在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过 粒子图像测速技术
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摘要
摘要
早期 黑腹果蝇 胚胎是含有大量常规及胚胎特异性细胞器的大型细胞。在胚胎发育的最初三小时内，这些细胞器在肌动蛋白介导的胞质流动以及沿微管由马达蛋白驱动的运输作用下发生剧烈运动。多种针对特定细胞器的小型荧光探针（FPs）的开发，使得在任意基因型背景下均可对多种含脂结构进行可视化观察，从而实现无需依赖遗传编码荧光蛋白的活体成像。本方案介绍如何将活体染料和分子探针注射到 黑腹果蝇 胚胎以通过活体成像监测特定细胞器的转运过程。本方法通过标记脂滴（LDs）并利用粒子图像测速技术（PIV）追踪其整体运动加以演示。该方案提供了一种适用于研究其他细胞器（包括溶酶体、线粒体、卵黄囊泡和内质网）的策略，也可用于追踪单个脂滴沿微管的运动。使用市售染料可实现光谱上分离的 violet/blue 与 far-red 区域信号。通过多重共标记细胞器和/或细胞骨架组分 通过 显微注射，所有遗传资源在 果蝇 可用于转运研究，而无需引入荧光标记蛋白。与量子产率低且易漂白的遗传编码荧光团不同，许多现有染料可实现多个通道的快速同步采集，并具有高光子产率。
引言
活体染料和分子探针是用于活细胞中特定细胞结构和细胞器成像的有力工具。在 果蝇 胚胎中，许多不同的细胞器表现出由细胞骨架驱动的定位现象1,2,3,4，但这些小分子的应用具有挑战性，因为卵壳对其中许多分子具有不可渗透性。本方案描述了一种在活体胚胎中使用荧光探针（FPs）的方法 通过 显微注射以检测细胞器的大规模转运。该实验流程包括注射溶液的制备、卵子收集与胚胎准备、显微注射、成像以及图像分析。
在许多动物的卵母细胞、卵子和胚胎中，细胞器会发生显著的空间重排，部分原因是这些细胞体积较大。Drosophila 胚胎中，脂滴（LDs）和卵黄囊泡在细胞化开始前会向胚胎中心移动5。这一运动依赖于微管，并在胚胎周边形成一个约 40 µm 宽、几乎不含这两种细胞器的区域。在更早的卵裂阶段，许多细胞器通过由胚胎表面肌动蛋白-肌球蛋白介导的收缩所驱动的胞质流动进行运输6。尽管多种物种的胚胎均表现出类似的重排现象，但Drosophila 胚胎特别适合通过成像手段来研究这些过程，因为它在标准实验室“室温”条件下体外发育，具有较高的透明度，体积足够小可适配大多数显微镜系统，并且可利用强大的遗传工具进行操作。
对于某些细胞器，已有可用的荧光标记蛋白，可特异性地标记这些结构。例如，LSD-2（也称为 dPLIN2）是一种在胚胎中特异性靶向脂滴（LDs）的蛋白7。目前已建立果蝇品系，携带可诱导的转基因，编码绿色荧光蛋白（GFP）与 LSD-2 的融合蛋白8，或携带基因捕获系统，其中黄色荧光蛋白（YFP）被插入内源性 LSD-2 基因的编码区9,10。然而，该方法存在局限性，包括这些融合蛋白的量子产率较低，且容易发生光漂白。此外，同时标记多种不同结构可能具有挑战性：对于许多细胞器，目前仅有一种类型的荧光标签（通常为 GFP 或 mCherry）可用，因此同时成像两个细胞器可能需要构建新的转基因或插入序列；即使存在兼容的荧光标签，将其引入同一品系也可能需要耗时的杂交操作。这也会使利用大量强大的遗传资源变得不够便利，例如，当两个细胞器标记、一个 Gal4 驱动元件和一个可诱导的 RNAi 构建体都需要存在于同一个母本中时。
原则上，这些局限性可通过使用荧光蛋白（FPs）以及活体染料（如.，LysoTracker 标记溶酶体）、分子探针（例如 SiR-tubulin 标记微管）以及荧光标记的生物分子（例如 C12 BODIPY 探测脂肪酸代谢）11）。在培养细胞中的应用表明，它们通常是经过充分验证的、用于探究细胞生物学的有力工具。荧光蛋白具有多功能性、优异的光化学特性，并可与其它荧光蛋白兼容。多种染料可混合并同时使用，通常具有光谱上分处紫/蓝区和远红区以及斯托克斯位移较小的优势，从而避免通道间的串扰。较小的斯托克斯位移允许同时采集多个成像通道信号，实现对多个细胞器的同步追踪。最后，这些染料同样可用于标记其他胚胎中的细胞器 果蝇 物种，甚至其他可能无法获得荧光标记蛋白的昆虫。
然而，大多数这些荧光蛋白无法穿过结构复杂的卵壳 果蝇 胚胎。它由五层结构组成：三层外层的绒毛膜（chorion），可防止机械损伤，以及一层包围卵黄膜的蜡状层，形成化学屏障。12为简便起见，蜡质层与卵黄膜的组合将统称为 "卵黄膜" 如下。为绕过卵壳，本方案采用了一种成熟的胚胎显微注射方法，将荧光蛋白（FPs）导入胚胎中 果蝇 胚胎。该方案描述了如何监测卵裂期胚胎中脂滴（LDs）的胞质流动，包括注射针的制备和卵收集笼的准备、卵的收集过程以及机械去除卵膜的方法。方案还详细介绍了如何对胚胎进行显微注射和成像，并利用粒子图像测速技术（PIV，改编自6）。提供了确保胚胎存活和建立最佳成像系统的故障排除建议。同时讨论了如何修改该方案以同时成像脂滴（LDs）和微管，或将其应用于其他细胞器（包括溶酶体、线粒体、卵黄囊泡和内质网（ER））的研究。
方案
1. 准备必要的材料
注意：这些准备工作最好提前数天或数周进行。
- 准备注射针。
注意：针头可长期存放在带盖容器中。针头必须足够细，以递送约 700 fL 的液体，同时又需足够坚固，能够刺穿卵黄膜。- 将毛细管放入拉针仪的毛细管夹持器中，并用翼形螺母固定。将毛细管中心与加热元件对齐，以便生成两根对称的针头。
- 根据制造商的说明，在拉针仪上选择合适的设置。
- 使用解剖显微镜进行质量控制。
注意：针尖应尽可能细。出现裂纹、锯齿状或内径过大的针尖应予以丢弃。 - 每次制备 10 根针头（相当于 5 根毛细管）为一批。
- 将已卷成圆柱形的可塑性橡皮泥置于带盖容器底部中央。小心地将针头插入橡皮泥中，使其水平固定，针尖悬空，避免受损。盖上盖子，保存备用。
- 准备收卵培养皿。4 °C 保存。
注意：收卵培养皿为小型琼脂平板，添加果汁以促进果蝇产卵。其制备方法已在多种实验方案中描述，包括13。 - 制备正庚烷胶。
注意：该胶水从双面胶带中提取，用于将胚胎牢固地粘附在盖玻片上，防止注射和成像过程中胚胎漂移失焦。胶水可提前数天至数周制备。- 将双面胶带揉成比高尔夫球稍大的团块，置于约 50 mL 带紧密封盖的玻璃容器底部。胶带应压实，以确保有足够的胶粘剂。
- 在通风橱中，向玻璃容器中加入正庚烷，直至完全浸没胶带。不使用时应始终保持容器密闭。
警告：正庚烷液体和蒸气均易燃，可引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激。吸入蒸气可能导致嗜睡、头晕和肺损伤。应远离点火源，并储存在专用于易燃物的通风良好区域，避免与不相容物质接触。 - 让正庚烷胶静置过夜或更长时间。为获得最佳效果，可将容器置于摇床或其他振荡装置上过夜，以促进胶粘剂溶解。
注意：胶带本身不会溶解，但其胶粘成分会溶于正庚烷中。在步骤 5.1.2 中，将胶水涂于盖玻片上，正庚烷挥发后留下胶质残留物。 - 通过在载玻片上滴加一滴胶水并确认正庚烷挥发后留下黏性残留物，来测试正庚烷胶的制备效果。若未观察到明显胶质残留，应向玻璃容器中添加更多胶带并重复上一步骤。
注意：制备完成后，该胶水可使用数月甚至数年。
- 使用市售的 BODIPY493/503 产品，在无水 DMSO 中稀释配制 1 mg/mL（3.8 mM）的储存液。避光防潮保存。可长期储存于 -20 °C，短期储存于 4 °C。
2. 准备卵收集笼
注意：应在计划注射前至少一天（最好为两到三天）完成此步骤。
- 制备酵母糊。
注意：酵母糊可补充苹果汁培养基中缺乏的蛋白质及其他重要营养物质，有助于促进产卵和排卵。- 在小烧杯中加入 2–10 g 干酵母，再加入 1 mL 自来水，用刮刀混合均匀。
- 每次添加 1 mL 自来水，持续搅拌，直至达到类似牙膏的粘稠度。
- 将混合物盖好，于 4 °C 下保存。
- 设置果蝇饲养笼用于收集卵。
注意：需要准备目标基因型的雄性和雌性果蝇：10–50 只两周龄以内的雌蝇，以及数量相近的雄蝇。果蝇饲养笼有多种选择，包括自制装置14,13。需注意苹果汁培养基的尺寸应与果蝇饲养笼的尺寸相匹配。- 在苹果汁培养基表面涂抹少量酵母糊，保持加盖状态并使其恢复至室温，因为若培养基温度过低，果蝇将不会在其上产卵。
- 将果蝇转移至胚胎收集笼中，用涂有酵母糊的苹果汁培养基封口，并将培养基固定在胚胎收集笼上。
- 让新转移的果蝇在笼中适应 1–2 天，每天更换一次新鲜培养基。若次日酵母已全部被食用，应在后续收集时增加酵母糊的用量。
注意：此步骤至关重要，营养充足的雌蝇产卵量更高，有助于提高卵的收集产量。
3. 注射当天，配制注射溶液并将其装入针头
- 使用 BODIPY 493/503 储存液（3.8 mM，溶于 DMSO）作为注射溶液。
- 使用加样尖端将 1 µL 注射溶液装入单根针头。
注意：尽量将液体完全装至针尖，避免产生气泡。若针头意外断裂，请准备立即更换已装液的针头。- 将加样尖端连接至微量移液器，并吸取 1 µL 注射溶液至尖端内。佩戴手套，一手握住针头，针尖朝外，以降低断裂风险。
- 小心地将加样尖端插入针头，并推至接近针尖处。在针尖附近排出液体。移除移液器后，将针头垂直放置，针尖朝下，直至液体完全流至针尖。
- 将装好液体的针头存放于单独的容器中，并用橡皮泥固定（参见步骤 1.1.5）。
注意：针头应提前准备（最多可提前数小时），但存放超过一天后不得再使用。 - 避免针头暴露于环境光下，以防染料褪色。用铝箔包裹储存容器，注意不要损坏针尖，确保完全避光。
4. 收集用于注射的胚胎
注意：收集时间取决于注射操作所需的胚胎发育阶段。按照以下时间安排，在准备注射时，胚胎的年龄为0-90分钟，对应卵裂期15。
- 注射当天，按步骤 2.2.1 制备含酵母的苹果汁培养板。若计划进行 N 轮注射，则准备 N + 2 块培养板。将这些培养板置于室温下保存。
注意：除用于收集注射胚胎的 N 块培养板外，还需准备 1 块预收集板，以及 1 块用于在收集完成后向笼中果蝇提供食物的培养板。 - 将果蝇笼中的培养板更换为一块新鲜的含酵母培养板（预收集板），并将其留在笼中 1–2 小时。
- 将果蝇笼中的培养板更换为一块新鲜培养板（收集板）。丢弃预收集板，因其上可能含有超过所需年龄的胚胎。随后，让果蝇产卵 1.5 小时。
注意：营养充足的果蝇通常在卵子受精后不久即开始产卵，因此 1.5 小时的收集时间可确保收集结束时，培养板上的大多数胚胎年龄为 0–90 分钟，即处于卵裂阶段。若雌蝇自前一天起未摄取新鲜酵母，则可能在体内滞留受精卵一段时间后才产下。因此，预收集板上可能含有在收集开始前即已受精的胚胎，其年龄可能超过 60 分钟，有时甚至更老。 - 将果蝇笼中的培养板更换为一块新鲜的含酵母培养板。用盖子盖好收集板，防止散落的果蝇在上面产卵。
5. 准备用于显微注射的胚胎
- 准备所需的材料。
- 将一片双面胶带贴在载玻片上。避免用手指接触胶带，以免降低其黏性。
注意：此载玻片将用于去除卵壳，不用于成像。 - 使用移液管或微量移液器 （p200 或 p1000），在矩形盖玻片（60 × 25 mm）中心附近滴加少量正庚烷胶（200 µL 或更少）。让正庚烷挥发（耗时不到1分钟）。
注意：此盖玻片将用于固定胚胎以进行显微注射和成像。选择该尺寸是为了适配共聚焦显微镜上的可调节金属夹具。 - 准备一个干燥室，即一个密封容器（例如保鲜盒），内含干燥珠。仅使用未吸水的干燥珠。
注意：为确保胚胎吸收注射液，需轻微干燥胚胎以降低内部压力。此步骤通过将去壳后暴露在空气中的胚胎置于干燥室中完成。
- 将一片双面胶带贴在载玻片上。避免用手指接触胶带，以免降低其黏性。
- 机械法去除卵壳。
- 在适当发育龄的胚胎培养板上覆盖一层薄薄的石蜡油27，使卵壳变得透明。
注意：胚胎在数十秒内变为半透明15。如果此步骤效果不佳，可能是苹果汁培养板过湿，使用前需干燥。 - 在解剖显微镜下利用透射照明（即光线穿过培养板进入目镜）观察，确认胚胎的发育阶段。
- 选择处于卵裂期的胚胎。
注意：卵裂期胚胎完全不透明；随后的囊胚期可通过围绕不透明中心的一圈透明细胞质来识别15。发育生物学学会维护的网站（见参考文献16）提供了识别不同胚胎阶段的良好入门指南。 - 使用精细镊子夹住目标发育阶段胚胎的背侧附属结构，将其转移至已准备好的、贴有双面胶带的载玻片上。将胚胎放置在胶带上，并尽量减少油的转移。
- 尽可能轻柔地用镊子尖侧面轻轻推动胚胎，使其在胶带表面滚动。切勿用锋利的镊子尖直接刺戳胚胎。
注意：若施加的力过小，胚胎不会滚动；若过大，则会破裂。找到合适的中间力度需要经验，因此建议事先练习此步骤。 - 持续滚动胚胎，直到卵壳暂时黏附于胶带并出现裂纹。
- 一旦卵壳破裂，继续滚动，使胚胎（仍处于卵黄膜内）与黏附在胶带上的卵壳分离。
- 通过观察胚胎是否失去背侧附属结构，确认卵壳已完全去除。
- 将胚胎重新滚回卵壳上（卵壳的黏性低于胶带），用镊子轻轻摩擦胚胎，直至其附着于镊子以便转移。
- 将胚胎转移至含有正庚烷胶的盖玻片上，并使其接触胶液，通常可使胚胎从镊子上脱落。
- 调整胚胎在盖玻片上的方向。
- 将胚胎的侧面嵌入胶液中。
注意：嵌入胶液的胚胎表面即为成像面。嵌入侧面最为简便，但也可根据个人偏好或待解决的生物学问题进行调整。 - 使胚胎的长轴与盖玻片的长轴垂直。
- 若胚胎未处于理想方向，清洁镊子以去除可能使胚胎脱离胶液的油滴，然后轻柔尝试将胚胎滚动至合适位置。
- 将胚胎的侧面嵌入胶液中。
- 按照上述方法准备所需数量的胚胎用于注射。
注意：去壳后随着时间推移，环境空气会逐渐干燥胚胎，导致盖玻片上不同时间去壳的胚胎在步骤5.3中的干燥效果不一致。通常，1–3个胚胎最易于操作。
- 在适当发育龄的胚胎培养板上覆盖一层薄薄的石蜡油27，使卵壳变得透明。
- 干燥胚胎。
- 将带有胚胎的盖玻片放入已准备好的干燥室并密封。
- 让胚胎干燥5–12分钟。
注意：此步骤的时间取决于环境温度和湿度，需通过实验经验确定。 - 从干燥室中取出盖玻片，并在其上滴加一滴石蜡油700，完全覆盖胚胎，以防止进一步干燥。
- 在解剖显微镜下检查胚胎，判断干燥程度是否合适。
- 若胚胎仅轻微皱缩但未塌陷，继续进行显微注射（步骤6）。
- 若胚胎干燥不足或过度，返回步骤5.2，准备新的一批胚胎（因石蜡油700无法去除）。若胚胎过度干燥，下一批胚胎的干燥时间减少3分钟；若干燥不足，则增加3分钟。
6. 显微注射胚胎
注意：确保显微注射装置包含倒置显微镜、用于固定和定位注射针的显微操作器，以及可输送精确控制体积的商用显微注射仪。
- 打开显微注射仪，输入所需的设置。
注意：本实验方案推荐使用线性运动输出和快速设置，但其他多种设置也可适用。操作者应根据个人偏好确定最佳设置。 - 将注射针装入显微操作器中。为防止在加载含有胚胎的盖玻片时损坏针头， 应先将其移至安全位置，避开操作区域。
- 将带有胚胎的盖玻片放置于载物台上，朝向针头方向。然后小心地将针头移回注射位置，确保针尖仍明显高于载物台表面。
- 将4倍物镜转入光路。使用显微镜的调焦旋钮，使胚胎清晰对焦。
注意：此焦平面将用于后续注射，之后仅需进行微小调整。 - 使用载物台控制装置，将胚胎水平移动至视野中央。
- 平移载物台使胚胎移至视野边缘，为降低针头做准备。保持在同一焦平面，以确保针头下降至正确位置。
- 将针尖降至正确的焦平面，并确保其与胚胎同时在视野中可见。
- 通过显微操作器的控制装置，并从上方观察（尚未通过目镜），缓慢将针尖插入油中，目标区域为物镜所指位置。由于油的黏度较高，操作应缓慢进行，避免损坏针头。
- 当通过目镜可见针头时，继续使用显微操作器控制装置，直至针尖清晰对焦并位于视野中心。
- 通过移动载物台，将胚胎重新移回视野中央。同时使用载物台控制、显微操作器控制和调焦旋钮，精细调节胚胎与针尖之间的相对位置，确保两者均清晰对焦。注射时应尽可能靠近盖玻片进行。
- 进行针头质量控制。
- 为确认针头功能正常，可将部分注射液排出至包围胚胎的HaloCarbon Oil 700中，观察油中是否出现气泡。
- 若无液体从针头流出，逐步增加注射仪的压力。若仍无效，则更换新针头。
- 对胚胎进行注射。
注意：可接受的注射体积范围约为0.06–1 pL。下限由可观察到进入胚胎的液体量决定，上限则由注射对胚胎造成的机械损伤程度决定。- 沿胚胎的侧缘进行注射，以减少侵入性。
- 使用载物台控制装置，将胚胎向针尖方向移动，直至针尖轻柔刺入胚胎并进入其内部。
- 同时启动注射液流动，观察针尖处是否出现短暂的透明斑点，该现象表明液体已成功注入胚胎。
- 密切观察胚胎状态。若胚胎抵抗针头并在穿刺时破裂（胞质喷出），则返回步骤5，延长干燥时间。若胚胎紧贴盖玻片且在注射过程中呈现松软状态，则返回步骤5，缩短干燥时间。
- 若染料未进入胚胎，需确认染料是否仍能如步骤6.7所述自由从针头流出。若染料无法流出，则更换针头；若染料可正常流动，则选择新的胚胎进行注射，并在针头即将刺入胚胎前开始释放染料。
注意：不建议对同一胚胎重复注射，以免破坏先前的伤口或注射位点。
- 重复上述步骤，直至所有胚胎完成注射。
7. 观察胚胎
注意：本实验方案使用激光扫描共聚焦显微镜。
- 将盖玻片放入共聚焦显微镜的金属支架中，使胚胎通过盖玻片直接从下方成像；盖玻片上方仅有油，无其他屏障。
- 作为质量控制步骤，首先使用共聚焦显微镜的落射荧光功能，配合40倍物镜进行成像。在继续操作前，确保胚胎中的荧光染料可见。
- 如果成像目标平面与注射位点不同，需给予足够时间使染料扩散至目标区域。
注意：对于BOPIPY 493/503，该时间通常为30–60分钟。由于扩散时间很大程度上取决于染料种类，其他染料可能需要优化注射位点和等待时间。 - 使用不同的物镜对不同尺度的样本进行成像。使用40倍物镜对整个胚胎成像，使用63倍物镜对较小区域的局部进行成像。
- 在细胞化前的合胞体阶段进行活体成像时，可采用以下初始条件：图像尺寸为512 × 512像素，线平均为3，帧速率为0.1帧每秒（即每10秒获取1帧）。根据所用显微镜的性能调整成像条件。
注意：这些条件可从BOPIPY 493/503获得约500帧以上的图像，并捕捉到大部分运动过程。
8. 首先使用 FIJI 准备图像时间序列，然后利用 Python 进行 PIV 分析，以分析脂滴流动
- 优化图像采集。
- 在适当阶段注射所需染料。重复此步骤，直至日间差异可忽略不计。
- 优化图像采集参数，包括放大倍数、缩放、分辨率和帧率。
注意：高质量图像（分辨率 + 扫描线平均）与采集速度（帧率）之间存在权衡。
- 在 FIJI 中准备数据。
- 获取一段高质量的时间序列用于分析。
- 打开时间序列中的某一帧，以在 FIJI 中生成掩膜（mask）。复制该图像。将图像的类型转换为 8 位。
- 使用多边形或自由手选工具定义胚胎边界。使用清除外部命令将选区外的像素值设为 0。清除选区内像素值，然后反选，将选区内像素值设为最大值（255）。
- 取消选择，然后使用直方图命令确认图像中仅存在 0 和 255 两种像素值。
- 保存该时间序列专用的新图像掩膜。
- 打开目标时间序列。选择最能代表目标时间段的十帧图像，例如皮层收缩起始时的核周期 9。复制这十帧图像，形成一个子堆栈（substack）。
- 使用堆栈转图像功能生成 10 幅用于 PIV 分析的图像。
- 保存各个文件时需保持其顺序（如 SeriesX_1、SeriesX_2、SeriesX_3 …）。
- 使用准备好的掩膜和单帧图像进行 PIV 分析，可采用提供的示例 Python 脚本（补充数据）或用户自定义脚本。
注意：所提供的脚本基于 OpenPIV17 的 Python 应用程序。输出结果为像素单位的距离，可通过像素宽度和帧率换算为速度或速率。 - 对额外的胚胎重复上述步骤，并汇总输出值，以生成重复样本。
结果
注射后，染料仅会定位于针尖插入的位置。随后，染料将根据其扩散特性从注射位点向外扩散。图1展示了BODIPY 493/503在注射后不久（图A）以及24分钟后（图B）的分布情况。24分钟后，染料已扩散至胚胎长轴的大致中点位置。
通过染料注射和延时成像可实现对细胞器运动性的分析。在 图2，将胚胎与BODIPY 493/503共注射图2A）和 LysoTracker Red（图2B）并分别使用488 nm和596 nm激光激发进行成像。随后对该胚胎进行延时成像（每30秒采集一帧，持续30分钟，分析其中5分钟的数据）。将该时间序列进行PIV分析，结果如图所示 通过 流线在 图 2A，B需要注意的是，流线并不代表单个粒子的运动轨迹，而是通过分析该区域细胞质中所有粒子的运动来推断胞质流动。通过对两种独立的细胞结构（脂滴和酸性细胞器）进行标记，PIV分析发现类似的流动模式，两种标记均汇聚于胚胎中央区域，表明细胞质正流向胚胎内部6.
目前可用的荧光蛋白可用于标记多种其他细胞器和细胞结构。 图3 显示内质网的标记 通过 ER示踪剂 Green。ER示踪剂可清晰显示核膜结构，便于观察细胞周期的主要阶段。ER示踪剂 Green 使用488 nm激发光进行成像。
线粒体的标记较为困难，因为大多数测试的染料似乎会被困在它们进入的第一个线粒体中。另一方面，未检测到染料具有毒性迹象，因此可以追踪标记的线粒体经过细胞化过程以及外胚层第15次核分裂周期的情况。图4展示了注射MitoView 633（激发波长633 nm）数小时后的外胚层细胞。
BODIPY、Lysotracker 和 LipidSpot 性能稳定，可在 512 × 512 分辨率、线平均 3 次、帧速率为每秒 1 至 0.1 帧的条件下获取约 500 张以上的图像。ER tracker Green、SiR-微管蛋白以及上述线粒体染料性能较弱，在相同条件下仅能获得约 50 至 200 张图像。
从囊胚期开始，脂滴在微管上由具有相反极性的马达蛋白——驱动蛋白-1和细胞质动力蛋白——驱动，进行双向移动5. 通过同时标记脂滴和微管可以观察到这种运动 通过 同时注射 BODIPY 493/503 和 SiR-Tubulin（图5）。由于脂滴（LDs）经常改变其运动方向（在驱动蛋白-1和细胞质动力蛋白之间切换时），在采集过程中使用更高的帧率能更好地捕捉脂滴运动的关键细节。
无需任何染料注射即可对自发荧光的卵黄囊泡进行活体成像（图6）。然而，自发荧光信号较弱，且激发激光具有光毒性。因此，与染料注射相比，卵黄自发荧光的活体成像信噪比较低。
图 1：BODIPY 493/503 在胚胎中的扩散。 染料沿侧缘向胚胎前端（右上角）注射，并从注射位点向胚胎内部扩散，标记脂滴（LDs）。（A）染料已扩散至注射位点附近的胚胎区域。（B）约24分钟（即2个核周期）后，染料已扩散至胚胎中点以外。比例尺：100 µm。每30秒采集一帧图像（1024 × 1024，线平均为4）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：脂滴（LDs）和酸性细胞器的粒子图像测速法（PIV）分析。 胚胎同时注射了BODIPY 493/503和LysoTracker Red。(A) BODIPY通道图像。(B) LysoTracker Red通道图像。(A',B') 基于连续10帧图像（包括图A和B所示帧）进行PIV分析生成的流线图。A'对应脂滴的流动方向，B'对应酸性细胞器的流动方向。请注意，A'和B'均显示胚胎内容物从视野平面流出、向胚胎中心汇聚的偏左中心合流现象。此外，由于不同染料具有不同的扩散特性，BODIPY的扩散程度高于LysoTracker。比例尺：100 µm。每30秒采集一帧1024 x 1024图像（线平均为4）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：内质网示踪剂标记合胞体核分裂。 对一个合胞体囊胚期胚胎显微注射内质网示踪剂，并随时间成像其表面的一部分。（A）核分裂过程中的纺锤体组装。（B）同一分裂过程中核膜的断裂。（C）随后的间期。（D）下一次分裂的起始由中心体出现指示（表现为无内质网的圆形区域，箭头标示）。注意染料逐渐漂白。激发波长：488 nm。比例尺：5 µm。A：初始帧，B：已过去 3 分钟，C：已过去 10 分钟，D：已过去 13 分钟。每 30 秒采集一帧图像（1024 × 1024，线平均为 4）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：Mitoview 633 标记线粒体。 在合胞体胚盘阶段向胚胎注射 Mitoview 633，细胞化完成后 4 小时进行成像。图像显示处于原肠带伸展阶段胚胎中的一个神经外胚层细胞。比例尺：5 µm。每 30 秒采集一帧图像（1024 × 1024，线平均 4 次）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：脂滴与微管的共标记。 一个正在细胞化的胚胎被注射了 BODIPY 493/503（黄色，A,B,C）和 SiR 微管蛋白（洋红色，A',B',C'）的混合物。A'', B'', C'' 显示了通道合并后的图像。图版 A、A' 和 A'' 显示初始帧，图版 B、B' 和 B'' 显示 5 秒后的帧，图版 C、C' 和 C'' 显示 10 秒后的帧。比例尺：5 µm。每 2.5 秒采集一帧 512 x 512 的图像（线平均为 3）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：合胞体卵裂阶段卵黄囊泡自发荧光的成像。 （A）采集开始时。（B）8分钟后。（C）16分钟后。激发波长：405 nm。采用低激发强度以维持胚胎存活。比例尺：100 µm。每30秒采集一帧图像（1024 × 1024，线平均4次）。请点击此处查看该图的放大版本。
补充数据。 请点击此处下载该文件。
讨论
Drosophila 胚胎是研究细胞和有机体生物学基本问题的强大且便捷的模型。其结构相对简单、遗传操作手段强大且体积较小，使其成为对细胞过程和发育过程进行成像研究的理想体系。本文改编了一种标准的显微注射方案，以实现在胚胎中使用荧光染料（FP）。该方法无需依赖基因编码的荧光蛋白，即可对特定的细胞结构进行荧光成像，从而使得多种遗传背景的胚胎均可用于成像研究。结合多种染料以及经过策略性选择的荧光标记蛋白，可实现覆盖整个可见光谱的多通道活体成像。
实验方案中的关键步骤：
本方案使用 BODIPY 493/503 对脂滴（LDs）进行标记。该方法可轻松适用于标记其他细胞结构。在后续图像分析中，最重要的因素之一是信噪比，即染料的荧光强度相对于背景信号的水平。溶酶体（LysoTracker Red，1 mM）、线粒体（Mitoview 633，200 µM）、内质网（ER tracker Green，10 µM）以及微管（SiR tubulin，200 nM 溶于 DMSO）均已成功成像，如图 2、图 3、图 4、图 5所示。此外，卵黄囊泡具有自发荧光，在紫外光激发下会发出蓝光（使用 405 nm 作为激发波长进行成像（图 6））。对于其他染料，建议其浓度为活体培养细胞染色所需浓度的 100 至 1,000 倍；这相当于用于稀释加入细胞培养基中的储存液浓度。由于本方案要求注射体积为 100 fL，而果蝇（Drosophila）胚胎体积约为 9 nL18，因此这些染料在胚胎内的平均终浓度将低于细胞培养基中浓度的 1/100。在注射位点局部，染料浓度会暂时更高，这一点对于扩散能力较差的荧光探针尤为重要（例如线粒体染料和 SiR-tubulin）。对于此类荧光探针，应首先采用推荐的高浓度；若观察到非预期的胚胎死亡，可逐步进行两倍稀释，直至在存活率与信号强度之间达到可接受的平衡。
共注射多种染料时，应将两种染料溶于相同的溶剂中，或者确保两种溶剂和染料彼此相容于混合体系（不建议使用酒精浓度超过约10%的溶液）。
针头的质量对于本实验的成功至关重要，因为针尖需要尽可能精细。否则，注射造成的伤口损伤可能会影响胚胎的后续发育。由于不同厂家生产的拉针仪存在差异，因此必须遵循制造商的建议，并尝试多种拉针参数，直至获得理想的针头形状。必须严格执行质量控制步骤1.1.3，因为使用有裂纹、边缘不齐或内径过大的针尖将使注射操作变得更加困难，甚至无法成功完成。
胚胎需要部分干燥，以便在注射过程中能够加入额外体积的液体。如果胚胎干燥不足，针头将难以刺入，并且在针头穿透或溶液注射时细胞质会喷出。如果胚胎过度干燥，其外观会呈现塌陷状，并且无法正常发育。确切的干燥时间取决于当地条件，例如空气湿度，并可能逐日变化。每次实验均需通过经验确定合适的干燥时间。
胚胎在显微注射后的存活能力在很大程度上取决于针头的质量、适当的干燥程度，以及将注射体积限制在1 pL以下（理想情况下为100 fL）。只要这些参数得到优化，在推荐浓度下注射所述染料时，未见明显毒性。如果胚胎能够耐受干燥和注射过程，通常可正常发育至原肠胚带伸长期，但微管和内质网探针除外，高浓度时（每种探针以原液浓度注射100 fL）会导致细胞化缺陷。测试发现，在推荐注射体积下注入DMSO、水或两者的混合物时，未观察到明显的发育异常，胚胎存活至原肠胚带伸长期的比例约为75%或更高。注射体积超过1 pL会导致发育缺陷，注射约4 pL体积的胚胎发育时间少于1小时。因此，必须保持较低的注射体积，这意味着染料浓度必须较高。
通常建议沿胚胎的侧缘进行注射，因为这样造成的损伤最小。然而，注射位点可能需要根据所用荧光探针（FPs）的扩散特性进行调整。BODIPY 493/503 和 LysoTracker 在整个胚胎中的扩散速度比 Lipid Spot 610（另一种标记脂滴的染料）更快，而 SiR-Tubulin 和 Mitoview 633 则从未在整个胚胎中完全扩散（即使在注射后 7 小时成像仍如此）。因此，可能需要在目标区域或其附近进行注射。当在胚胎的前部或后部区域注射时，建议使用特别精细的针头。
图像采集依赖共聚焦显微镜，以实现对微小细胞器及所有细胞骨架组分的光学切片和清晰分辨。需要分析大量图像的技术（例如STORM或PALM）在此不适用，因为胚胎内容物处于运动状态，且荧光基团未优化用于光转换。落射荧光显微镜则缺乏足够的横向和轴向分辨率，难以分辨大多数细胞器和较小的细胞结构。基于这些原因，强烈建议使用共聚焦显微镜或采用光片显微技术。
图像分析的可重复性在很大程度上依赖于成像数据的一致性。为了获得最佳的成功几率，需要优化注射技术和图像采集过程。建立并反复练习一种稳定的技术，使目标染料、注射部位、胚胎发育阶段、注射体积以及图像采集设置均保持一致，将为图像分析提供最可靠的数据。
方法的改进与故障排除
本实验方案展示了一种利用粒子图像测速技术分析卵裂期胚胎中脂滴（LDs）整体流动的方法。该方法同样适用于其他细胞器、其他发育阶段以及其他分析手段。例如，图2展示了通过共注射BODIPY 493/503和LysoTracker Red标记，在合胞体发育阶段对脂滴和酸性细胞器流动进行的分析。此外，已成功实现对受精后长达7小时的胚胎中脂滴运动的成像；这些胚胎虽保留注射造成的伤口，但仍能继续发育数小时。
利用本方案获取的数据已用于粒子图像测速分析，但也可采用多种其他分析技术。例如，可使用 ImageJ、Imarus 中的粒子追踪程序或手动追踪方法，来获取运动结构的速度和运动方向。需要注意的是，大多数此类追踪软件设计用于平面细胞培养系统所获得的数据，通常难以很好地适用于果蝇（Drosophila）胚胎等三维结构。此外，若要获得高质量的粒子追踪数据，需对多个Z平面进行成像；如果图像堆栈的采集时间在约2秒以内，则该目标应可实现。这一时间标准在转盘共聚焦显微镜、晶格光片显微镜以及较新的激光扫描共聚焦系统上均可达到。然而，对于脂滴（LDs）、线粒体和溶酶体等丰度较高的细胞器，由于视野中阳性信号过多，现有追踪方法难以处理，因此实现追踪的可行性较低。而对于丰度较低的结构，如细胞核或卵黄囊泡，则可能实现有效追踪。在卵裂阶段，脂滴和酸性细胞器可自由移动，因此适用于基于粒子图像测速法（PIV）的流动分析。而细胞核、内质网（ER）和线粒体等细胞器则与其他细胞结构存在连接，运动受限，无法自由移动，因而不适合采用假设自由运动的软件进行分析。研究者应根据目标细胞器的特性，选择最合适的分析技术。
在合胞体和细胞化囊胚阶段，脂滴（以及其他一些细胞器）会沿着径向排列的微管移动5。因此，可以找到横截面视图（如图5所示），其中单根微管在较长距离上保持清晰对焦，从而实现二维的颗粒追踪。由于这些光学切面位于胚胎内部较深处，整体信号强度减弱，信噪比也随之降低。
对于追踪分析，应尽可能快速地进行成像，以揭示运动过程及其运动机制的关键细节。例如，脂滴的运动包含两种运动状态：缓慢短距离运动（约 200 nm/s；平均移动距离约 100 nm）和快速长距离运动（约 450 nm/s；平均移动距离约 1,000 nm）19；因此，如果每秒或更长时间才采集一次图像，缓慢短距离运动状态将无法被检测到。然而，频繁成像也会导致荧光探针漂白和光毒性。因此，成像条件需根据具体研究问题进行优化调整。
该方法的局限性
根据所期望的染料不同，该方法可能受限于染料溶解性与注射溶液毒性的相容性。由于异丙醇和乙醇等醇类黏度较低，在针头中难以操作，且似乎会损伤细胞组分并导致胚胎死亡。
该方法也不适用于观察胚胎发育的最初阶段，因为准备胚胎进行显微注射需要30分钟以上。在室温条件下，胚胎的初始细胞周期每个仅持续约10分钟；因此，即使在步骤5.2.3中挑选了一个刚刚受精的卵子，等到胚胎准备好成像时，最初的数个细胞周期已经完成。
使用紫外/蓝光范围的光照具有比长波长光照显著更高的光毒性。在此类条件下（例如，用于追踪自体荧光的卵黄囊泡；图6），必须限制成像时间（导致时间序列缩短）或采用较低的激光功率（导致信噪比降低）。
细胞化之后，从特定位置注入的染料往往难以扩散，因为它们必须穿过许多细胞膜。这限制了在后续发育阶段中的观察区域。
该方法相对于现有/替代方法的重要性
早期胚胎中脂滴及其他含脂细胞器的运动可通过基因编码的荧光蛋白、无标记技术以及引入荧光蛋白（FP）的方法进行可视化观察。其中，荧光蛋白的引入可通过透化卵膜12 或本文所述的显微注射方法实现。
基因编码的荧光蛋白是多功能标记物，其表达水平通常在各个胚胎之间具有高度可重复性。然而，它们的量子产率较低，且比荧光染料（FPs）更容易发生光漂白。通常，这类标记物仅有一种或两种标记形式（例如 GFP 或 mCherry），限制了可同时成像的结构选择。相比之下，荧光染料（FPs）通常具有多种类型；例如，已有多种特异性靶向脂滴的染料，其发射光谱覆盖范围从紫外/蓝光区的 Autodot 到远红光区的 Lipidtox 和 LipidSpot 610。荧光染料还可直接应用于任何感兴趣的菌株，因此无需通过菌株构建来将目标细胞器标记物引入特定突变菌株中。当需要同时标记多个结构时，这一优势尤为显著：无需耗时数代的杂交操作，仅需在一天内将相应的染料混合并同时加入即可完成标记。最后，若需通过药理学抑制手段研究细胞过程，药物和染料可同时加入使用。
无标记方法是检测特定细胞结构的强有力手段。例如，脂滴（LDs）可在早期胚胎中通过三次谐波产生显微镜技术20或飞秒受激拉曼损耗显微镜技术21进行特异性检测。与荧光蛋白（FPs）类似，这些方法可应用于任何遗传背景，并且由于不会引起光漂白，因此有望实现更快的图像采集。然而，这些方法通常仅限于特定细胞器，因而本身不支持多重成像；此外，它们还需要专用的显微镜设备。
向胚胎中引入小分子有两种常用策略。一种是此处采用的显微注射法；另一种是使用化学物质（萜类化合物）处理以增加卵黄膜的通透性。后一种方法12相比显微注射操作更简便，但胚胎间的变异程度较大。此外，在膜通透性增加后，卵黄膜所提供的保护作用被削弱，胚胎本身暴露于外部环境，使其更难维持存活。显微注射对胚胎发育的干扰远小于膜通透性处理。然而，若需同时监测大量胚胎（例如用于药物筛选），则推荐使用膜通透性处理法。若要追踪细胞结构的动态变化，并获得适用于图像分析的可重复图像序列，显微注射则是首选方法。
该方法在特定研究领域中的重要性及潜在应用
该 果蝇 胚胎是研究多种细胞生物学和发育过程的重要模型系统1,5,6用荧光蛋白标记细胞器极大地促进了人们对早期胚胎发育过程、各种细胞器运输机制以及这些运输过程在发育和遗传层面如何被调控的理解。然而，荧光蛋白容易发生光漂白，且构建多个细胞器被不同颜色标记的品系存在技术困难，这些因素限制了该方法的应用。通过显微注射引入荧光蛋白（FPs）可解决上述诸多问题，并可与荧光标记的其他蛋白联合使用。该技术能够在任意遗传背景下对多种细胞器、细胞结构及细胞骨架组分进行成像，从而实现对不同基因型之间的比较分析。 通过 活体成像，从而能够确定突变对多种细胞器运输的影响。
本方案展示了黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎的FP注射方法，但原则上，该方法适用于已建立显微注射技术的任何昆虫卵，包括其他果蝇属（Drosophila）物种、蟋蟀22和蚜虫23。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Pakinee Phromsiri、Brian Jencik、Jinghong (James) Tang和Roger White对本文手稿提出的宝贵意见。感谢Patrick Oakes、Stefano Di Talia和Victoria Deneke分享他们在进行PIV分析方面的专业知识。本研究得到了美国国立卫生研究院基金F31 HD100127（资助M. D. K.）和R01 GM102155（资助M. A. W.）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AUTODO | abcepta | SM1000a | 将脂滴染成紫/蓝色 |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | 将脂滴染成绿色 |
| 干燥剂珠粒 –干燥剂-无水指示性Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| 带透射照明底座的解剖显微镜 SteREO DiscoveryV20 | Zeiss | 4350030000000000 | |
| 双面胶带-永久性双面胶带 | Scotch (3M) | - | 由多家供应商销售 |
| ER-Tracker Green（BODIPY FL 格列本脲） | ThermoFisher | E34251 | 染色内质网/核膜 |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | 即用型 |
| 玻璃毛细管 - 玻璃细管带拉丝 1.0 mm 4 英寸 | World Precision Instruments | TW100F-4 | 必须进行拉制 |
| 玻璃盖玻片 | - | - | 请根据物镜的折射率选购合适的盖玻片 |
| 载玻片 - 双面磨砂预清洁载玻片 | FisherBrand | 12-550-343 | |
| 卤代烃油 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| 卤代烃油 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| 庚烷 更环保的替代品 无水，99% | Sigma-Aldrich | 246654-1L | 根据美国职业安全与健康管理局（OSHA）规定，庚烷被认为具有毒性 |
| 共聚焦显微镜 | Leica | Sp5 | 多种类型的共聚焦显微镜均可使用 |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | 将脂滴染成远红光 |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | 将溶酶体染成红色 |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | 染色线粒体 |
| 针式上样移液器吸头 - 20 µL 微量上样吸头 | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000 新一代微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | 所用参数设置为：加热-470，拉力-70，速度-60，延迟-90，压力-200，斜坡-479（1x1）。这些参数分别对应加热的强度和持续时间、拉力施加的时机以及拉力是否线性施加。在此条件下，一根毛细管可拉制出两根可在尖端形成精细开口的可用微针 |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | 由Spirochrome公司生产；Cytoskeleton Inc.为北美分销商。将微管染成远红光 |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | 将微管染成紫/蓝色 |
参考文献
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