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方法文章

使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

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DOI：

10.3791/63308

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2021年12月1日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了通过切断的神经将荧光钙染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。此外，还介绍了一种利用共聚焦显微镜记录外周神经末梢快速钙瞬变的独特方法。

摘要

估算突触前钙水平是研究突触传递的关键任务，因为钙离子进入突触前细胞会触发一系列事件，最终导致神经递质的释放。此外，突触前钙水平的变化可调节多种细胞内蛋白质的活性，并在突触可塑性中发挥重要作用。研究钙信号传导对于探索神经退行性疾病的治疗方法也具有重要意义。神经肌肉接头是研究突触可塑性的理想模型，因其仅含一种类型的神经递质。本文描述了一种通过切断的神经束将钙敏感性染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。该方法可用于估算与细胞内钙变化相关的所有参数，例如基础钙水平和钙瞬变。由于钙离子从细胞外流入神经末梢以及其与钙敏感性染料的结合/解离过程发生在数毫秒的时间范围内，因此需要高速成像系统来记录这些事件。尽管高速相机常用于记录快速的钙变化，但其图像分辨率较低。本文所介绍的钙瞬变记录方案利用共聚焦显微镜，可实现极佳的空间-时间分辨率。

引言

在可兴奋细胞中测量快速钙波的问题，是研究中枢和周围神经系统信号传递最重要且最具挑战性的方面之一。钙离子在触发神经递质释放、突触可塑性以及调控多种细胞内蛋白质活性中发挥着重要作用1,2,3,4,5。研究钙信号对于探索治疗神经退行性疾病的方法也具有重要意义6。为了测量钙离子水平的变化，通常使用荧光钙敏感性染料，并分析其荧光强度的变化7,8,9。

将钙染料载入细胞可通过多种方式实现。目前主要使用细胞膜通透性染料10,11。然而，这种方法不仅难以控制细胞内染料的浓度，而且难以选择特定目标细胞进行染料加载。此外，该方法不适用于研究外周神经末梢，因为染料会进入突触后细胞。相比之下，细胞膜不通透性染料更适合此类实验。在这种情况下，染料可通过显微注射或膜片钳电极导入细胞12,13,14。此外，还有一种通过神经断端加载染料的方法。后一种方法特别适用于神经肌肉接头的制备15,16,17,18,19,20，可实现仅对感兴趣细胞进行染色。尽管该方法无法精确评估目标细胞内染料的浓度，但可通过比较细胞在已知钙浓度溶液中静息状态下的荧光强度，大致估算染料浓度21。本研究介绍了一种将该方法改进后应用于哺乳动物突触的研究方案。

动作电位去极化阶段的钙离子内流是一个快速过程，尤其是在神经肌肉接头处；因此，要记录这一过程，需要使用适当的设备1。最近一项使用电压敏感型荧光染料的研究表明，小鼠外周突触中动作电位的持续时间约为 300 µs22。利用钙离子敏感染料在蛙类外周突触中检测到的钙瞬变持续时间更长：上升时间约为 2–6 ms，衰减时间约为 30–90 ms，具体数值取决于所使用的钙染料23,24。为了借助荧光染料测量快速过程，通常使用配备快速且高灵敏度 CCD 成像阵列的 CCD 或 CMOS 相机。然而，这些相机存在分辨率较低的缺点，其分辨率受限于成像阵列感光单元的尺寸25,26,27,28。目前最快速且具备足够灵敏度以记录细胞在低频刺激下动作电位和钙瞬变的相机，其扫描频率为 2,000 Hz，成像阵列为 80 × 80 像素29。为了获得更高空间分辨率的信号，通常采用共聚焦显微镜，特别是在需要评估信号的某些三维变化时尤为适用30,31,32。但需要注意的是，共聚焦显微镜在线扫描模式下具有较高的扫描速度，但在构建空间图像时，对快速过程的记录速度仍存在显著限制33。目前已有基于旋转尼普科夫盘（狭缝扫描显微镜）和多点阵列扫描器的共聚焦显微镜，其扫描速度更高。然而，它们在共聚焦图像滤波方面仍逊于传统共聚焦显微镜（例如，尼普科夫盘显微镜存在针孔串扰问题）32,34,35。采用共振扫描的共聚焦成像也可提供高时间分辨率测量所需的高时空分辨率36。但需注意，使用共振扫描器在高扫描速度下记录微弱荧光信号时，需要配备高灵敏度探测器，例如混合探测器36。

本文介绍了一种在保持空间分辨率的同时提高激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）记录信号时间分辨率的方法37。该方法是在先前描述的方法基础上进一步发展而来，并已转移应用于LSCM平台38,39,40。该方法无需更改显微镜硬件，而是基于一种算法，通过相对于刺激时刻引入时间偏移来记录周期性诱发的荧光信号。

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方案

实验在离体神经-肌肉标本上进行 耳上提长肌 （来自 BALB/c 小鼠（20–23 g，2–3 月龄）的 LAL）41实验操作遵循喀山联邦大学和喀山医科大学关于实验动物使用指南以及《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》的规定。实验方案符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的要求，并经喀山医科大学伦理委员会批准。

1. 林格氏液与灌流液的制备

  1. 通过混合以下成分配制适用于哺乳动物肌肉的任氏液：NaCl (137 mM)、KCl (5 mM)、CaCl2 (2 mM)、MgCl2 (1 mM)、NaH2PO4 (1 mM)、NaHCO3 (11.9 mM) 和葡萄糖 (11 mM)。用 95% O2 和 5% CO2 混合气体对溶液进行通气，并在必要时通过添加 HCl/NaOH 将 pH 调整至 7.2–7.4。
  2. 配制染料负载溶液。
    1. 配制 pH 为 7.2–7.4 的 HEPES (10 mM) 溶液。市售染料每瓶 500 µg/500 µL。将染料溶解于 14 µL HEPES 溶液中，得到浓度为 30 mM 的染料溶液。充分震荡并离心至完全溶解。
    2. 用 HEPES 溶液将 Ca2+ 指示剂溶液稀释至 1 mM 浓度。保存于冷冻室（-20 °C），避免光照。

2. 染料加载步骤

注意：染料加载步骤按照通过神经残端加载的方案进行，该方案改编自先前发表的方案19,42,43,44,45,46。

  1. 根据先前已发表的方案47,48中所述的制备方法，解剖 LAL 肌肉。
    1. 将组织轻微拉伸（不超过初始长度的30%），用细的不锈钢针固定在涂有弹性体的培养皿中，并加入任氏液，直至肌肉完全浸没。
      注意：培养皿已按照制造商说明预先填充弹性体（见材料表）。
  2. 制备填充移液管
    1. 使用微移液管拉制仪（见材料表），制备尖端尽可能细且锐利的微移液管，用于细胞内记录。使用无内丝的毛细管（外径1.5 mm，内径0.86 或 1.10 mm）。
    2. 用磨料在锥形部分划痕后，折断微移液管尖端，使开口直径约为100 µm。通过灼烧抛光使尖端内径从>80 µm缩小至12–13 µm。将一段硅胶管连接至填充移液管一端，另一端连接注射器（不带针头）。
  3. 在体视显微镜下，找到神经干分出独立神经分支的位置。用石蜡将带有连接管和注射器的填充移液管固定于培养皿上，移动移液管尖端，使其位于神经上方。
  4. 使用精细剪刀，在靠近肌纤维处剪断神经，保留约1 mm长的小段神经残端。轻柔地将神经残端连同部分任氏液一起吸入填充移液管尖端，避免夹捏。随后将硅胶管从填充移液管上移除。
  5. 使用带有长丝的注射器吸取一定量的染料负载溶液（约0.3 µL）。该体积对应丝长大约为3 cm。
    注意：最初需使用酒精灯或气体燃烧器加热拉制10 µL移液管尖端制成所需长度的丝。
  6. 将带有负载溶液的丝尖端轻轻插入填充移液管中。将混合液直接释放至神经残端上。将标本置于室温避光条件下孵育30分钟。
  7. 之后，用新鲜任氏液冲洗标本，并将其置于盛有50 mL（或更多）任氏液的玻璃烧杯中，在25 °C下孵育最多2小时（标本必须完全浸没于溶液中）。在此期间，染料将到达突触部位。

3. 使用共聚焦显微镜进行视频采集

注意：钙瞬变的记录使用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行（参见材料表）。为了记录快速的钙瞬变，采用了一种原创性方案，可实现具有足够空间和时间分辨率的信号采集。该方法已在Arkhipov等人的出版物中进行了详细描述37。显微镜配备了一个20倍水浸物镜（1.00 数值孔径）。488 nm激光线衰减至10%强度，发射荧光收集范围为503至558 nm。

  1. 将制备好的样品放入涂有硅胶弹性体的实验腔室中，用一组钢制微针将其固定并轻微拉伸。用任氏液对样品进行充分冲洗。
    注意：一种由有机玻璃制成的简易自制灌流实验腔室，腔室底部覆盖有弹性体（按制造商说明书制备；参见 材料表）使用。该室带有一个溶液供给管，溶液被泵出 通过 安装在磁性支架上的注射器针头（参见 材料清单）。作为实验腔室，可以使用培养皿（与用于孵育标本的培养皿相同），但需连接供液管和吸液管。
  2. 安装用于刺激神经的吸引电极。
    注意：电极的构建方法与Kazakov等人于2015年发表的论文中所述相似49将电极用石蜡固定在浴槽旁。移动电极尖端靠近神经残端，并将其吸入电极内。
  3. 将孵育腔室安装到显微镜载物台上，并将进液和出液接头放入腔室内。
  4. 使用简单的重力驱动灌流系统进行灌流。开启灌流吸泵以去除多余的溶液。
  5. 将刺激用的吸吮电极插入电刺激器中，并确保刺激后出现肌肉收缩。有关刺激条件和记录，请参见第3.9–3.12节。
  6. 用含 d-tubocurarine 的任氏液灌注灌流系统10 µM).
    注意：该溶液有助于防止肌肉收缩。作用于突触后膜烟碱型乙酰胆碱受体的 D-箭毒碱或 α-银环蛇毒素特异性阻断剂，可完全或部分抑制肌肉收缩。50此外，为防止肌肉收缩，可使用特定的突触后钠通道阻断剂，如 µ-芋螺毒素 GIIIB 可被用于51.
  7. 打开灌流吸引泵，开始用含 d-筒箭毒碱的任氏液对制备样本进行灌流。
  8. 在LSCM软件中按如下设置成像参数。
    1. 在 LSCM 软件（LAS AF；参见 材料清单），选择 电生理学.
      注意：在此模式下，当在特定时间点捕获图像时，通过触发盒向刺激器发送同步脉冲，从而在标本中诱发动作电位的产生。图1；刺激器单元）
    2. 选择 采集模式使用显微镜同步脉冲触发刺激器时，在 工作 菜单设置，选择 触发 设置。设置 帧触发输出 字段到 out1 通道
    3. 使用以下设置： 扫描模式：XYT， 扫描频率：1400 Hz， 变焦倍数: 6.1, 针孔：完全打开。确保已开启顺序透射双向X模式。
    4. 将形成一帧的最短时间设为52 ms，原始视频中采集的帧数设为20帧。
      注意：这些设置允许以 128 × 128 像素的分辨率进行成像，每 52 ms 采集一帧图像。
    5. 将氩激光器的激发波长设为488 nm，输出功率为8%。

用于光学激发的显微系统示意图；包含光谱分析装置和数据采集系统。
图1：实验装置示意图。1. 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）。2. LSCM的同步模块（触发盒）。3. 刺激器。4. 隔离单元。5. 生物样本。6. 用于神经电刺激的吸引电极。7. 灌流系统（7a：灌流液储液瓶，7b：滴管，7c：流量调节器，7d：真空抽滤瓶）。箭头指示同步脉冲传播方向。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 按下实时模式按钮，切换至实时模式，以便预览被染料标记的神经末梢。

神经元分支的荧光显微图像，显示细胞结构，0-75μm比例尺。
图 2：小鼠神经及其末梢负载钙离子（Ca2+）指示剂。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 刺激单元
    注意：在本研究中，所使用的刺激器见于 Land 等人发表的文章中52 用于设置刺激的时间参数 通过 MatLab 软件
    1. 新建一个文件，将上述文章中的代码粘贴到 MatLab 代码窗口中，并保存文件。点击 运行，此时会出现一个包含刺激参数的窗口。设置刺激的延迟时间和持续时间。
      注意：延迟时间决定了重构荧光信号的时间分辨率。持续时间为0.2 ms的电脉冲被延迟后，送入隔离单元。该单元用于调节刺激脉冲的幅度和极性，并将生物样本与记录设备进行电气隔离。
    2. 为刺激神经，选择超最大刺激强度的刺激脉冲幅度（比激活全部神经纤维所需的最大刺激强度高25%–50%）。
      注意：所介绍的方法基于一种特殊算法，用于在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）上以最小化扫描周期的方式记录单个快速荧光信号。在该算法的每一步中，所记录的荧光信号相对于前一次信号的时间偏移量均短于显微镜的扫描周期。时间偏移量的大小决定了所需信号的时间分辨率。算法中的步数（即偏移次数）取决于所需的时间分辨率和原始时间分辨率。采用该记录方法时，标本的刺激频率为0.25 Hz。
  2. 在实时模式下，搜索感兴趣区域并获得最佳焦距。运行数据采集软件。
  3. 将刺激器的延迟相对于先前值减少 2 ms，并运行数据采集软件。
  4. 重复步骤3.11共26次，以获取26个序列，每个序列相对于前一个序列偏移2 ms。

4. 视频处理

注意：通过共聚焦显微镜获取的一系列视频图像使用免费软件 LAS X 以 TIFF 格式导出（参见材料表）。该系列图像被分割为单帧并导出至一个文件夹。为了生成具有更高时间分辨率的图像序列，使用了 ImageJ 软件，该软件具有开放的初始代码，可用于数据的分析与处理。信号处理的算法在图3中以示意图形式表示。

用于时间模式分析的循环神经网络示意图及时间序列图。
图3：从时间分辨率较低的原始视频文件（每帧52 ms）合成高分辨率视频文件（每帧2 ms）的方案示意图。原始视频文件及其对应的信号以黑色、品红色和绿色表示。合成后的视频文件及生成的信号以红色表示。右侧的示意图按行显示共聚焦显微镜获取的视频图像。左侧为所选感兴趣区域（ROI）对应的荧光变化信号。最上方的一行根据该方案逐帧生成自接收到的帧。最终得到的视频图像包含完整的帧序列，帧间延迟时间为2 ms，而非52 ms。每一行对应刺激信号的偏移量为 (n - 1) * t，其中 t 为时间偏移量（2 ms），n 为偏移迭代次数。k 表示原始视频文件（第2–4行）中的帧数，取决于记录信号的持续时间。例如，若需记录持续时间为1 s的信号，则需选择 k = 20（52 ms × 20 = 1040 ms）。t0 表示刺激前所需的延迟时间。为计算偏移迭代次数 n，需将原始帧间时间分辨率（52 ms）除以所需的时间分辨率（2 ms）。本例中，n = 26，对应26次记录扫描。经过上述处理后，最终获得一个包含 n × k = 520 帧的视频图像。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 运行 LAS X 软件，打开实验过程中创建的项目。点击导出，然后点击另存为，将帧以 .tiff 格式保存到目标文件夹中。
  2. 运行 ImageJ 软件，点击文件 > 导入 > 图像序列。
  3. 在打开图像序列窗口中，选择目标文件夹并打开第一帧。
  4. 在序列选项窗口的起始图像字段中，将第一帧的帧号设为 1。在增量字段中，设置数值等于初始信号记录中的帧数（本例中为 20），然后点击确定。
  5. 若要将拼接后的第一帧生成的文件保存到单独的文件夹中，请点击文件 > 保存 > 文件夹。
  6. 对接下来的 19 个帧重复步骤 4.3–4.5。在序列选项窗口中，在起始图像字段中设置相应的帧编号。
  7. 为生成完整高时间分辨率视频，需将所有帧拼接在一起。操作方法为：点击文件 > 导入 > 图像序列，并在起始图像和增量字段中均设置为 1。结果即为具有更高时间分辨率的最终视频。将文件保存为 .tiff 或其他合适格式。

5. 视频分析

注意：在 ImageJ 中选择感兴趣区域（ROI）和背景。从 ROI 中减去背景。数据以 (ΔF / F0 - 1) * 100% 的比值表示，其中 F0 为静息状态下的荧光强度，ΔF 为刺激期间的荧光强度。

  1. 点击 图像 > 堆叠 > 工具 > 堆栈分选器然后，单击 分析 > 工具 > ROI 管理器.
  2. 将第4.7步中保存的.tiff文件拖放到ImageJ窗口中。展开图像以获得更好的视野。为改善图像可视化效果，点击 图像 > 调整 > 亮度/对比度 > 自动此步骤不会影响数据。
  3. 通过绘制感兴趣区域（ROI）将背景设置在接近神经末梢的位置。将其添加至ROI管理器。通过点击计算背景 更多 > 多参数测量复制平均值，粘贴至电子表格程序中，并计算其平均值。
  4. 通过点击从图像序列中减去计算得到的平均值 过程 > 主要 > 减去. 输入数值。
  5. 在神经末梢周围绘制 ROI 通过 多边形线。将其添加到 ROI 管理器中。
  6. 测量神经末梢的强度：单击 更多 > 多参数测量. 复制平均值并粘贴到电子表格程序中。
  7. 计算信号的平均偏移量。
    注意：根据刺激前的延迟时间使用相应的点。此步骤建立 F0 将在后续计算中使用的数值。
  8. 将信号值除以平均偏移值。
    注意：此步骤之后，所选 ROI 的幅值信号中不再包含背景和原始荧光的贡献。
  9. 将步骤5.8中获得的数值减去1，然后乘以100%。
  10. 绘制 Ca 的图2+- 瞬态并计算其幅值。

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结果

根据所述技术用染料孵育标本后，位于神经残端附近的大多数突触均显示出足够的荧光强度（见图2）。在用染料孵育标本并应用所述记录与图像处理方法后，获得了具备理想空间与时间分辨率的钙瞬变信号（见图4）。通过所提出的方法已成功恢复出钙瞬变信号（见图3）。

还分析了恢复信号的幅度和时间参数。平均数据见表1。

荧光衰减图，ΔF/F0 与时间的关系；平均振幅、上升时间、衰减时间；数据分析。

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讨论

钙成像加载方法2+本文介绍了一种通过神经残端将对钙离子敏感的染料导入小鼠神经末梢，并利用共聚焦显微镜记录快速钙瞬变的方法。通过实施该染料加载方法，靠近神经残端的大多数突触均具有足够的荧光水平，能够实现对运动神经在低频刺激下钙离子进入神经末梢过程的记录。

与先前通过神经断端加载钙染料的方案不同，本方案专为哺乳动物突触设计。以往在冷血动物标本中使用的方法需要过夜孵育43。而本方案中，染料孵育时间仅需2小时。根据切断后残留神经节段的长度、染料加载速度以及被加载末梢的数量，效果可能有所差异。对于更短的神经断端，甚至可进一步缩短在染料溶液中的孵育时间。类似的方法也已被用于果蝇突触的染料加载18,19。此外，肌肉孵育过程中将温度略微升高至室温以上，有助于染料沿神经扩散，从而进一步缩短孵育时间。因此，当前的染料加载方法适用于不能耐受长时间孵育的哺乳动物突触。选择合适的实验标本至关重要。LAL肌肉非常适合该方法，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作的荧光研究得到了俄罗斯科学基金会资助项目（项目编号：19-15-00329）的财政支持。该方法的开发获得了俄罗斯科学院喀山科学中心联邦研究中心政府任务拨款（АААА-А18-118022790083-9）的资助。本研究利用了联邦研究中心的设备开展。 "俄罗斯科学院喀山科学中心"作者感谢 Victor I. Ilyin 博士对本文稿的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
毛细玻璃管英国克拉克电磁医学仪器公司GC150-10
共聚焦与多光子显微镜系统 Leica TCS SP5 MP徕卡显微系统公司，德国海德堡
Flaming/Brown 微型移液器拉制仪 P 97Sutter Instrument，美国P-97
流量调节器KD Medical GmbH 医院产品，德国KD REG带流量调节器的一次性输液器
HEPESSigma-Aldrich，美国H0887100 mL
照明系统 Leica CLS 150X德国徕卡显微系统公司
ImageJ美国国立卫生研究院http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF 软件徕卡显微系统公司，德国海德堡
Las X 软件徕卡显微系统公司，德国海德堡https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
带吸液管的磁力架BIOSCIENCE TOOLS，美国MTH-S
Microspin FV 2400拉脱维亚，BiosanBS-010201-AAA
微型固定针加拿大 Fine Science Tools 公司26002-20
Multi-spin MSC 3000拉脱维亚，BiosanBS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 五钾盐美国Molecular Probes公司O6806500 μg
移液器Biohit，俄罗斯7202100.5-10 µL
移液器吸头中国台湾，俄罗斯78134910 µL
塑泥本地生产者
一次性皮下注射针头Bbraun100 Sterican0.4×40 mm
电子表格程序微软，美国Microsoft Office Excel
体视显微镜，Leica M80德国徕卡显微系统公司
吸电极Kazakov A. 用于生物样本电刺激的简易吸电极 / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov 等 // 国际科研杂志 - 2015年 - 第9期（总第40期）第3部分 - 第13-16页http://research-journal.org/biology/用于生物对象电刺激的毛细管吸收电极/
Sylgard 184 弹性体美国道康宁公司
注射器本地生产者0.5 mL
注射器本地生产者60 mL

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