高速视频显微镜分析用于原发性纤毛运动障碍的初诊

摘要

高速视频显微镜分析是一种相对易于操作、快速、经济且在经验丰富的操作者手中具有较高可靠性的工具，可用于原发性纤毛运动障碍的初筛诊断，应成为每个从事重症肺部疾病诊断与治疗的医疗中心的常规配备。

摘要

原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia, PCD）是一种主要以常染色体隐性方式遗传的先天性疾病。该疾病导致纤毛运动异常，进而严重影响黏液纤毛清除功能（mucociliary clearance, MCC）。若未能及时诊断或诊断过晚，患者在后期可发展为支气管扩张，并对肺部造成严重损害。目前大多数用于诊断PCD的方法耗时较长，且需要投入大量经济资源才能建立。高速视频显微分析（high-speed video microscopy analysis, HSVMA）是唯一能够直接观察和分析具有摆动纤毛的活体呼吸道细胞的诊断工具。 体外快速、经济且在操作熟练的情况下作为PCD诊断工具非常可靠。此外，对于某些不存在形态学改变的突变，传统的诊断方法（如透射电子显微镜，TEM）并不适用。

本文描述了采集呼吸道上皮细胞的过程、标本的进一步制备以及高速视频显微分析（HSVMA）的操作流程。我们还介绍了在诊所不具备HSVMA检测设备的情况下，如何通过将刷取的细胞保存在营养培养基中，以确保细胞在运输至检测机构的过程中保持完整且持续摆动。文中还展示了来自动力蛋白臂重链11基因（DNAH11）突变患者的病理性纤毛摆动模式视频，此类病例无法通过透射电镜（TEM）诊断；同时展示了因上呼吸道感染导致HSVMA结果不明确，以及因红细胞重叠导致刷取失败的案例。通过本文，我们希望鼓励所有诊治呼吸系统疾病及罕见肺部疾病的医疗单位，将HSVMA纳入原发性纤毛运动障碍（PCD）的日常诊断流程，或把标本送至具备HSVMA检测能力的专业中心进行分析。

引言

原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种罕见的遗传性遗传病，可导致摆动纤毛运动异常。若未能及时诊断，由于黏液纤毛清除功能（MCC）严重受损，患者在后期将出现严重的肺损伤。过去估计其患病率约为1:4,000至50,000。随着诊断技术的持续进步以及对该疾病认知的提高，关于PCD患病率的最新数据显示其可能远比以往认为的更常见，实际患病率可能约为1:4,000至20,000^1,2。然而，目前PCD患者仍普遍存在漏诊或诊断过晚的情况^1,3。因此，对于出生时即有内脏反位和/或内脏异位、围产期流涕、新生儿呼吸窘迫、鼻塞或喂养困难的婴儿，应怀疑患有PCD。在后期，慢性中耳炎、反复发生的肺炎、鼻窦炎以及因MCC功能受损所导致的持续性典型湿咳是PCD的典型症状，这些症状常伴随支气管扩张和肺功能下降，持续至成年期²。

怀疑患有原发性纤毛运动障碍（PCD）的患者可采用多种诊断工具进行诊断。过去，透射电子显微镜（TEM）一直被视为一线诊断的金标准。然而，多达30%的PCD病例并不表现出异常的超微结构^1,3,4,5,6，因此需要采用不同的诊断方法。目前，越来越多的诊疗中心以及欧洲呼吸学会（ERS）的指南建议将鼻一氧化氮（nNO）检测与高速视频显微分析（HSVMA）联合用于一线诊断^1,7,9,10。HSVMA和nNO也是识别PCD患者最具成本效益的检测手段¹¹。然而，即使将基因检测纳入诊断流程，也必须认识到：目前尚无任何单一检测或联合检测方法能够以100%的确信度完全排除PCD^8,9,10。

在现有的诊断方法中，HSVMA 是唯一一种针对活体、具有纤毛的呼吸道细胞，并评估纤毛摆动模式（CBP）和纤毛摆动频率（CBF）的检测方法。与透射电子显微镜（TEM）相比，HSVMA 的结果通常在检测当天即可获得，而 TEM 的结果可能在样本采集数月后才能出具。HSVMA 可用于所有年龄组，而鼻呼出一氧化氮（nNO）检测需要较高的受试者配合度，通常在5岁以下儿童中难以成功实施¹⁰。在经验丰富的操作者手中，HSVMA 诊断原发性纤毛运动障碍（PCD）的敏感性和特异性分别高达100%和96%¹²。

本文详细描述了HSVMA的逐步操作流程，包括从鼻腔下鼻甲采集带有纤毛的呼吸道细胞、将采集的细胞保存在细胞营养培养基中以运输至检测地点，以及通过显微视频分析确定纤毛摆动频率（CBF）和纤毛摆动模式（CBP）的过程。此外，还展示了一些来自患者的视频片段，用以比较正常的纤毛摆动模式和纤毛摆动频率与异常纤毛功能之间的差异（视频 3、视频 4、视频 5、视频 6、视频 7 和 视频 8）。

方案

伦理声明：

本研究经当地伦理委员会批准（编号：69/2017），并遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。

1. 呼吸道上皮细胞的采集与运输

1. 刷取
   1. 刷取前，给予患者为期两周的口服阿莫西林-克拉维酸，以清除干扰纤毛功能的生物膜。确保在操作前2天停止使用抗生素。
   2. 为减少黏液物质在刷取的上皮细胞条带上的覆盖，请患者彻底擤鼻。对于年幼患儿，请家长协助其擤鼻。
   3. 进行刷取时，使用直径为0.6 mm的牙间刷（见材料表）。用一只手固定患者头部，另一只手对双侧鼻腔的下鼻甲进行刷取，以收集足够的上皮细胞条带。
      注意：将牙间刷深入下鼻甲下方时通常会遇到轻微阻力。鼻腔刷取操作应快速旋转并挑动约2秒。刷取时间过长或过于剧烈可能导致严重的上皮损伤及继发性鼻出血。
   4. 若因怀疑原发性纤毛运动障碍（PCD）以外的原因需行支气管镜检查，可在支气管镜过程中通过刷取隆突或支气管上皮，或通过活检方式采集样本¹³。
   5. 将采集到的细胞条带放入含有细胞营养液——杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的1.5 mL微量离心管中。
      注意：通过轻轻抖动并旋转刷子接触管壁，通常可使上皮细胞条带更易从刷子上脱落。
   6. 盖紧微量离心管盖子，并将其靠近光源。轻轻振荡试管，观察是否有采集到的细胞条带和聚集体。
2. 样本运输
   1. 将微量离心管放入密封良好的聚苯乙烯盒中，确保管盖已拧紧，并将试管在盒内固定稳妥。
   2. 加入冷袋；但应避免样本冻结。
      注意：样本在检测前的最佳保存温度约为4–8 °C（39.2–46.4 °F）。
   3. 确保保存的样本在接下来的24小时内完成分析。
      注意：在这些实验中，刷取与高速视频显微分析（HSVMA）之间的平均时间为3小时。

2. 高速视频显微分析（HSVMA）

1. 样本的视频显微镜观察
   1. 收到含有样本的微量离心管后，将其升温至 37 °C (98.6 °F)，以模拟最佳的类似体内（in vivo）环境。
   2. 若显微镜配备加热装置，可将离心管置于显微镜罩内并在此处加热；也可使用培养箱对样本进行升温。
   3. 启动连接在计算机上的摄像机及视频采集软件。
   4. 使用移液器吸取少量样本，滴加两滴至比色皿或玻璃底培养皿中（参见材料表）。用盖子封住比色皿或培养皿，并将其置于显微镜下。
   5. 为评估样本，应使用配备冷光源和高速摄像机（录像速度至少为 200 帧/秒）的微分干涉相差显微镜。使用 100 倍油浸物镜，并在光学镜片表面滴加一滴浸油。
      注：推荐使用物镜从下方接近样本的显微镜。
   6. 用显微镜物镜接近培养皿底部，寻找不含红细胞且黏液含量较低的细胞簇。找到具有代表性的感兴趣区域（ROI）后，聚焦于纤毛摆动幅度最大的一组纤毛，并录制一段视频序列。从侧面和上方分别录制具有摆动纤毛的细胞图像。随后，寻找另一代表性细胞簇并重复录制过程。
      注：纤毛覆盖的细胞必须在 1,000 倍放大倍数下进行观察，纤毛摆动应使用数字高速视频（DHSV）摄像机以每秒 200 帧或更高帧率（本方案中为 256 帧/秒）进行录制。由于录制视频片段所获得的数据会占用大量硬盘空间，建议使用外接固态硬盘（SSD）。
2. 视频序列分析
   1. 为测定纤毛摆动频率（CBF）和纤毛摆动模式（CBP），需逐帧回放视频片段。
   2. 为测定纤毛摆动频率（CBF），将视频帧率调至 15 帧/秒的慢动作模式，并计数连续 10 次摆动。
   3. 记录完成 10 次摆动周期所经过的帧数，并将结果代入公式（1）。通过计算所有记录的纤毛摆动周期的平均值来确定频率，并将结果与对应年龄的参考值进行比较（参见表 1）¹⁴。
      （1）
      其中 X 表示 10 次摆动周期内经过的帧数。
   4. 为评估纤毛摆动模式（CBP），观察纤毛摆动是否达到完整范围（参见图 1）且是否同步。应由两名独立操作人员分别评估 CBP，以避免选择偏倚。
   5. 报告高速视频显微分析（HSVMA）结果，判断其与原发性纤毛运动障碍（PCD）是否相符、不符或无法确定。

结果

视频 1 和 视频 2 显示一个正常对照，其中 CBF 和 CBP 处于正常范围内（参见 图1). 视频 3, 视频 4, 视频 5，以及 视频 6 代表两名具有同源突变的PCD患者的病例 DNAH11 基因（c.2341G > A；p. Glu781Lys³这些代表性视频被选中是因为突变的表型在 DNAH11 基因值得注意，因为其缺乏形态学改变，无法通过透射电子显微镜（TEM）进行诊断^3,4,5.

讨论

本文结合一线诊断方法，阐述并讨论了利用高速视频显微分析（HSVMA）对原发性纤毛运动障碍（PCD）进行诊断的过程。尽管HSVMA方法相对易于建立、成本效益高¹¹，且在经验丰富的操作者手中具有可靠性¹²，但它并非没有局限性的诊断手段。纤毛摆动频率（CBF）和摆动模式（CBP）异常可能由继发性感染引起，导致支气管呼吸上皮发生炎症¹⁵；出于同样原因，吸烟个体也可能出现异常的纤毛摆动频率^16,17。此外，在确诊PCD之前，应首先排除囊性纤维化。在判定患者样本结果符合PCD之前，异常结果需通过两个独立采集的样本加以确认，即需要重新进行刷取取样，并对CBF和CBP重新分析。这一过程可能具有挑战性，尤其是在儿童中。因此，部分研究者建议将首次刷取获得的上皮细胞进行培养，以避免重复刷取操作^9,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿莫西林-克拉维酸	Orion Oyj		40 mg/kg，分2次/日给药；成人剂量为875/125 mg，1片×2次/日
相机软件	Hamamatsu		HCI Image
冷藏包	任意品牌		用于样品保存与运输
微分干涉显微镜	Carl Zeiss		倒置式细胞观察显微镜
数字高速摄像机	Hamamatsu		Orca Flash 4.0，数码相机型号 C11440
Dulbecco´s 改良伊格尔培养基	Thermo Fisher	10565018	基础细胞培养基
Eppendorf 管	Eppendorf	30120086	1.5 mL 管
玻璃底微型培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	显微镜用比色皿
加热装置	Carl Zeiss/PeCon	810-450001	Carl Zeiss 培养组件，配备 PeCon TempModule S1 温度控制系统
0.6 mm 牙间刷	Doft	872267	带长金属丝的牙间刷，配有可重复使用的手柄和密封盖，包装于拉链袋中
物镜	Carl Zeiss		100x/1.46，α Plan-Apochromat DIC 物镜
带盖小型聚苯乙烯盒	任意品牌		用于运输