本方案概述了一种从野外自然基质中高效提取活体线虫的方法。
本文内容
摘要
摘要
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）及其近缘物种不仅是稳健的实验模式生物，也是自然界中真实存在的动物。在自然环境中对野生线虫进行研究，有助于深入理解生物学的诸多方面，包括独特基因组和表型特征进化的选择压力环境、复杂性状变异的遗传基础，以及所有动物种群赖以生存的自然遗传多样性。本文描述了一种从自然基质（包括腐烂的果实、花朵、真菌、落叶和土壤）中提取线虫的简单且高效的方法。贝尔曼漏斗法（Baermann funnel method）是一种经典的线虫学技术，可选择性地将活跃的线虫从其基质中分离出来。由于该方法几乎能够回收样本中全部活跃的个体，因此可以捕获到与数量多且生长快的基因型共存的稀有且生长缓慢的基因型，而这些基因型在需要多代繁殖的提取方法中可能被遗漏。该技术也十分适用于解答宏基因组学、群体遗传学和生态学方面的问题。它能够同时捕获样本中的整个种群，从而无偏地反映自然状态下不同年龄、性别和基因型的分布情况。本实验方案适用于大规模野外部署，可快速将基质转化为线虫培养板，作者已在多个大陆的野外工作中验证了该方法的有效性。
引言
随着研究人员在实验室中对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的研究逐渐扩展到野外的 C. elegans 及相关杆状线虫，越来越多有价值的生物学见解正在涌现。对野生线虫的研究将基因和基因组置于其自然环境中，揭示了可能在实验室条件下被掩盖的功能1,2,3,4,5。这些研究深化了人们对进化本身前提——遗传变异——的理解6,7,8,9,10。野生样本所捕获的自然遗传变异，也为解析多种复杂性状的遗传基础提供了重要途径11,12,13。
在设计需要分离线虫自然种群的研究时，尤其是在进行野外远程采样时，实际操作中的考量尤为突出。本方案旨在从诱饵或野外基质中完整分离出能够以OP50培养的全部活性线虫种群。该方法特别适用于提取自由生活的杆状线虫科（rhabditid）和双胃线虫科（diplogasterid）线虫，包括Caenorhabditis、Oscheius和Pristionchus属的物种。
从基质中分离线虫的方法有多种14,15。最基本的方法是将基质直接放置在线虫培养基平板上，待线虫爬出后人工挑取8,15。如果目标是从样品中分离全部线虫，该方法需要耗费大量时间和人力。更复杂的技术则利用线虫的重量、体型、运动能力，或其多种特性的组合14。这些方法在操作设置和通量方面各有优缺点。此外，它们在取样偏差方面也存在差异，当样品中的线虫在分离原理所依据的特征维度上存在差异时，某些方法可能更倾向于分离特定类型的线虫。
贝尔曼漏斗法最早由荷兰医生 G. K. T. F. Baermann 于1917年提出，当时他在爪哇岛研究土壤中的线虫（包括寄生性钩虫）时发明了该装置16。贝尔曼漏斗的工作原理基于线虫的活动能力。将待测样品置于漏斗内，漏斗内衬一层布或纸制滤膜（本研究使用“Kimwipe”，在本方案中称为“无绒擦拭纸”），底部密封。随后向漏斗中加水，使样品完全浸没，滤膜则将样品与底部密封出口隔开。样品中具有活性的线虫会游离进入水中，并穿过滤膜，最终沉降在漏斗底部。打开漏斗出口，即可将含有线虫的液滴排出至培养皿中（图1）。
图1：贝尔曼漏斗法示意图。（A）从目标地点采集富含细菌的样本。（B）将样本浸入贝尔曼漏斗中，等待线虫扭动脱离并下沉。（C）从漏斗中释放单滴液体。（D）将单个雌雄同体个体或已交配的雌性转移至不同的培养皿中。插图由 Ramin Rahni 绘制。请点击此处查看该图的放大版本。
贝尔曼漏斗法并不适用于所有类型的线虫（具体替代方法参见讨论部分），最适合用于活动状态、体型在Caenorhabditis属或更小范围内的线虫14。然而，若研究可采用贝尔曼漏斗法，则具有诸多优势。该方法在野外操作简便，所需设备简单、人工干预少且成本较低。研究人员最终可获得干净的样本，培养皿中无基质干扰，便于挑取目标生物。使用滤膜还可防止昆虫幼虫或螨类污染培养皿，这些污染物会啃食培养基或捕食样本中的线虫。最重要的是，贝尔曼漏斗能够高效地从基质中提取几乎整个线虫种群14，这可能符合特定研究设计的需求。例如，关注野生种群发育阶段或性别分布、寻找生长缓慢或稀有基因型，或采集对OP50无趋性线虫的研究人员，均可从该方法中受益。对于研究生态学17、群体遗传学18或宏基因组学19问题的研究者而言，该取样方案尤为适用，因其可在取样时间点提供种群的瞬时快照。
本文描述了一种利用贝尔曼漏斗分离线虫群体并建立单雌性和单雌雄同体品系的完整实验方案，所选设备便于携带。对于在实验室附近开展野外工作的研究人员，其中许多步骤可以省略或简化。
方案
1. 在野外制备接种的NGM平板
- 在出行前，称取 23.005 g 线虫培养基（NGM）（见材料表）粉末，并预先分装至可密封的塑料袋中。每升所需培养基准备一袋。
注意：提前分装可避免在野外使用天平。 - 在出行前，为每升所需培养基分别准备 1 mL 的 1 M MgSO4、1 mL 的 1 M CaCl2 和 25 mL 的 1 M 磷酸钾缓冲液。配制 1 L 磷酸钾缓冲液时，按照 WormBook20 中所述方法，将 108.3 g KH2PO4 和 35.6 g K2HPO4 溶解于水中。
- 在出行前，按照 WormBook20 中所述方法，在 LB 培养基中于 37 °C 下培养 OP50（见材料表）过夜。将培养物分装至 50 mL 锥形管中，并用石蜡膜包裹管口以防泄漏。
- 在野外，将 NGM 袋中的内容物溶解于 973 mL 双蒸水（ddH2O）或可获得的最纯净、最无菌的水中，使用 1 L 的烧瓶或瓶子。
- 将培养基瓶或烧瓶（瓶盖松开或用铝箔覆盖），置于加热板或炉子上的沸水浴中。间歇搅拌，直至所有粉末完全溶解且溶液澄清（约需 30 分钟）。
注意：若具备磁力加热搅拌器，使用搅拌子可有效减少手动搅拌操作。 - 将培养基从水浴中取出，通过间歇摇动或使用搅拌子冷却至约 58 °C。当培养基冷却至 58 °C 时，使用血清移液管或标准移液管依次加入 25 mL 的 1 M 磷酸钾缓冲液、1 mL 的 1 M MgSO4 和 1 mL 的 1 M CaCl2，每加入一种试剂后均需充分混匀。
- 在尽可能无菌的环境中，将培养基用移液管或倾注方式加入所需尺寸的培养皿中，并静置过夜使其冷却并凝固。每个底物样品接种一个 60 mm 培养皿（约 10 mL）。每个同雌系接种一个 35 mm 培养皿（约 3.5 mL）；所需小培养皿的数量难以提前预测。
- 在每块平板上加入 50 µL 的 OP50 培养物，使用前静置过夜使其干燥并生长。
2. 线虫基质的采集
- 在野外寻找富含细菌的基质。一些示例包括腐烂的果实、花朵、真菌以及草本植物的茎。土壤和枯枝落叶层也适用，但很少含有 Caenorhabditis。
- 戴上手套后，取一部分该基质样品（1-15 cm3）放入可密封的塑料袋中（参见材料表），并用唯一的样品编号进行标记（图 1A）。
- 记录样品编号、纬度、经度、日期、基质描述以及与实验相关的其他本地环境参数，包括环境温度和基质温度、采集时间、基质状态、与基质相关的大型无脊椎动物的存在情况等。可使用智能手机应用程序来简化此过程21。
3. 巴ermann漏斗阵列的制备
- 每个漏斗，使用剪刀从橡胶管（见材料表）上截取一段长约 3 cm 的管段。
- 将橡胶管段套在塑料漏斗（见材料表）的末端。由于配合较紧，此步骤可能需要稍加用力。
- 将一个管夹滑至橡胶管上，并将其夹紧关闭。
- 制作漏斗支架时，使用解剖刀在未折叠成培养瓶托盘状态的硬纸板果蝇瓶托盘底部（见材料表）上切割出直径为 35 mm 的圆形孔。标准托盘可容纳以 3 × 4 阵列排列的 12 个孔。
- 将硬纸板翻转，将四侧向下折叠一次（非两次，即不完全折叠成果蝇瓶托盘的形态），然后用胶带将侧面固定，使翻转后的硬纸板托盘抬高（图 2）。
- 将漏斗插入孔中，插入前需确保橡胶管上的管夹处于关闭状态。
图 2：改造后的纸板果蝇小瓶托盘，经折叠和裁剪后可分别支撑12个贝尔曼漏斗。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 将样品转移至漏斗中
- 将尽可能无菌的水倒入每个漏斗中，加至距离漏斗边缘约 3 cm 处。若管路中存在气泡，轻敲漏斗以排出气泡。
- 戴手套后，将一块无绒擦拭布或专用的 Kimwipe（对折成正方形）覆盖在漏斗上，并按压其中心部位，使其浸入水中。
- 手动将天然基质（如果实、花朵、土壤、枯枝落叶等）中的大块固体破碎成较小碎片，以缩短线虫爬出基质所需移动的距离。
注意：枯枝落叶或形状不规则的样品可预先用食物加工机或搅拌机进行处理。 - 将一份天然基质样品（1–15 cm3）轻轻放置于漏斗内的擦拭布/无绒纸上，注意不要刺破擦拭布，且样品不得突出于漏斗边缘之上。
- 用与野外采集记录相对应的样品编号标记漏斗，或标记漏斗旁的纸板。
- 将擦拭布/无绒纸的四角折向样品中央（图 1B）。注意确保样品完全包裹在擦拭布/无绒纸内，防止土壤或碎屑落入漏斗底部。
注意：此步骤旨在避免擦拭布的角部垂悬于漏斗边缘，从而导致水分沿边缘被虹吸流失。 - 用手、刮刀或移液器吸头挑出任何可能在不同漏斗间移动的活跃昆虫、马陆或其他动物，以防样品交叉污染。可将擦拭布/无绒纸完全包裹样品，或在样品上方覆盖第二层擦拭布，以防止交叉污染。
- 向漏斗中补充更多水，使整个样品完全浸没（图 3）。
图 3：组装好的贝尔曼漏斗。 每个样品用无绒纸巾包裹后，浸入漏斗内的水中，并将漏斗夹紧。在约 12 小时的时间内，线虫将穿过纸巾迁移至漏斗底部。 请点击此处查看该图的放大版本。
5. 从漏斗中提取线虫
- 等待约 12 小时或过夜。在此期间，活跃的线虫会从基质中游出，穿过纱布/无绒擦拭纸，进入夹紧的漏斗底部。
注意：等待时间远超过 12 小时可能导致线虫因缺氧或病原体感染而死亡；对于线虫和细菌特别密集的样品，即使时间较短，也可能存在此类风险。 - 在接种了 OP50 大肠杆菌（E. coli）菌斑的 60 mm NGM 线虫培养板底部标记漏斗对应的样品编号。取下培养板盖子。
- 将装有该样品的漏斗从漏斗架上取下。一手持漏斗垂直位于打开的线虫培养板上方，另一只手松开管夹，使一滴水从管路滴落到线虫培养板上（图 1C）。一旦水滴从漏斗中滴下，立即重新夹紧管路，防止过多水分淹没 NGM 培养板。
注意：为筛选被 OP50 吸引的线虫（包括Caenorhabditis 属物种），应将水滴释放至细菌菌苔之外。当水被培养基吸收或蒸发后，Caenorhabditis 属线虫将爬入细菌菌苔中。 - 清理：丢弃漏斗内的内容物。用热水清洗漏斗，以备后续重复使用。
6. 建立培养体系
- 在体视显微镜下以 5x–50x 的放大倍数观察分离的线虫。培养皿中应包含线虫，以及频率低得多的少量寡毛纲环节动物、缓步动物、轮虫和小型甲壳类动物 (图 4)。
注意：若漏斗装置安装正确，则螨类、昆虫或可见的非生物杂质均不会通过漏斗进入收集容器。
图4：从贝尔曼漏斗释放到NGM平板上的第一滴液体中的内容物。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 为建立同源雌雄同体或同源雌性品系，使用线虫挑针将每只L4期雌雄同体或交配后的成年雌性（可通过其较大的体型及缺乏明显的雄性尾部特征进行识别22）转移至分别接种了OP50的35 mm NGM培养皿中（图1D）。在转移线虫前后，需使用打火机对线虫挑针进行灼烧灭菌。
- 使用封口膜将培养皿完全包裹，以便运输。
结果
本方案用于2018年8月在巴拿马史密森热带研究所野外工作站——巴罗科罗拉多岛，从果实、花朵、真菌、土壤和茎秆中分离线虫。一名研究人员在四天内处理了131个样本基质，其中130个（99.2%）成功获得线虫。44个样本基质（33.6%）中分离到Caenorhabditis属线虫（图5）。随后通过对这44个样本建立的培养物进行PCR分析和交配试验23，鉴定出六种不同的Caenorhabditis物种——C. becei、C. tropicalis、C. briggsae、C. sp. 24、C. sp. 57和C. panamensis。
该方案于2019年8月在乌克兰切尔诺贝利隔离区再次用于从多种基质中分离线虫，持续四天。在63份土壤样本中，有62份成功回收了活体蠕虫；在17份无脊椎动物样本中，有1份回收到蠕虫；在75份果实样本中，有31份回收到蠕虫；在12份诱饵样本中，有1份回收到蠕虫（见讨论部分）；而在蘑菇、河岸芦苇和狼粪样本（每种各采集一份）中均未回收到任何蠕虫。随后对18S核糖体DNA15进行测序，鉴定出这些线虫属于Oscheius、Panagrolaimus、Acrobeloides、Mesorhabditis、Panagrellus、Pristionchus和Pelodera属，但未鉴定到Caenorhabditis属线虫（图5）。
图 5：两次采集行程的成功率。2018 年巴拿马（左）和 2019 年乌克兰（右）。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
该方法的核心原理是：线虫会穿过浸没在水中的组织，而其基质及较大的无脊椎动物污染物则无法通过。本实验方案的关键步骤包括：（1）采集合适的基质样本，（2）将包裹在过滤材料中的基质浸入水中，（3）收集穿过滤膜并沉入水底的线虫，以及（4）分离单个线虫以建立同雌系或同雌雄同体系。该方法的其余所有部分均可根据可用资源、基质性质或野外工作目标进行必要的调整。以下是一些值得考虑的改进方案。
通过放置水果诱集线虫
如果野外采样点缺乏充足的富含细菌的腐烂物质，可考虑携带样品（如一片苹果或番茄）放置于现场使其腐烂。用若干木桩将诱饵固定牢固，以防被较大的动物移走，并便于后续采样时容易找到。应避免阳光直射，以免诱饵在腐烂前干燥。
使用手头可得的任何材料制作漏斗装置
只要结构上有足够容纳试管夹的孔洞，并能稳定支撑重心偏高的漏斗，即可使用。对于单个漏斗，饮水杯即可作为合适的支撑容器。任何类型的纸巾——面巾纸、卫生纸或纸巾——均可使用。
减少漏斗中的样品量或调整等待时间，以防止缺氧或感染
如果样品中线虫或细菌的浓度过高，线虫可能在12小时孵育完成前因缺氧或感染开始死亡。若存在此类问题，研究人员可提前检查漏斗，或另准备一个装有极少量高密度基质样品的漏斗进行平行处理。
根据实验需求和条件调整 NGM 平板的制备
NGM 平板可根据实验需要使用适当的培养基和食物来源进行制备。上述野外实验方案旨在尽量减轻携带重量。根据行李限制和野外工作的时间安排，携带预先倒好的 NGM 平板——无论是在实验室制备的或商业购买的——可能比在野外现场倒平板更为合适。
在实验室中进行漏斗分离
本方案描述了在野外条件下完成整个操作流程，以捕获自然界中存在的线虫种群。对于某些研究目的，在将样品装入密封袋带回实验室后，再进行线虫分离可能已足够。即便如此，与其它分离方法相比，贝尔曼漏斗法仍能提供更纯净且更完整的存活线虫样品。然而，密封袋中的样品在运输过程中可能会经历选择性压力，因为它们可能暴露于极端温度和缺氧环境。这一问题可通过在样品采集后尽快进行分离操作来最大程度地减轻。
一种常见的替代贝尔曼漏斗的方法是将基质直接放置在NGM平板上，等待线虫爬出，但这种方法要么劳动强度极高，要么导致种群收集不完全。此外，该方法还会使平板受到螨虫和昆虫幼虫的污染。贝尔曼漏斗法是一种低成本、低技术要求、低劳动强度的策略，可快速将全部活跃线虫种群与其基质分离。
贝尔曼漏斗法并不适用于收集所有类型的野生线虫。一些寄生于植物的线虫从其基质中逸出所需时间远超过12小时，若过早收集滴液，则这些线虫将无法被获得；而某些昆虫寄生性线虫会向漏斗顶部爬行而非底部，因而也会逃避收集14。除贝尔曼漏斗法外的其他替代方法，要么需要更专业的设备，要么需要更多人力来回收线虫。然而，若上述局限性对实验构成影响，这些替代方法仍可能被优先选用。van Bezooijen14综述了若干替代方案，包括喷雾漏斗法，该方法通过向漏斗持续喷洒水雾，增加氧气供应，并使悬浮的细菌溢出，从而允许更长时间地从植物材料中提取线虫。离心浮选搅拌法利用线虫的比重差异，分离运动缓慢、不活跃或向上爬行的线虫；Oostenbrink淘洗装置则通过逆向水流将沉降的沉淀物与悬浮的线虫分离；而科布法（Cobb's Method）则利用一系列筛网，根据线虫的大小、形状及沉降速率进行分离14。然而，对于收集杆状线虫科（rhabditids）而言，贝尔曼漏斗法仍能以最少的操作快速获得纯净的样本。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金R35GM141906和R21ES031364以及达蒙·鲁尼恩奖学金（Damon Runyon Fellowship）DRG-2371-19的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 L 玻璃瓶 | NA | NA | 步骤 1 - 制备平板培养基的容器 |
| 1 mL 移液器吸头 | 任意 | NA | 步骤 1 - 分配线虫培养基添加剂并接种平板 |
| 1 mL 移液器 | 任意 | NA | 步骤 1 - 分配线虫培养基添加剂并接种平板 |
| 35 mm 线虫平板 | Tritech | T3500 | 步骤 1 - 线虫平板 |
| 内径 4 mm 橡胶管 | Fisher | 14178A | 步骤 3 - 漏斗组件的一部分 |
| 60 mm 线虫平板 | Greiner | 628161 | 步骤 1 - 线虫平板 |
| 65 mm 漏斗 | Fisher | 22170156 | 步骤 3 - 漏斗组件的一部分 |
| 氯化钙 | Fisher | C79-500 | 步骤 1 - 线虫平板培养基成分 |
| 烹饪锅 | NA | NA | 步骤 1 - 作为水浴锅用于融化琼脂以倒平板 |
| E. coli 菌株 OP50 | 秀丽隐杆线虫遗传中心 | OP50 | 步骤 1 - 线虫食物 |
| 野外显微镜 | OMAX | G223CS | 步骤 6 - 用于在野外观察线虫 |
| 果蝇小瓶储存托盘 | Azer Scientific | ES-260T | 步骤 3 - 用于搭建可固定 12 个漏斗的平台 |
| 加热板或炉灶 | NA | NA | 步骤 1 - 加热水浴锅 |
| 吸水纸（Kimwipes） | KimberlyClark | 34120 | 步骤 4 - 漏斗过滤材料 |
| LB 培养基 | Gibco | 10855021 | 步骤 1 - 用于培养 OP50 菌株 |
| 打火机 | NA | NA | 步骤 6 - 灼烧灭菌线虫挑取针 |
| 硫酸镁 | Fisher | M63-500 | 步骤 1 - 线虫平板培养基成分 |
| NGM-lite 琼脂 | USBiological | N1000 | 步骤 1 - 线虫平板培养基成分 |
| Parafilm M 封口膜 | Fisher | 13-374-10 | 步骤 6 - 包装线虫平板以便运输 |
| 磷酸氢二钾 | Fisher | BP363-500 | 步骤 1 - 线虫平板培养基成分 |
| 磷酸二氢钾 | Fisher | P285-3 | 步骤 1 - 线虫平板培养基成分 |
| 手术刀 | NA | NA | 步骤 3 - 切割漏斗安装孔 |
| 剪刀 | NA | NA | 步骤 3 - 切割橡胶管 |
| 胶带 | NA | NA | 步骤 3 - 将漏斗支架固定在一起 |
| 管夹 | Fisher | 5869 | 步骤 3 - 漏斗组件的一部分 |
| 线虫挑取针 | NA | NA | 步骤 6 - 用于分离单个线虫 |
| 自封式储存袋（Ziplock 风格） | NA | NA | 步骤 2 - 用于封装底物样品 |
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