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方法文章

猪外周血来源的血液出芽内皮细胞（BOEC）的表征

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DOI：

10.3791/63285

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2022年1月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Medical College of Wisconsin & Marquette University, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 4Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic

本文内容

摘要

内皮是一类动态的整合性结构，在血管生成、止血、炎症反应和稳态等多种生理功能中发挥重要作用。内皮还在动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等病理生理过程中起关键作用。内皮细胞构成血液和淋巴管的内层衬里，并在结构和功能上表现出异质性。多个研究团队已评估了来源于人外周血的内皮细胞功能，重点关注由造血干细胞衍生的内皮祖细胞或成熟血液来源的内皮细胞（即内皮集落形成细胞）。这些细胞可作为自体治疗和疾病建模的资源。异种细胞由于来源丰富且可通过在相似条件下饲养遗传背景相近的动物获得较高同质性，可能成为治疗用细胞的替代来源。因此，本文提出了一种从猪外周血中有效分离和扩增高增殖性血液来源内皮细胞的稳健方案。这些细胞可用于多种应用，包括心血管组织工程、细胞治疗、疾病建模、药物筛选、内皮细胞生物学研究，以及用于研究异种移植中炎症和凝血反应的体外共培养体系。

引言

内皮是一类高度复杂且动态的结构，是血管壁的重要组成部分。它衬在血管内表面，为循环血液与周围组织之间提供一个物理界面。这种异质性结构具有多种功能，包括血管生成、炎症反应、血管调节以及止血功能1,2,3,4。人脐静脉内皮细胞是研究内皮细胞功能的常用细胞类型。然而，由于存在患者特异性的批次差异、表型不一致以及较低的传代效率，提示有必要寻找一种能够改善上述所有特性的细胞来源5。

获得均一的原代内皮细胞群体在技术上具有挑战性，且原代内皮细胞的增殖能力较低6。 因此，为了研究血管再生并评估病理生理过程，多个研究团队已尝试获取和评估来源于外周血的不同类型内皮细胞，例如内皮祖细胞（EPCs）或血液来源的内皮细胞（BOECs）6,7,8,9。纺锤形的早期EPCs来源于造血干细胞（HSCs），其生长潜能有限，生成成熟内皮细胞的血管生成能力也有限。此外，它们在表型上与炎症性单核细胞非常相似。同时，它们进一步分化为功能性、可增殖的成熟内皮细胞的能力仍存在争议6,7,9,10。 对外周血单个核细胞（PBMCs）进行持续培养，可产生一类继发性细胞群体，称为晚期迁出EPCs、BOECs或内皮集落形成细胞（ECFCs）6,7,9,10。Medina等人于2018年指出，EPCs存在诸多局限性，其命名尚不明确，且目前被统称为EPCs的多种不同细胞类型之间缺乏一致性11。相比之下，BOECs因其在血管修复、健康与疾病以及细胞治疗中的作用而逐渐被认可。对这些细胞的进一步研究和治疗应用，将依赖于能够稳定地从循环祖细胞中分离出此类细胞的标准化实验方案。

内皮祖细胞（BOECs）等原代细胞可作为替代来源，用于获取高增殖能力的成熟内皮细胞6。BOECs在表型上不同于早期内皮祖细胞（EPCs），具有典型的内皮细胞特征，如铺路石样形态以及黏附连接和小凹的表达12。Hebbel 等人13,14,15通过基因表达谱分析发现，BOECs或内皮集落形成细胞（ECFCs）才是真正意义上的内皮细胞，因其能够促进微血管和大血管的形成。因此，BOECs可作为研究病理生理过程和遗传变异的工具16。它们也被认为是血管再生细胞治疗的理想细胞来源17。因此，建立一种标准化的方案以稳定地分离这些高增殖性细胞至关重要。

尽管BOECs为研究人类病理生理学和遗传变异提供了有力工具，但使用更均一的BOEC来源可能获得更稳健且可靠的实验与治疗结果。通过使用来自遗传背景相似、饲养条件一致的动物的异种细胞来源，可实现更高的均一性18。尽管异种细胞来源容易引发宿主免疫反应，但目前已有免疫调节策略正在开发中，旨在生成免疫兼容的动物及其产物，包括细胞。特别是猪，其外周血来源丰富，且由于在解剖结构和生理特征上与人类具有相似性，常被用于研究医疗器械及其他疗法。因此，本研究优化了从猪外周血中分离和扩增高增殖性BOECs的实验方案。下述方案是一种简单且可靠的方法，可从相对少量的血液中获得大量BOECs。这些细胞培养物可通过多次传代扩增，由单份血样生成数百万个细胞。

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方案

所有动物实验均获得威斯康星医学院和梅奥诊所各自的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

注意：本研究使用约克夏/长白/杜洛克杂交家猪（Sus domesticus），雌雄均有，体重40-80 kg，年龄3-6个月。

1. 收集猪外周血

  1. 准备材料。
    1. 将肝素溶液用无菌生理盐水稀释至 100 U/mL。
    2. 向两个 50 mL 锥形管和两个 60 mL 注射器中各加入 3–4 mL 肝素溶液。
    3. 将未稀释的肝素溶液（1,000 U/mL）抽入一段延长管中。
    4. 将 19 G 针头连接至装有肝素的延长管一端，另一端连接含肝素的 60 mL 注射器。
  2. 根据机构规定对猪进行麻醉。
    1. 通过肌内注射给予阿托品（0.05 mg/kg）、替来他明/唑拉西泮（2–5 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）以诱导麻醉。
      注意：当动物失去意识且下颌肌肉松弛时，表明已达到充分麻醉状态。
    2. 将动物仰卧位放置，并在两侧放置卷起的毛巾以提供稳定性。
    3. 在眼睛上涂抹眼用软膏，防止麻醉期间角膜干燥。
    4. 在麻醉期间提供保温支持，包括毛毯、加热垫和/或加热手术台。
  3. 使用聚维酮碘擦洗液清洁股部腹股沟区域。
  4. 用 19 G 针头穿刺股静脉或股动脉，缓慢（约 1–2 mL/s）将 50 mL 血液抽入注射器中。
    注意：抽吸过快可能损伤细胞。
  5. 保持针头位置不变，立即夹闭延长管并断开 60 mL 注射器。
  6. 缓慢将血液转移至含肝素的 50 mL 锥形管中。
  7. tightly 盖紧 50 mL 锥形管盖子，轻轻倒置数次以混匀，并置于冰上。
  8. 将另一个含肝素的 60 mL 注射器连接至延长管，松开夹闭的延长管，缓慢再抽取 50 mL 血液至注射器中。
  9. 立即从动脉或静脉中拔出针头，并缓慢将延长管中剩余的血液抽入注射器。
  10. 断开 60 mL 注射器与延长管的连接，缓慢将血液转移至另一个含肝素的 50 mL 锥形管中。
  11. tightly 盖紧 50 mL 锥形管盖子，轻轻倒置数次以混匀，并置于冰上。
  12. 对猪的股部腹股沟区域施加压迫止血。
  13. 根据机构规定使猪恢复。持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位，并能返回常规饲养/犬舍区域。

2. 单个核细胞的分离

  1. 在四个50 mL离心管中，将血液与磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释。
    注意：该操作需在细胞培养罩内使用无菌技术进行，以避免细胞培养物受到污染。
  2. 向八个50 mL离心管中各加入25 mL室温即用型密度梯度溶液。
  3. 将含有密度梯度溶液的50 mL离心管倾斜成锐角，用移液器沿管壁极缓慢地加入25 mL血液/盐水混合液。
    注意：血液溶液应轻柔地叠加在密度梯度溶液上方，并保持清晰的界面。
  4. 将离心管在560 × g 条件下室温（RT）离心30分钟。
    注意：为获得最佳分离效果，如有可能，请关闭离心机刹车功能。
  5. 使用细口移液器小心收集每根离心管中的白膜层（位于密度梯度溶液上方、透明血浆层下方的浑浊单个核细胞层），并均匀转移至两个新的50 mL离心管中。弃去含有密度梯度溶液的离心管。
    ​注意：应尽可能多地收集白膜层，同时尽量减少密度梯度溶液和血浆的混入。

3. 细胞的洗涤与铺板

  1. 用纤连蛋白包被6孔板。
    1. 将人血浆纤连蛋白用无菌水稀释至1 mg/mL，配制储备液。将分装的储备液储存于-20 °C。
    2. 取600 µL纤连蛋白储备液加入3 mL PBS中，配制3.6 mL工作液。
    3. 将600 µL纤连蛋白工作液加入6孔板的每个孔中，轻轻摇动，直至均匀包被。
    4. 静置30分钟，使纤连蛋白充分包被孔壁，然后轻轻吸去每孔中的溶液。
  2. 在等待纤连蛋白包被期间，洗涤单个核细胞
    1. 向各离心管中加入PBS至总体积达45 mL
    2. 在4 °C条件下，以560 x g离心5分钟，刹车设置为低档。吸去两管中的上清液。
    3. 将每管的细胞沉淀用25 mL PBS重悬。
    4. 重复上述步骤，进行第二次洗涤。
  3. 将每管细胞沉淀用5 mL PBS重悬，并向每管中加入15 mL 0.8%氯化铵溶液。
    注：此步骤用于裂解残留的红细胞。
  4. 冰上孵育10分钟。
  5. 同前法洗涤细胞：向各管中补加PBS，然后在4 °C条件下以560 x g离心5分钟，刹车设置为低档。吸去两管中的上清液。
  6. 将每管的细胞沉淀用25 mL PBS重悬，并重复洗涤一次。
  7. 将每管的细胞沉淀用6 mL EGM-2培养基重悬，该培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和1×抗生素/抗真菌溶液（含10,000 U/mL青霉素、10 mg/mL链霉素和25 µg/mL两性霉素B）。
    注：EGM-2培养基由EBM-2基础培养基配制而成，每500 mL中加入200 µL氢化可的松、2 mL人成纤维细胞生长因子（hFGF-B）、500 µL血管内皮生长因子（VEGF）、500 µL胰岛素样生长因子的重组类似物（R3 IGF-1）、500 µL抗坏血酸、500 µL人表皮生长因子（hEGF）、500 µL庆大霉素/两性霉素以及500 µL肝素。
  8. 将2 mL细胞悬液轻柔地加入纤连蛋白包被的6孔板的每个孔中，轻轻摇动，直至均匀铺布。
    ​注：目的是尽可能多地接种细胞，以最大化形成的内皮细胞克隆数量。

4. 细胞培养

  1. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 和 100% 湿度条件下培养。
  2. 次日，向每孔中轻柔加入 1 mL 新鲜培养基。
    注意：操作时应轻柔，避免扰动松散贴附于纤连蛋白包被表面的细胞。
  3. 再过一天，通过轻柔吸出每孔中的 1.5 mL 培养基，并替换为 1.5 mL 新鲜培养基，进行半量换液。
  4. 在接下来的连续 5 天中，每天对每孔进行一次完全换液（每孔加入 2 mL 新鲜培养基）。
  5. 此后，每周进行三次轻柔换液。
  6. 定期在低倍（4×物镜）光学显微镜下观察细胞培养情况。
    注意：贴壁的血液来源内皮祖细胞（BOEC）克隆通常在接种后 7–10 天开始出现在孔中。非贴壁细胞类型会随换液被去除，其他贴壁细胞类型也会随着 BOEC 克隆的生长而逐渐消失。
  7. 当 BOEC 细胞融合度达到约 70%–80% 时，将其传代至经纤连蛋白包被的 T-75 培养瓶中，并继续维持每周换液三次。
    注意：可通过将克隆传代至 T25 培养瓶来控制接种密度。后续传代无需再使用纤连蛋白包被，且培养基更换频率可减少至每周两次。
  8. 第 1 至第 3 代的细胞可用于实验，或转移至冻存液中，保存于液氮中以备将来使用。

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结果

从细胞培养开始直至观察到BOEC集落，持续观察了培养细胞的形态（图1）。一小部分贴壁细胞开始附着于培养皿并生长，而非贴壁细胞则通过更换培养基被去除（图1B）。集落最早在第6天出现，表现为一群类似内皮细胞的细胞从中心点向外呈放射状增殖（图1D）。随着培养的进行，细胞集落逐渐变得更加致密，并呈现出类似于成熟内皮细胞的鹅卵石样形态（图1F）。典型的内皮细胞鹅卵石样形态可通过光学显微镜对BOEC进行简便的初步鉴定。

内皮细胞集落通常在培养10至14天后即可进行传代。此时，6孔板通常可获得约100万个细胞，细胞活力百分比为93%–98%。在首次传代过程中，内皮细胞在T75培养瓶中扩增后可获得约600万至1000万个细胞。

为评估BOECs的形态发生过程，将基底膜基质（例如Matrigel）以每孔10 ...

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讨论

BOECs 是一种强大的工具，可用于多种科学研究和治疗策略7,8,16。BOECs 已被用于分析内皮细胞（EC）基因表达，以阐明导致血管疾病和癌症发生的关键因素5,19,20,21。BOECs 还已被应用于血管再生和基因递送等治疗领域22,23,24。经基因修饰的 BOECs 已被证实具有抗血管生成的肿瘤治疗能力25,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者希望感谢美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）R00 HL129068 项目提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
19 G 针头Covidien1188818112
50 mL 锥形管Corning352098
6 孔板BD Falcon353046
60 mL 注射器Covidien8881560125
氯化铵溶液（0.8%）Stemcell Technologies07850
抗生素/抗真菌素溶液（100 倍浓度）Gibco15240-062
离心机Thermo Scientific75-253-839
EGM-2 培养基Lonza WalkersvilleCC-3162
延长管Hanna Pharmaceutical Supply Co.03382C6227
胎牛血清（FBS）Atlas BiologicalsF-0500-A
Ficoll-Paque 1077Cytiva17144003密度梯度溶液
肝素钠注射液（1,000 单位/mL）Pfizer00069-0058-01
人血浆纤连蛋白Gibco33016-015
冰N/AN/A
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010-023
移液器套装Eppendorf2231300004
无菌水Gibco15230-162
细移液管Celltreat Scientific229280

参考文献

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