分析编码人类α突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

在阿尔茨海默病之后，帕金森病是全球第二大最常见的神经退行性疾病。在帕金森病中受影响的原代神经元是黑纹体通路的神经元，其产生多巴胺并控制自主运动。因此，与这种疾病相关的最典型症状是运动障碍。这种病理学还涉及大脑中蛋白质聚集体的沉积，其主要由α突触核蛋白（αSyn）¹组成，这是一种与突触前末端相关的胞质蛋白。有证据表明，αSyn的致病性包涵体的产生是由错误折叠或该蛋白²的一些翻译后修饰引发的。

值得注意的是，αSyn病理学与人类帕金森病和动物模型^3，4中黑质胸腺体通路的多巴胺能神经元的丧失之间建立了密切的关系。了解αSyn聚集体是如何产生的以及它们如何诱导神经元死亡是该领域的一个重大挑战。越来越多的研究表明，通过增加氧化应激，线粒体功能障碍是产生αSyn聚集体²的主要原因之一。事实上，与帕金森病风险相关的几个基因编码参与线粒体功能，形态学和动力学^{的蛋白质5，6}。此外，溶酶体功能障碍，其导致功能失调的线粒体积累和错误折叠的αSyn构成了促进αSyn聚集体⁷产生的另一重大事件。

新兴的证据表明，一旦αSyn聚集体沉积在大脑中，这些致病蛋白就会刺激小胶质细胞上的 Toll样受体（TLR），从而触发小胶质细胞活化和黑质（SN）中的初始炎症环境^8，9。此外，有证据表明，αSyn聚集体被抗原呈递细胞捕获并呈递给T细胞，诱导αSyn^10，11特有的适应性免疫应答。这些αSyn特异性T细胞随后浸润大脑并被活化的小胶质细胞重新刺激，从而促进引起神经元死亡的神经毒性因子的分泌^9，10。有趣的是，几条证据表明，αSyn聚集体首先在肠神经系统中产生，然后通过迷走神经运输到脑干¹²。

帕金森病的几种动物模型已被使用多年，包括由神经毒性物质（即6-羟基多巴胺，百草枯，鱼藤酮，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）和涉及遗传疾病的动物模型（即突变α突触核蛋白，突变的富含亮氨酸的重复激酶2）¹³.尽管涉及神经毒素诱导的神经变性复制帕金森病某些方面的模型，但没有一个概括了该疾病的所有基本方面，或者不是进行性的¹³。另一方面，尽管遗传小鼠模型涉及富含亮氨酸重复激酶2的突变版本，α突触核蛋白的突变版本或人类野生型α突触核蛋白的过表达导致运动障碍，并且在某些情况下还导致突触核蛋白病的发展，但它们不会再现黑质多巴胺能神经元的显着神经变性，这是帕金森病¹³的一个重要方面^，14.第三种神经变性动物模型已经设法满足了帕金森病的大多数基本方面，即编码人类α突触核蛋白（AAV-hαSyn）的腺相关病毒载体（AAV）的立体定位递送^14，15。重要的是，AAV允许具有高疗效的神经元转导，并且长期存在于哺乳动物的成年大脑中。此外，SN中AAV-hαSyn的立体定位递送已被证明可以重现该疾病的许多基本方面，包括αSyn病理学，小胶质细胞活化，神经变性和运动障碍^{16，17，18，19，20}。本研究分析了病毒载体的剂量和病毒载体递送后的时间如何影响黑质胸状体通路中hαSyn表达，神经变性和神经炎症的程度，以及SN中hαSyn的单侧立体定位递送小鼠模型中的运动损伤程度。

所有研究都是在第8版《实验动物护理和使用指南》下进行的。实验方案由IACUC在Fundaciión Ciencia & Vida（生命科学基金会）批准，包括涉及麻醉，疼痛，痛苦和安乐死的实验方案（许可证号P-035 / 2022）。

1. 立体定向手术

1. 手术准备（约1小时）
   1. 为了保持无菌环境，在整个手术过程中穿戴适当的手术服，包括鞋套，外科口罩，卫生屏障，手套和手术帽。
   2. 在小鼠和所有手术材料上喷洒70%乙醇以维持无菌环境。
   3. 为了诱导镇痛，每12^小时 21次皮下注射卡洛芬5mg / kg（s.c.），从手术前1小时开始，持续到手术后3天。
   4. 为了麻醉小鼠，将动物置于诱导室中。以0.5%的速率打开异氟醚流量，然后在大约5分钟内缓慢增加至5%，直到小鼠失去其矫正反射²²。
   5. 将动物从诱导室中取出。立即将动物转移到具有适当大小的鼻锥的非再呼吸回路中。在整个手术过程中用异氟醚1%维持小鼠麻醉。
   6. 通过捏住鼠标的尾巴和爪子来确认鼠标完全麻醉。当鼠标对捏尾巴和爪子没有反应时，这意味着鼠标完全麻醉了。
   7. 用剪刀剃掉老鼠的头。使用含有2%氯己定的棉签清洁小鼠的皮肤，并去除所有毛发。
   8. 将鼠标的头部固定在立体定位框架中。
   9. 使用棉签将角膜保护剂放在小鼠双眼中。为了防止其他啮齿动物的压力诱导，避免在手术室²³中存在任何其他小鼠。
2. 手术（约30分钟）
   1. 用三轮2%氯己定，然后用70%乙醇清洁小鼠头部。使用手术材料暴露颅骨，并用钻头在以下坐标处形成一个薄孔:前后-2.8毫米，中外侧1.4毫米，相对于内侧线。
   2. 将10μL注射器的针头放入孔中，并将针头缓慢移动到大脑内，直到相对于硬脑膜^{24到达-7.2mm}背侧。
   3. 将针头留在最终位置2分钟，让组织稍微沉降，然后以0.2μL / 30 s的速率将1μLAAV5-CBA-hαSyn（AAV-hαSyn），AAV5-CBA-eGFP（AAV-GFP）或载体（pH 7.4的PBS;假手术）注射到黑质中。
   4. 在递送病毒载体后将针头保持在相同位置5分钟，然后缓慢将其取出。
3. 术后（约5分钟）
   1. 使用无菌丝编织的不可吸收缝合线闭合伤口。
   2. 将鼠标放在预热的家庭笼子中，将其放在电加热床垫（25°C）上。
      注意:小鼠必须单独保持在家庭笼子里，直到它能够无困难地行走并且伤口愈合。

2. 使用光束测试确定电机性能

1. 训练（每只鼠标约15分钟）
   1. 立体定向手术后十二周，使用²⁵之前描述的简化版本的梁测试评估运动性能。为此，请使用长度为 25 厘米、宽度为 3 厘米的水平横梁。梁表面必须覆盖有金属网格，正方形为1厘米，并在梁上方1厘米处升高。
   2. 拍摄一段视频，鼠标从横梁的一端穿过网格面光束，到达家笼所在的另一端。在确定运动性能之前，训练小鼠2天。
   3. 在第一天，训练鼠标在没有网格的情况下穿过光束五次。
   4. 第二天，训练鼠标在网格存在的情况下穿过光束五次。
2. 测试（每只鼠标约5分钟）
   1. 第三天，评估电机性能。为此，请通过以慢动作模式观看视频来量化左爪或右爪分别执行的错误数量。
      注意:错误被定义为当爪子没有正确踩到网格上，因此在网格的侧面或网格与梁表面之间变得可见时。

3. 组织处理

1. 经心灌注（每只小鼠约15分钟）
   1. 为了麻醉小鼠，使用1mL注射器和27G^针头腹膜内注射氯胺酮（80mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的混合物（ip）。
   2. 一旦小鼠完全麻醉（确认如步骤1.1.6.所示），用手术材料打开胸部并暴露心脏。
   3. 然后，将一根 21 G 针（使用钻头使尖端平坦）插入心脏的左心室。
   4. 通过将针头连接到管道上，使用蠕动泵以9.5 mL / min的速率灌注50 mL PBS（pH 7.4）。
2. 固定和冷冻保护大脑（每个大脑约10分钟）
   1. 使用剪刀和镊子去除大脑，然后在4°C下浸入5mL 4%多聚甲醛在PBS（pH 7.4）中24小时来固定它。
   2. 之后，将固定的大脑置于15mL的30%蔗糖中，在4°C下放置48小时。
   3. 然后，将大脑放入4 mL冷冻保护溶液（PBS中的20%甘油和2%DMSO）中，并将大脑保存在-80°C或下一步中立即使用。
3. 获取脑切片（每个大脑约20分钟）。
   注意:确保将大脑放置在冷冻仪的适当位置以进行冠状切口。
   1. 为了获得SN切片，将大脑切成40μm厚的部分，从−2.92 mm开始，在−3.64 mm²⁴处完成。
   2. 按照前面描述的前后顺序，在24孔板的孔（含有1mL冷冻保护溶液）中收获每片，如^{前面所述25，27，28}。
   3. 要在SN中进行免疫组织化学（第4节）和免疫荧光分析（第5节），请选择以均匀间隔（120μm）采集的六个冠状SN切片，其覆盖细胞核的整个Rostrocaudal范围（总共720μm），如^{前面所述25，27，28}。
   4. 为了获得纹状体切片，将大脑切成40μm厚的部分，从+1.34mm开始，在−0.26mm²⁴处完成。
   5. 按照前后顺序在2 mL冷冻管（含有1 mL冷冻保护溶液）中收获每片。
   6. 要在纹状体中进行免疫组织化学（第4节）和免疫荧光分析（第5节），请选择以均匀间隔（320μm）拍摄的五个冠状纹状体切片，其覆盖细胞核的整个前苟范围（总共1600μm）。

4.免疫组化分析，量化多巴胺能神经元和小胶质细胞增多（约2天）

1. 对于纹状体或黑质切片的免疫组织化学分析，将来自同一大脑的五个（纹状体）或六个（SN）切片的集合放在24孔板的一个孔中。
2. 用1mLPBS洗涤切片3x，然后在室温下用0.5mL 0.03%H₂O₂ 在甲醇中孵育30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
3. 用1mLPBS洗涤切片3x，并在室温下用0.5mL封闭溶液（4%山羊血清，0.05%Triton X-100和PBS中的4%BSA）孵育40分钟。
4. 之后，在室温下用含有一抗（兔抗酪氨酸羟化酶[TH]pAb稀释1:1000[见 表1];或兔抗Iba1抗体稀释1:1000）的封闭溶液孵育，搅拌过夜。
5. 用1mLPBS洗涤切片3x，并在室温下用0.5mL含有生物素化山羊抗兔pAb（1:500，见 表1）的封闭溶液孵育2小时。
6. 然后，用1mLPBS洗涤切片3x，并在室温下用0.5mL过氧化物酶偶联亲和素（1:5000，见 表1）在封闭溶液中孵育90分钟。
7. 用1mL PBS洗涤切片3次，并与0.5mL底物溶液（0.05%二氨基联苯胺在0.03%H 2_{O 2}/ Trizma-HCl缓冲液中以pH 7.6孵育）。在这一步中戴上手套和实验室外套，因为二氨基联苯胺是一种潜在的致癌物质。
8. 当特定的染色很明显时（TH通常为30秒，Iba1通常为5分钟），取出底物溶液，并在室温下用1 mL PBS洗涤切片3次，并搅拌。始终同时对同一实验中包含的所有大脑切片进行免疫染色。
   注意:当TH免疫染色出现在SN区域时，TH的特定染色是显而易见的，SN在大脑中显示出特征形状。当Iba1免疫染色出现在具有典型小胶质细胞形状的对照脑切片上时，确定Iba1的特定标记，这些特征在显微镜观察时得到证实。通过这种方式，可以为每个实验确定用于IHC分析的底物暴露的确切时间。
9. 使用0.2%明胶溶液在0.05 M Tris（pH 7.6）中将大脑切片安装在载玻片上。将每组从同一大脑获得的五片（纹状体）或六片（SN）切片按玫瑰花序放在同一载玻片上。
10. 量化 SN 中 TH⁺ 神经元的数量。
    1. 为了量化SN中的TH ⁺ 神经元，使用明场显微镜以20倍放大倍率获取六个切片的照片，如^{前面所述25，27，28}。使用以下颜色调整:色温3200 K，青红色40%，洋红色39%，黄蓝色54%，伽马0.5，对比度37，亮度13，饱和度5。
    2. 使用Image J软件，选择所分析半球中SNS pars compacta的周长。避免从腹侧被盖区（VTA）选择TH ⁺ 神经元。
    3. 然后，要求软件计算所选面积（通常为0.04-0.07 mm² /半球，具体取决于玫瑰花位置）。然后，使用多点工具，用点标记每个TH ⁺ 神经元。
    4. 使用点工具，要求软件计算点的总数。使用总点数（TH ⁺ 神经元）和SNpc的面积，计算TH ⁺ 神经元的密度/ mm²。
    5. 在六个SN切片上的两个半球重复相同的计算，然后计算同侧和对侧TH ⁺ 神经元/ mm² 的平均值。
11. 量化纹状体中活化的小胶质细胞数量
    1. 为了量化纹状体中活化的小胶质细胞，使用明场显微镜和步骤4.10.1中指示的相同设置，以20倍放大率在每个半球中采集所有五个纹状体切片的两张照片。使用Image J软件，在每张照片中（显示面积为660μm x 877μm），使用多点工具，用一个点标记每个表示高Iba1强度和胪癏体形状的细胞。使用点工具，要求软件计算点的总数。
    2. 使用总点数和照片面积，计算活化小胶质细胞（Iba1^高 细胞/ mm²）的密度，如²⁹之前执行的那样。

表1:抗体稀释度。 不适用，不适用。*，仅当与小鼠，大鼠和人类存在反应性时，无论与其他物种的反应性如何，才指定。**，指定单次稀释或稀释范围。

5. 免疫荧光分析评估T细胞在黑纹体通路中的浸润（约2天）

1. 对于纹状体或黑质切片上hαSyn或TH / GFP的免疫荧光分析，将来自同一大脑的五个（纹状体）或六个（SN）切片的集合放在24孔板的一个孔中。
   1. 用1mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下用0.5mL封闭溶液（0.3%Triton X-100，0.05%吐温20和5%BSA在PBS中孵育40分钟）。
   2. 然后，在室温下用含有一抗的0.5mL封闭溶液（兔抗TH pAb稀释1:500;或兔抗hαSyn抗体稀释1:150，见 表1）孵育，搅拌过夜。
2. 用1 mL PBS洗涤切片3次，并在室温下用含有AlexaFluor546偶联抗（1:500，见 表1）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI;1:1000）的0.5mL封闭溶液孵育2小时。然后，用1毫升PBS洗涤切片3倍。
3. 如上所述将大脑切片安装在载玻片上（步骤4.9）。使用耦合到电源单元的倒置荧光显微镜获取图像。
4. 对于黑粒切片上TH / CD4 / GFP（Foxp3）的免疫荧光分析，将来自同一大脑的六（SN）切片的集合放在24孔板的一个孔中。用1mLPBS洗涤切片3次，然后在室温下用0.5mL封闭溶液（0.5%Triton X-100，PBS中0.5%鱼皮明胶）孵育2小时。
5. 在4°C下与含有兔抗TH pAb（1:200，见 表1）和大鼠抗CD4（1:250）的0.5mL封闭溶液一起孵育，搅拌过夜。
6. 用1 mL PBS洗涤切片3次，并在室温下孵育含有抗兔的阻断溶液0.5mL，偶联到AlexaFluor 647（1:500，见 表1）和抗鼠偶联AlexaFluor 546（1:500），搅拌2小时。然后，用1毫升PBS洗涤切片3倍。
7. 将每组从同一大脑获得的六片（SN）切片按玫瑰色顺序放在同一载玻片上，并使用荧光贴片G进行安装。使用 表2 所示的共聚焦显微镜设置从免疫荧光分析中获取图像。

表2:用于从免疫荧光分析中获取图像的共聚焦显微镜设置。

6. 统计分析

1. 要比较从同侧和对侧获得的数据，请使用成对的双尾学生 t 检验。
2. 为了比较从接受AAV-hαSyn的小鼠和接受AAV-GFP或假手术的小鼠获得的数据，请使用未配对的双尾学生t-test。当 P 值< 0.05 时，请考虑显著差异。

验证AAV载体在黑纹体通路的多巴胺能神经元中的正确递送
为了研究由突触核蛋白病理学促进的神经炎症，神经变性和运动损伤的过程，使用了由SN16，17，30，31中编码hαSyn的AAV的单侧立体定位递送诱导的帕金森病小鼠模型（参见补充图1中的实验设计）).为了验证AAV载体在黑质柱状体通路的多巴胺能神经元中的正确递送，在SN中注射了编码GFP的AAV（AAV-GFP），12周后，通过免疫荧光分析了SN和纹状体中的GFP荧光和酪氨酸羟化酶（TH）免疫反应性。仅在同侧观察到GFP相关荧光，并且在SN和纹状体中均存在TH免疫反应性的显着共定位，表明AAV载体在黑质纹状体通路的多巴胺能神经元中的正确递送（图1）。

图1:分析AAV-GFP在黑质胸腺途径中的递送。 小鼠接受AAV-GFP（1×10 10 vg /小鼠）并在12周后被处死，TH被免疫染色在（A）SN（鳞片条为118μm）和（B）纹状体（鳞片条为100μm）中。通过落射荧光显微镜分析TH和GFP相关荧光。用DAPI染色细胞核。显示TH（红色），GFP（绿色）和DAPI（蓝色）的合并或单染色的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。

在AAV-hαSyn诱导的帕金森病小鼠模型中建立用于诱导神经变性和运动障碍的病毒载体的剂量
为了测试诱导促进黑质多巴胺能神经元神经变性的hαSyn显着过表达所需的AAV-hαSyn的剂量，注射不同剂量（1 x 108 病毒基因组[vg]/小鼠，1 x 109 vg /小鼠或1 x10 10 vg /小鼠）的AAV-hαSyn，12周后，在黑质纹状体通路中评估hαSyn免疫反应性和TH免疫反应性的程度。尽管在SN中测试的所有剂量的hαSyn免疫反应性都很明显（图2），但只有接受1 x 1010 vg /小鼠的小鼠在纹状体中表现出明显的hαSyn免疫反应性（图3）。此外，接受1 x 1010 vg /小鼠AAV-hαSyn的小鼠在SN中显示出多巴胺能神经元的显着损失（图4A，B）。尽管接受1 x 1010 vg /小鼠AAV-GFP的小鼠显示出低程度（〜20%）的神经元损失（图4A，B），但接受相同剂量的AAV-hαSyn的小鼠表现出明显更高程度的黑瓜胺能神经元的神经变性（图4C）。因此，使用1 x10 10 vg /小鼠AAV-hαSyn进行进一步的实验。此外，通过使用光束测试（图5A）确定接受不同剂量的AAV-hαSyn的小鼠的运动损伤程度（图5A），如前面25所述。在光束测试中，仅使用1 x 1010 vg /小鼠AAV-hαSyn检测到运动性能的显着降低，无论是在比较右侧和左侧垫的错误数量（图5B）时，还是在比较接受AAV-hαSyn的小鼠与接受对照载体AAV-GFP的小鼠相比时（图5C）。因此，使用1 x10 10 vg /小鼠AAV-hαSyn进行进一步的实验。

图2:分析用不同剂量的AAV-hαSyn处理的小鼠SN中的人α突触核蛋白表达。 小鼠以（A）1 x10 10 vg/小鼠，（B）1 x 109 vg/小鼠，或（C）1 x 108 vg/小鼠和12周后接受AAV-hαSyn，并使用落射荧光显微镜在SN中通过免疫荧光分析hαSyn表达。用DAPI染色细胞核。显示hαSyn（红色）或DAPI（蓝色）合并或单染色的代表性图像。比例尺为118 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3:分析用不同剂量的AAV-hαSyn处理的小鼠纹状体中人α突触核蛋白的表达。 小鼠在（A）1 x 1010 vg/小鼠，（B）1 x 109 vg/小鼠，或（C）1 x 108 vg/小鼠）处接受AAV-hαSyn，并在12周后处死，并使用落射荧光显微镜通过纹状体中的免疫荧光分析hαSyn表达。用DAPI染色细胞核。显示hαSyn（红色）或DAPI（蓝色）合并或单染色的代表性图像。比例尺为 100 μm。合并图像右上角的插入内容以更高的放大倍率显示感兴趣的区域。 请点击此处查看此图的大图。

图4:用不同剂量的AAV-hαSyn或对照载体处理的小鼠中SN的多巴胺能神经元的损失。 小鼠接受AAV-hαSyn（1 x 1010 vg /小鼠，1 x 109 vg /小鼠，或1 x 108 vg /小鼠）或AAV-GFP（1 x10 10 vg /小鼠），12周后处死，并通过免疫组化在SNpc中分析TH。（一）代表性图片。比例尺，100μm.（B，C）神经元的密度被量化为TH +神经元的数量/ mm2。数据表示平均±SEM.n = 每组3-8只小鼠。（B）使用双尾配对学生t检验进行同侧与对侧的比较。（C）对接受1 x10 10 vg /小鼠AAV-hαSyn或AAV-GFP的小鼠的同侧进行比较。（乙、丙）虽然白条表示接受AAV-hαSyn的小鼠同侧TH +神经元的定量，但绿色条表示接受AAV-GFP的小鼠同侧TH +神经元的定量。灰色条表示相应组对侧TH +神经元的定量。比较由双尾未配对的学生t检验进行。*p < 0.05;**p < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。

图5:用不同剂量的AAV-hαSyn处理的小鼠的运动性能分析。小鼠接受不同剂量（1 x 1010 vg /小鼠，1 x 109 vg /小鼠或1 x 108 vg /小鼠）的AAV-hαSyn或AAV-GFP，12周后，通过光束测试评估运动性能。（A）鼠标在横梁上行走的图像。（B）在接受AAV-hαSyn的小鼠组中，对左肢（对侧）与右肢（同侧）进行的误差数量进行量化。（C）比较接受相同剂量的AAV-hαSyn或AAV-GFP的不同实验组之间的错误总数。数据表示平均±SEM.n = 每组3-5只小鼠。比较由（B）配对的双尾学生t检验或（C）未配对的双尾学生t检验进行。*p < 0.05;**p < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。

建立AAV-αSyn诱导的帕金森病模型的动力学
在确定用于诱导显着水平神经变性和运动损伤的适当AAV-hαSyn剂量后，进行了实验以确定hαSyn过表达的发作。为此，用1 x10 10 vg /小鼠AAV-hαSyn或假手术治疗小鼠。在立体定位手术后的第2-5周内，每周一次在SN中分析hαSyn表达的程度（参见 补充图2中的实验设计）。结果表明，尽管早在手术后2周就检测到hαSyn表达水平较低，但hαSyn簇出现在立体定位手术后的第5周（图6）。

图6:分析用AAV-hαSyn处理的小鼠SN中人α突触核蛋白表达的时间过程。 小鼠接受AAV-hαSyn（1 x10 10 vg /小鼠）或只是假立体定位手术，并分析HαSyn在SN中的表达（A）2周，（B）3周，（C）4周，或（D）5周后通过免疫荧光显微镜。用DAPI染色细胞核。显示hαSyn（红色）或DAPI（蓝色）合并或单染色的代表性图像。比例尺，100 μm。合并图像右上角的插入内容以更高的放大倍率显示感兴趣的区域。 请点击此处查看此图的大图。

之后，进行实验以确定AAV-hαSyn立体定位递送后中枢神经系统（CNS）中神经炎症和T细胞浸润的合适时间点。为了确定用AAV-hαSyn治疗小鼠后小胶质细胞活化的峰值，在立体定位手术后的第2-15周每周评估一次纹状体中表达高水平Iba1的细胞的程度。结果显示，与AAV-hαSyn治疗后15周小鼠的对侧相比，同侧的小胶质细胞活化显着增加（图7）。在共聚焦显微镜观察后，还通过免疫荧光在AAV-hαSyn立体定位递送后，在不同时间点评估浸润到SNpc中的Treg（CD4 + Foxp3 +）细胞的数量。结果显示，Treg浸润到SNpc的峰值是在手术后11周，而Treg浸润大脑该区域的程度在手术后第8周或第13周较低（图8）。未检测到CD4 + T细胞浸润纹状体（未显示数据）。总而言之，这些结果表明，使用1 x 1010 vg/小鼠的AAV-hαSyn，分析神经炎症的最合适时间点是立体定位手术后的第15周，而分析T细胞浸润到CNS的适当时间点似乎是AAV-hαSyn治疗后的第11周。

图7:分析接种AAV-hαSyn的小鼠中小胶质细胞活化的时间过程。 小鼠接受AAV-hαSyn（1 x10 10 vg /小鼠），并通过术后不同时间点纹状体中Iba1的免疫组织化学分析评估小胶质细胞活化。（A）显示AAV-hαSyn接种后5周，10周或15周处死的小鼠的Iba1免疫组织化学分析的代表性概述图像。（B）活化小胶质细胞的密度被量化为每个区域表达高水平的Iba1和胪麦角形状的细胞数量。数据表示平均±SEM.n = 每组3只小鼠。采用双尾配对学生t检验测定每组同侧和对侧Iba1的统计学差异。*p < 0.05。 请点击此处查看此图的大图。

图8:CD4 + T细胞浸润到接种AAV-hαSyn的小鼠SN中的时间过程分析。 Foxp3gfp 报告小鼠接受AAV-hαSyn（1 x 1010 vg /小鼠）。通过免疫荧光分析SN中表达Foxp3的CD4 + T细胞的存在和TH + 神经元在不同时间点（手术后第8周，第11周和第13周）的存在。（A）显示单一免疫染色或合并的代表性图像。（B）量化SN中每个区域的CD4 + Foxp3 + T细胞的数量。数据表示每组3只小鼠的平均±SEM。*p<0.05，同侧CD4 + Foxp3 + T细胞与对侧CD4 + Foxp3 + T细胞的双尾学生t检验。 请点击此处查看此图的大图。

补充图1:用于评估不同剂量的AAV载体对突触核蛋白病理学，神经变性和运动障碍的影响的实验设计。 野生型雄性C57BL / 6小鼠麻醉并接受不同剂量（1 x 1010 vg /小鼠，1 x 109 vg /小鼠或1 x 108 vg /小鼠）编码人α突触核蛋白（AAV-hαSyn）或eGFP（AAV-GFP）的AAV的立体定位接种，在CBA启动子的控制下进入右黑质（SN）。12周后，通过免疫荧光（IF）评估SN和纹状体（Str）中GFP和hαSyn的表达，通过免疫组化（IHC）在SN中定量酪氨酸羟化酶阳性（TH +）细胞，并通过光束测试评估运动性能。每个实验组中的小鼠数量在括号中表示。*表示在分析前一只小鼠死亡的组。每个分析都在括号中指出了显示相应结果的论文正文中的数字。 请点击此处下载此文件。

补充图2:用于测定T细胞浸润，神经炎症和hαSyn表达动力学的实验设计。 Foxp3gfp 报告小鼠在CBA启动子的控制下麻醉并接受编码人α突触核蛋白（AAV-hαSyn）的AAV（1 x 10 10 vg /小鼠）的立体定位接种到黑质（SN）或假手术（PBS）中。在不同时间点处死小鼠，通过免疫荧光（IF）、GFP（Foxp3）、CD4和酪氨酸羟化酶阳性（TH+）细胞在SN中定量hαSyn的表达，通过免疫组化（IHC）在纹状体（Str）中通过免疫组化（IHC）分析Iba1的表达。指示每个实验组中的小鼠数量。指示每个分析中包含的时间点范围。每个分析都在括号中指出了显示相应结果的论文正文中的数字。 请点击此处下载此文件。

作者声明，该研究是在没有任何金融或非金融竞争利益的情况下进行的。