞的鹅卵石形态（图1F）。典型的内皮鹅卵石形态学提供了使用光学显微镜轻松初步鉴定BOEC的方法。

内皮细胞集落通常在培养 10-14 天时准备好传代。此时，6孔板通常会产生~100万个细胞，活力百分比为93%-98%。在第一次传代期间，内皮细胞将扩增以在T75烧瓶中产生~6-10百万个细胞。

为了评估BOEC的形态发生，将基底膜基质（例如基质胶）以10μL /孔的速度接种在15孔血管生成板上，并在37°C下...

Discussion

BOEC是一种强大的工具，可用于各种科学和治疗方法⁷，^8，16。BOEC已被用于分析EC基因表达，以阐明导致血管疾病和癌症发展的关键因素⁵，¹⁹，^20，21。BOEC还被用于治疗应用，如血管再生和基因传递²²，^23，24。转基因BOEC以其抗血管生成肿瘤的治疗能力而闻名^25，26。此外，BOEC的血...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G 针	Covidien	1188818112
50 mL 锥形管	康宁	352098
6 孔板	BD Falcon	353046
60 mL 注射器	Covidien	8881560125
氯化铵溶液 （0.8%）	Stemcell Technologies	07850
抗生素/抗真菌溶液 （100x）	Gibco	15240-062
离心	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 培养基	Lonza Walkersville	CC-3162
延长管	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
胎牛血清 （FBS）	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	密度梯度溶液
素钠注射液（1,000 单位/mL）	辉瑞	00069-0058-01
人血浆纤连蛋白	Gibco	33016-015
冰	N/A	N/A
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco	10010-023
移液器套件	Eppendorf	2231300004
无菌水	Gibco	15230-162
薄型移液器	Celltreat Scientific	229280