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探索巨核细胞生成症的体外和体内方法

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DOI：

10.3791/63286

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2021年11月17日

 ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

本文内容

摘要

文章讨论：

1. Pongerard， A.， Mallo， L.， Gachet， C.， Lanza， F.， Strassel， C. 白细胞耗竭滤器衍生的 CD34 + 细胞作为细胞来源，用于研究巨核细胞分化和血小板形成。可视化实验杂志：JoVE。（171），e62499 （2021）。

2. Kimmerlin， Q.， Tavian， M.， Gachet， C.， Lanza， F.， Brouard， N. 小鼠巨核细胞祖细胞的分离。可视化实验杂志：JoVE。（171），e62498 （2021）。

3. Boscher， J.， Gachet， C.， Lanza， F.， Léon， C. 基于 3D 甲基纤维素的水凝胶中的巨核细胞培养以改善细胞成熟并研究刚度和限制的影响。可视化实验杂志：JoVE。（171），e62511 （2021）。

4. Scandola， C.， Lanza， F.， Gachet， C.， Eckly， A. 使用透射电子显微镜对小鼠巨核细胞生成进行原位探索。可视化实验杂志：JoVE。（171） e62494 （2021 年）。

5. Guinard， I.， Gachet， C.， Lanza， F.， Léon， C.， Eckly， A. 小鼠新鲜骨髓外植体的血小板形成动力学。可视化实验杂志：JoVE。（171），e62501 （2021）。

6. Bornert， A.， Pertuy， F.， Gachet， C.， Lanza， F.， Léon， C. 小鼠颅骨骨髓中巨核细胞和前血小板的体内双光子成像。可视化实验杂志：JoVE。（171），e62515 （2021）

社论

血小板是小的无核血细胞，对止血至关重要，源自骨髓 （BM） 中的巨核细胞 （MK）。在与造血干细胞分化的过程中，MK在复杂的分化和成熟过程中发育成巨细胞，包括多倍体化和细胞质成熟。在发育的最后阶段，当MK与内皮细胞接触时，它们达到成熟阶段，并将长长的细胞质延伸（称为前血小板）延伸到血管中，然后破碎在血液中产生血小板1,2。调节 MK 成熟和跨内皮前血小板形成的机制仍不完全清楚。本系列的目标是汇集互补方法，有助于更好地了解 MK 在体外和体内的生物学。

MKs的体外扩增和分化被广泛用于研究血小板生物发生的机制。在Pongerard等人的方案中，作者描述了一种标准化的培养方案，用于区分MKs与人CD34 +造血祖细胞。他们特别强调，血液中心提供的白细胞过滤器是收集 CD34+ 细胞的特殊来源。他们的文章包含关于如何提取 CD34+ 细胞、如何评估其纯度以及其接种密度重要性的几个基本指南。作者还提出了一种连续五次校准的移液方法，以有效地释放功能性血小板。该方法的有趣应用是可以使用CRISPR-Cas9基因组编辑方法评估药理化合物或对CD34+细胞进行基因作3,4。对于小鼠研究，Kimmerlin等人提出了一种细胞分选策略，以与分子和细胞测定兼容的足够数量纯化MK祖细胞。作者讨论了使用髂嵴作为含有大量造血祖细胞的骨髓来源的优点，以及在细胞分选之前使用细胞表面标记物的组合对不需要的细胞进行两步磁耗尽的优点。这种方法的一个主要优点是减少了获得高度纯化的 MK 祖细胞所需的动物数量，例如，研究造血祖细胞的层次结构及其分化的研究人员可能会对此感兴趣。在这种情况下，Boscher等人描述了一种在由2%甲基纤维素组成的3D培养基中生长祖细胞的方法，以更好地模拟体内环境。事实上，这些作者之前已经证明，与在液体培养基中生长的MK相比，在3D水凝胶中生长的MK具有更高的成熟状态和更强的形成祖细胞的能力5。该协议中强调了关键步骤，例如获得最佳培养基刚度的适当体积的甲基纤维素，在每个实验条件下应等效的细胞数量以及污染风险。为了验证成熟水平的功能，作者解释了如何在培养的第三天将凝胶培养的细胞重悬于液体培养基中，以及如何通过免疫染色、流式细胞术或电子显微镜固定细胞以供将来分析。透射电子显微镜 （TEM） 是提供 MK 高分辨率超微结构的首选成像方法。在这里，Scandola等人分享了一种协议，用于分析MK在其自然BM环境中的超微结构，并量化其细胞密度并对不同的成熟阶段进行评分。作者使用 TEM 分析 MK 与正弦壁相互作用时发生的细胞事件，例如它们穿透内皮细胞6 的短侵入性足体样突起。该方法的一个局限性是，由于这些未成熟细胞缺乏特定的超微结构特征，因此无法分析MK结合的初始阶段。如前所述，这种成像方法的优点是使用小BM样本，允许用一只小鼠进行多项研究。例如，其他骨髓样本可用于Guinard等人在本集合中介绍的骨髓外植体技术，以研究MKs前血小板的动态延伸。该方法的优势在于使用在BM中发育的MK，从而避免了培养物中细胞分化伪影导致的任何潜在误解。事实上，这之前已经在MK限制性MYH9失活的小鼠中被记录过，其中在体外和离体中发现了不同的结果7。作者还强调了这种方法的简单性、可重复性和快速性。他们的协议的一个有趣的注意事项是能够使用配备导航软件的显微镜来促进跟踪/定量延伸前血小板的 MK。外植体模型的一种补充方法是小鼠头骨中MK的双光子成像。该技术的独特之处在于能够在体内研究骨髓中荧光标记的MK的动态行为，并可视化血小板延伸。该方案的优点是微创，手术干预有限，从而避免了据报道会影响血小板形成的炎症反应。正如Bornert等人所指出的，这种方法的一个局限性是由于骨骼的密度而可以成像的深度很窄，这也迫使使用年轻的小鼠。该技术可应用于转基因小鼠，以研究感兴趣基因在体内血小板形成中的作用。例如，作者使用该技术证明微管在体外和体内条件下前血小板伸长中的作用不同8。

异常的 MK 发育和血小板生成可导致血小板减少或血小板增多，分别增加出血或血栓形成的风险。继续努力剖析控制血小板生物发生的分子机制将提高我们开发治疗血小板减少症和血小板增多症的新策略的能力。在输血研究领域，这些努力将为在选定情况下生产培养血小板作为输血替代品奠定基础9。

披露

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了 ARMESA（Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique）、欧盟通过欧洲区域发展基金 （ERDF） 以及授予 ANR-17-CE14-Megaplatprod 给 HDS 和 ANR-18-CE14-PlatForMechanics 的支持给 CL。

参考文献

  1. Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
  2. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  3. Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
  4. Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
  5. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  6. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
  7. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  8. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
  9. Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

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