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分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

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DOI：

10.3791/63313

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2022年7月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Fundación Ciencia & Vida, 2Center for Integrative Biology, Universidad Mayor, 3FONDAP Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, 4Buck Institute for Research on Ageing, 5Facultad de Medicina y Ciencia, Universidad San Sebastián

本文内容

摘要

本研究分析了在帕金森病临床前模型中诱导神经炎症、神经变性及运动功能障碍所需的病毒载体剂量和暴露时间。这些编码人源α-突触核蛋白的载体被递送至黑质 ，以重现与帕金森病相关的突触核蛋白病理变化。

摘要

帕金森病是一种神经退行性疾病，其特征是黑质纹状体通路中的多巴胺能神经元死亡，从而导致自主运动控制能力进行性丧失。这种神经退行性过程由脑内蛋白质聚集物沉积所引发，这些聚集物主要由α-突触核蛋白（α-synuclein）构成。多项研究表明，神经炎症是帕金森病相关神经退行性变发生所必需的环节。值得注意的是，神经炎症过程涉及小胶质细胞的活化以及外周T细胞向黑质（SN）的浸润。本研究分析了一种可重现小胶质细胞活化、T细胞浸润至黑质、黑质多巴胺能神经元的神经退行性变以及运动功能障碍的小鼠帕金森病模型。该小鼠模型通过立体定位法将编码人源野生型α-突触核蛋白的腺相关病毒载体（AAV-hαSyn）注入黑质而建立。通过使用编码绿色荧光蛋白（GFP）的对照载体，验证了病毒载体是否准确递送至黑质。随后，评估了注入黑质的AAV-hαSyn剂量对hαSyn表达水平、黑质多巴胺能神经元丢失程度以及运动功能障碍的影响。此外，还系统分析了在疾病发展过程中hαSyn表达、小胶质细胞活化和T细胞浸润的动态变化。因此，本研究确定了若干关键的时间节点，这些时间点可能有助于在该帕金森病临床前模型中针对突触核蛋白病理和神经炎症进行干预。

引言

继阿尔茨海默病之后，帕金森病是全球第二常见的神经退行性疾病。帕金森病主要累及黑质纹状体通路的神经元，这些神经元能够产生多巴胺并调控自主运动。因此，该疾病最典型的症状是运动功能障碍。该病理过程还涉及脑内蛋白质聚集体的沉积，这些聚集体主要由α-突触核蛋白（αSyn）1构成，αSyn是一种与突触前终末相关的胞质蛋白。已有证据表明，αSyn致病性包涵体的形成是由该蛋白的错误折叠或某些翻译后修饰所触发的2。

值得注意的是，在人类帕金森病及动物模型中，αSyn 病理变化与黑质纹状体通路中多巴胺能神经元的丢失之间已建立起密切关系3,4。阐明αSyn聚集体如何形成以及其如何诱导神经元死亡，是该领域面临的重要挑战。越来越多的研究表明，通过增加氧化应激，线粒体功能障碍是导致αSyn聚集体形成的主要原因之一2。事实上，多个与帕金森病风险相关的基因编码参与线粒体功能、形态和动态调控的蛋白质5,6。此外，溶酶体功能障碍导致功能异常的线粒体和错误折叠的αSyn累积，是促进αSyn聚集体形成的另一关键事件7。

越来越多的证据表明，一旦α突触核蛋白（αSyn）聚集体在脑内沉积，这些致病性蛋白便会刺激小胶质细胞上的Toll样受体（TLRs），从而触发小胶质细胞活化，并在黑质（SN）引发初始的炎症环境8,9。此外，有证据表明，αSyn聚集体可被抗原呈递细胞捕获并呈递给T细胞，诱导产生针对αSyn的特异性适应性免疫反应10,11。这些αSyn特异性的T细胞随后浸润脑组织，并被活化的小胶质细胞再次刺激，进而促进神经毒性因子的分泌，导致神经元死亡9,10。有趣的是，多项证据提示，αSyn聚集体首先在肠神经系统中生成，随后通过迷走神经传输至脑干12。

多年来，人们使用了多种帕金森病的动物模型，包括通过给予神经毒性物质（如6-羟基多巴胺、百草枯、鱼藤酮、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）诱导的模型以及涉及遗传条件的模型（如突变型α-突触核蛋白、突变型富含亮氨酸重复序列的激酶2）13。尽管神经毒素诱导的神经退行性变模型能够复制帕金森病的某些方面，但这些模型均未能重现该疾病的全部核心特征，或不具备进行性发展特点13。另一方面，虽然表达突变型富含亮氨酸重复序列的激酶2、突变型α-突触核蛋白或过表达人源野生型α-突触核蛋白的转基因小鼠模型可导致运动功能障碍，并在某些情况下出现突触核蛋白病，但它们并未重现帕金森病关键特征——黑质多巴胺能神经元的显著变性死亡13,14。第三类神经退行性变动物模型已成功模拟了帕金森病的大多数核心特征，即通过立体定位注射编码人源α-突触核蛋白的腺相关病毒载体（AAV-hαSyn）14,15。重要的是，腺相关病毒可在成年哺乳动物大脑中高效且长期地转导神经元。此外，已有研究表明，在黑质（SN）内立体定位注射AAV-hαSyn可重现该疾病的多个关键特征，包括αSyn病理改变、小胶质细胞活化、神经退行性变以及运动功能障碍16,17,18,19,20。本研究分析了病毒载体剂量以及病毒注射后时间对hαSyn表达程度、黑质纹状体通路中的神经退行性变和神经炎症的影响，同时评估了在单侧立体定位注射hαSyn至黑质的小鼠模型中运动功能障碍的程度。

方案

所有研究均按照《实验动物护理和使用指南》第8版的规定进行。实验方案已获得生命科学基金会（Fundación Ciencia & Vida）动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，包括涉及麻醉、疼痛、痛苦和安乐死的方案（许可编号：P-035/2022）。

1. 立体定位手术

  1. 手术准备（约 1 小时）
    1. 为维持无菌环境，整个手术过程中需穿戴适当的手术服，包括鞋套、外科口罩、卫生隔离服、手套和手术帽。
    2. 使用 70% 乙醇喷洒小鼠及所有手术器械，以维持无菌环境。
    3. 为诱导镇痛，于术前 1 小时开始，每 12 小时皮下注射一次卡洛芬（carprofen）5 mg/kg21，持续至术后第 3 天。
    4. 为麻醉小鼠，将动物置于诱导室中。开启异氟烷气流，初始流速为 0.5%，随后在约 5 分钟内缓慢增加至 5%，直至小鼠失去翻正反射22。
    5. 将动物从诱导室中取出，立即转移至带有合适尺寸鼻罩的非重复呼吸回路中。整个手术期间以 1% 异氟烷维持麻醉状态。
    6. 通过轻捏小鼠尾部和足爪确认其是否完全麻醉。当小鼠对尾部和足爪的夹捏无反应时，表明其已完全麻醉。
    7. 使用剪刀剃除小鼠头部毛发，并用含 2% 氯己定的棉签清洁皮肤，彻底清除所有毛发。
    8. 将小鼠头部固定于立体定位仪框架中。
    9. 使用棉签为小鼠双眼涂抹角膜保护剂。为避免对其他啮齿类动物造成应激，手术室内不得有其他小鼠存在23。
  2. 手术过程（约 30 分钟）
    1. 用 2% 氯己定对小鼠头部进行三次消毒，随后使用 70% 乙醇擦拭。暴露颅骨后，使用手术器械在以下坐标位置钻出一个小孔：前后向 −2.8 mm，内外侧 1.4 mm（相对于中线）。
    2. 将 10 µL 注射器的针头插入孔中，并缓慢推进针头至脑内，到达相对于硬脑膜背腹向 −7.2 mm 的位置24。
    3. 将针头保留在最终位置 2 分钟，使组织稍作稳定，随后以 0.2 µL/30 秒的速度向右侧黑质注入 1 µL 的 AAV5-CBA-hαSyn（AAV-hαSyn）、AAV5-CBA-eGFP（AAV-GFP）或对照溶液（pH 7.4 的 PBS；假手术组）。
    4. 病毒载体注射完成后，保持针头在同一位置 5 分钟，然后缓慢拔出。
  3. 术后处理（约 5 分钟）
    1. 使用无菌编织丝线不可吸收缝合线关闭切口。
    2. 将小鼠放入已预热的饲养笼中（将笼子置于电热垫上，温度设为 25 °C）。
      注：小鼠需单独饲养，直至其能够无障碍行走且伤口完全愈合。

2. 利用平衡木实验测定运动功能

  1. 训练（每只小鼠约15分钟）
    1. 立体定位手术后12周，采用此前描述的简化版横梁实验评估运动功能25。为此，使用一根长25 cm、宽3 cm的水平横梁。横梁表面必须覆盖一层金属网格，网格由边长1 cm的方格组成，并高出横梁表面1 cm。
    2. 录制小鼠从横梁一端行走至另一端（放置有笼舍的位置）穿越网格表面横梁的视频。在测定运动功能前，对小鼠进行为期2天的训练。
    3. 第1天，训练小鼠在无网格条件下穿越横梁5次。
    4. 第2天，训练小鼠在有网格条件下穿越横梁5次。
  2. 测试（每只小鼠约5分钟）
    1. 第3天，评估小鼠的运动功能。通过以慢动作模式回放视频，分别量化左前爪或右前爪产生的错误次数。
      注：当一只爪子未能正确踩在网格上，从而在网格侧面或网格与横梁表面之间可见时，即定义为一次错误。

3. 组织处理

  1. 心脏灌流（每只小鼠约 15 分钟）
    1. 使用 1 mL 注射器和 27 G 针头，通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物以麻醉小鼠26。
    2. 待小鼠完全麻醉后（参照步骤 1.1.6 确认），使用手术器械打开胸腔并暴露心脏。
    3. 随后将一根 21 G 针头（用钻头将针尖磨平）插入心脏左心室。
    4. 将针头连接至管道，使用蠕动泵以 9.5 mL/min 的速度灌注 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。
  2. 脑组织固定与抗冻处理（每脑约 10 分钟）
    1. 使用剪刀和镊子取出脑组织，随后将其浸入含 5 mL 4% 多聚甲醛的 PBS（pH 7.4）中，在 4 °C 下固定 24 小时。
    2. 固定完成后，将脑组织转移至 15 mL 含 30% 蔗糖的溶液中，在 4 °C 下保存 48 小时。
    3. 然后将脑组织放入含 4 mL 冷冻保护液（含 20% 甘油和 2% DMSO 的 PBS）的容器中，并在 −80 °C 下保存，或立即用于下一步操作。
  3. 获取脑切片（每脑约 20 分钟）。
    注意：确保将脑组织正确放置于冷冻切片机中，以便进行冠状面切割。
    1. 为获取黑质（SN）切片，从 −2.92 mm 开始至 −3.64 mm 结束，将脑组织切成 40 μm 厚的切片24。
    2. 按照前后顺序，将每一片切片收集至 24 孔板的孔中（每孔含 1 mL 冷冻保护液），如前所述25,27,28。
    3. 为在黑质（SN）中进行免疫组织化学（第 4 节）和免疫荧光分析（第 5 节），选择六个均匀间隔（120 µm）的冠状面 SN 切片，覆盖该核团全长（共 720 μm），如前所述25,27,28。
    4. 为获取纹状体切片，从 +1.34 mm 开始至 −0.26 mm 结束，将脑组织切成 40 μm 厚的切片24。
    5. 按照前后顺序，将每一片切片收集至 2 mL 冷冻管（每管含 1 mL 冷冻保护液）中。
    6. 为在纹状体中进行免疫组织化学（第 4 节）和免疫荧光分析（第 5 节），选择五个均匀间隔（320 µm）的冠状面纹状体切片，覆盖该核团全长（共 1600 μm）。

4. 免疫组织化学分析以定量多巴胺能神经元和小胶质细胞增生（约2天）

  1. 进行纹状体或黑质切片的免疫组织化学分析时，将同一脑组织的五张（纹状体）或六张（黑质）切片放入24孔板中的一个孔内。
  2. 用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL含0.03% H2O2的甲醇溶液，振荡孵育30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
  3. 用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL封闭液（含4%山羊血清、0.05% Triton X-100和4% BSA的PBS溶液），振荡孵育40分钟。
  4. 随后，在室温下用含一抗的0.5 mL封闭液（兔抗酪氨酸羟化酶[TH]多克隆抗体，按1:1000稀释[见表1]；或兔抗Iba1抗体，按1:1000稀释）振荡孵育过夜。
  5. 用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL含生物素化山羊抗兔IgG多克隆抗体（1:500，见表1）的封闭液，振荡孵育2小时。
  6. 接着，用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL含辣根过氧化物酶标记亲和素（1:5000，见表1）的封闭液，振荡孵育90分钟。
  7. 用1 mL PBS洗涤切片3次，然后加入0.5 mL底物溶液（含0.05%二氨基联苯胺的0.03% H2O2/Trizma-HCl缓冲液，pH 7.6）。此步骤需佩戴手套和实验服，因二氨基联苯胺为潜在致癌物。
  8. 当特异性染色清晰可见时（TH通常约30秒，Iba1约5分钟），移除底物溶液，并在室温下用1 mL PBS振荡洗涤切片3次。所有同一批实验所涉及脑组织切片的免疫染色操作应同时进行。
    注意：TH的特异性染色表现为在脑内具有特征性形态的黑质区域出现TH免疫阳性信号；Iba1的特异性标记则通过对照脑切片中呈现典型小胶质细胞形态的Iba1免疫阳性信号来确认，该形态需经显微镜观察验证。由此可确定每次免疫组化实验所需的精确底物反应时间。
  9. 使用含0.2%明胶的0.05 M Tris缓冲液（pH 7.6）将脑切片贴附于载玻片上。将来自同一脑组织的五张（纹状体）或六张（黑质）切片按前后顺序排列在同一张载玻片上。
  10. 定量黑质中TH+神经元的数量。
    1. 为定量黑质中的TH+神经元，使用明场显微镜以20倍放大倍数拍摄六张切片的图像，拍摄参数如下：色温3200 K，青红平衡40%，品绿平衡39%，黄蓝平衡54%，伽马值0.5，对比度37，亮度13，饱和度5（方法如前所述25,27,28）。
    2. 使用Image J软件，勾选所分析半球黑质致密部（SNpc）的边界区域，避免将腹侧被盖区（VTA）的TH+神经元纳入选区。
    3. 随后，指令软件计算所选区域的面积（通常为0.04–0.07 mm2/半球，具体数值取决于切片的前后位置）。然后使用多点工具，为每一个TH+神经元标记一个点。
    4. 使用点计数工具，指令软件统计总点数。根据总点数（即TH+神经元数）和SNpc面积，计算每平方毫米的TH+神经元密度（个/mm2）。
    5. 在六张黑质切片的双侧半球均重复上述计算，然后分别计算同侧与对侧的TH+神经元/mm2平均值。
  11. 定量纹状体中活化的小胶质细胞数量。
    1. 为定量纹状体中的活化小胶质细胞，使用明场显微镜以20倍放大倍数对每张纹状体切片的双侧半球各拍摄两张图像，显微镜设置同步骤4.10.1。使用Image J软件，在每张图像（显示区域为660 μm × 877 μm）中，利用多点工具为所有Iba1表达强度高且呈阿米巴样形态的细胞逐一标记点。使用点计数工具，指令软件统计总点数。
    2. 根据总点数和图像面积，计算活化小胶质细胞的密度（Iba1high细胞/mm2），计算方法如前所述29。

靶抗原偶联物克隆性宿主物种反应物种*稀释倍数**
酪氨酸羟化酶不适用多克隆兔小鼠、大鼠、人1/200 - 1/1000
Iba1不适用单克隆兔小鼠、大鼠、人1/1000
α-突触核蛋白不适用单克隆兔人1/150
CD4不适用单克隆大鼠小鼠1/250
IgG (H+L)生物素标记多克隆山羊兔1/500
IgG (H+L)AlexaFluor 546多克隆山羊兔1/500
IgG (H+L)AlexaFluor 647多克隆山羊兔1/500
IgG (H+L)AlexaFluor 546多克隆山羊大鼠1/500

表1：抗体稀释度。 N/A，不适用。*，仅当明确标注对小鼠、大鼠和人类有反应性时才注明，无论其是否对其他物种有反应性。**，注明单一稀释比例或稀释范围。

5. 免疫荧光分析以评估黑质纹状体通路中的T细胞浸润（约2天）

  1. 对于纹状体或黑质切片上的hαSyn或TH/GFP免疫荧光分析，将同一脑组织的五张（纹状体）或六张（黑质）切片放入24孔板的一个孔中。
    1. 用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL封闭液（含0.3% Triton X-100、0.05% Tween-20和5% BSA的PBS溶液），振荡孵育40分钟。
    2. 随后，在室温下用含一抗的0.5 mL封闭液（兔抗TH多克隆抗体，稀释比例1:500；或兔抗hαSyn抗体，稀释比例1:150，参见表1）振荡孵育过夜。
  2. 用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL含AlexaFluor546标记的山羊抗兔二抗（1:500，参见表1）及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1:1000）的封闭液，振荡孵育2小时。之后用1 mL PBS洗涤切片3次。
  3. 将脑切片按前述方法（步骤4.9）贴附于载玻片上。使用配备电源单元的倒置荧光显微镜采集图像。
  4. 对于黑质切片上TH/CD4/GFP(Foxp3)的免疫荧光分析，将同一脑组织的六张（黑质）切片放入24孔板的一个孔中。用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL封闭液（含0.5% Triton X-100和0.5%鱼皮明胶的PBS溶液），振荡孵育2小时。
  5. 在4 °C条件下，用含兔抗TH多克隆抗体（1:200，参见表1）和大鼠抗CD4抗体（1:250）的0.5 mL封闭液振荡孵育过夜。
  6. 用1 mL PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入0.5 mL含AlexaFluor 647标记的抗兔二抗（1:500，参见表1）和AlexaFluor 546标记的抗大鼠二抗（1:500）的封闭液，振荡孵育2小时。之后用1 mL PBS洗涤切片3次。
  7. 将来自同一脑组织的六张（黑质）切片按前后（头-尾）顺序排列，置于同一张载玻片上，并用Fluoromount G封片。使用Leica DMi8显微镜采集图像。采用表2中指定的共聚焦显微镜设置进行免疫荧光分析图像的采集。
通道名称滤光立方发射波长查找表名称曝光时间增益XY分辨率Z分辨率
通道1Y5700nm灰色1,011.727 ms高阱容量2.237 um24.444 um
通道2GFP525nm绿色326.851 ms高阱容量2.237 um24.444 um
通道3TXR630nm红色406.344 ms高阱容量2.237 um24.444 um
通道4Dapi460nm蓝色91.501 ms高阱容量2.237 um24.444 um

表2：免疫荧光分析图像采集所用的共聚焦显微镜设置。

6. 统计学分析

  1. 为比较同侧与对侧获得的数据，采用配对双尾 Student t 检验。
  2. 为比较接受 AAV-hαSyn 的小鼠与接受 AAV-GFP 或假手术的小鼠所获得的数据，采用非配对双尾 Student t 检验。当 P 值 < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

结果

验证腺相关病毒载体在黑质-纹状体通路多巴胺能神经元中的正确递送
为研究由突触核蛋白病理引发的神经炎症、神经退行性变及运动功能障碍，采用在黑质单侧立体定位注射编码人α-突触核蛋白（hαSyn）的腺相关病毒（AAV）所构建的帕金森病小鼠模型16,17,30,31 （见实验设计中的） 补充图1）。为了验证AAV载体在黑质纹状体通路多巴胺能神经元中的正确递送，将编码GFP的AAV（AAV-GFP）注射至黑质（SN），12周后通过免疫荧光法分析SN和纹状体中GFP荧光与酪氨酸羟化酶（TH）免疫反应性。GFP相关荧光仅在同侧观察到，且在SN和纹状体中均与TH免疫反应性呈现显著共定位，表明AAV载体已成功递送至黑质纹状体通路的多巴胺能神经元（图1).

荧光显微镜示意图；黑质与纹状体中TH、GFP、DAPI染色分析。
图1：AAV-GFP在黑质-纹状体通路中递送效果的分析。 小鼠注射AAV-GFP（1 × 1010 vg/只），12周后处死，对（A）黑质（比例尺为118 µm）和（B）纹状体（比例尺为100 µm）进行TH免疫染色。通过落射荧光显微镜分析TH与GFP相关的荧光信号。细胞核使用DAPI染色。图中显示TH（红色）、GFP（绿色）和DAPI（蓝色）单独或合并染色的代表性图像。请点击此处查看该图的高清版本。

建立用于诱导帕金森病小鼠模型中神经退行性变和运动功能障碍的 AAV-hαSyn 病毒载体给药剂量
为了测试诱导人源α-突触核蛋白（hαSyn）显著过表达并促进黑质多巴胺能神经元变性所需的AAV-hαSyn剂量，采用不同剂量（1 x 108 病毒基因组 [vg]/小鼠，1 × 109 vg/小鼠，或 1 x 1010 在黑质中注射了不同剂量（vg/小鼠）的AAV-hαSyn，12周后评估了黑质纹状体通路中hαSyn的免疫反应性以及酪氨酸羟化酶（TH）免疫反应性的受损程度。尽管在所测试的所有剂量下，黑质中均可见明显的hαSyn免疫反应性，图2），仅接受 1 x 1010 vg/mouse 在纹状体中表现出明显的 hαSyn 免疫反应性（图3）。此外，接受 1 x 1010 AAV-hαSyn 小鼠的黑质中多巴胺能神经元显著减少图 4A,B）。尽管接受 1 x 1010 AAV-GFP 的 vg/小鼠表现出较低程度（约 20%）的神经元丢失（图4A，B），接受相同剂量 AAV-hαSyn 的小鼠表现出显著更高的黑质多巴胺能神经元变性程度（图4C). 因此，后续实验采用 1 x 1010 vg/小鼠的AAV-hαSyn。此外，通过使用平衡木实验（beam test）评估接受不同剂量AAV-hα游戏副本的小鼠运动功能障碍的程度。图5A），如前所述25仅在使用 1 x 1010 在梁测试中，比较右肢和左肢垫所犯错误次数时，AAV-hαSyn 小鼠的 vg/小鼠图5B) 以及比较接受 AAV-hαSyn 的小鼠与接受对照载体 AAV-GFP 的小鼠的总错误次数时（图 5C）。因此，后续实验采用 1 x 1010 AAV-hαSyn 小鼠的病毒滴度（vg/小鼠）

免疫荧光、蛋白表达、hαSyn、DAPI、合并图像、实验分析、显微镜
图 2：接受不同剂量 AAV-hαSyn 处理的小鼠黑质中人源 α-突触核蛋白表达的分析。 小鼠分别接受 AAV-hαSyn 注射，剂量为 (A) 1 × 1010 vg/只、(B) 1 × 109 vg/只 或 (C) 1 × 108 vg/只，12 周后处死，通过落射荧光显微镜结合免疫荧光法检测黑质中 hαSyn 的表达情况。细胞核使用 DAPI 染色。图中显示 hαSyn（红色）或 DAPI（蓝色）单独染色及合并图像的代表性结果。比例尺为 118 µm。请点击此处查看本图的放大版本。

haαSyn 免疫荧光、DAPI 染色、脑组织切片、病毒载体分布评估。
图 3：不同剂量 AAV-hαSyn 处理小鼠纹状体中人源 α-突触核蛋白表达的分析。 小鼠分别接受剂量为 (A) 1 × 1010 vg/小鼠、(B) 1 × 109 vg/小鼠 或 (C) 1 × 108 vg/小鼠 的 AAV-hαSyn 处理，12 周后处死，通过落射荧光显微镜对纹状体中 hαSyn 的表达进行免疫荧光分析。细胞核使用 DAPI 染色。图中显示了 hαSyn（红色）和 DAPI（蓝色）单独染色或合并染色的代表性图像。比例尺为 100 µm。合并图像右上角插图为高倍放大下的感兴趣区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达分析，柱状图；AAV 载体对神经元密度的影响，显微镜结果。
图4：经不同剂量AAV-hαSyn或对照载体处理的小鼠中黑质多巴胺能神经元的丢失。 小鼠接受 AAV-hαSyn（1 x 1010 vg/小鼠，1 × 109 vg/小鼠，或 1 x 108 vg/小鼠）或 AAV-GFP（1 × 1010 vg/小鼠）处理，12 周后处死，通过免疫组织化学法分析黑质致密部（SNpc）中的 TH 表达。A代表性图像。比例尺， 100 µm. (B，C) 神经元密度被量化为每平方毫米内TH+神经元的数量2数据代表均值 ± 标准误。每组 n = 3–8 只小鼠。 (B采用双尾配对样本 t 检验对同侧与对侧进行比较。C) 接受 1 x 10⁶ 个细胞移植的小鼠同侧比较10 AAV-hαSyn 或 AAV-GFP 的病毒颗粒/小鼠给药操作已执行。B，C白色柱状图表示接受AAV-hαSyn的小鼠同侧TH+神经元的定量结果，绿色柱状图表示接受AAV-GFP的小鼠同侧TH+神经元的定量结果。灰色柱状图表示相应组对侧TH+神经元的定量结果。组间比较采用双尾非配对Student’s t检验。*p<0.05 < 0.05；**p < 0.01. 请点击此处以查看此图的放大版本。

横梁实验；小鼠运动技能；柱状图；对侧与同侧错误；AAV治疗分析。
图 5：接受不同剂量 AAV-hαSyn 治疗的小鼠运动功能分析。小鼠分别接受不同剂量（1 × 1010 vg/只、1 × 109 vg/只 或 1 × 108 vg/只）的 AAV-hαSyn 或 AAV-GFP 治疗，12 周后通过横梁实验评估其运动功能。（A）小鼠在横梁上行走的图像。（B）对接受 AAV-hαSyn 治疗的小鼠组别中左肢（对侧）与右肢（同侧）产生的错误次数进行量化。（C）比较接受相同剂量 AAV-hαSyn 或 AAV-GFP 的不同实验组之间的总错误次数。数据以均值 ± 标准误表示，每组 n = 3–5 只小鼠。组内比较采用（B）配对双尾 Student t 检验，组间比较采用（C）非配对双尾 Student t 检验。*p < 0.05；**p < 0.01。请点击此处查看该图的放大版本。

建立由 AAV-αSyn 诱导的帕金森病模型的动力学
在确定了能够诱导显著神经退行性变和运动功能障碍的合适 AAV-hαSyn 剂量后，进一步开展了实验以明确 hαSyn 过表达的起始时间。为此，小鼠接受了 1 x 1010 vg/小鼠剂量的 AAV-hαSyn 注射或假手术处理。在立体定位手术后第 2 至第 5 周，每周一次分析黑质（SN）中 hαSyn 表达的程度（实验设计见补充图 2）。结果显示，尽管术后 2 周即可检测到低水平的 hαSyn 表达，但 hαSyn 聚集体直到术后第 5 周才出现（图 6）。

免疫荧光、人源α-突触核蛋白表达、脑切片、时间过程、DAPI染色、合并图像。
图6：接受AAV-hαSyn处理的小鼠黑质中人源α-突触核蛋白表达的时间过程分析。 小鼠接受AAV-hαSyn（1 × 1010 vg/小鼠）注射或仅进行假手术，随后通过免疫荧光结合落射荧光显微镜分别在术后（A）2周、（B）3周、（C）4周或（D）5周检测黑质中hαSyn的表达。细胞核经DAPI染色。图中显示hαSyn（红色）与DAPI（蓝色）单独染色及合并图像的代表性结果。比例尺为100 µm。合并图像右上角插图显示感兴趣区域的更高倍数放大图像。请点击此处查看本图的高清版本。

随后，开展实验以确定在立体定位注射 AAV-hαSyn 后，分析中枢神经系统（CNS）内神经炎症和 T 细胞浸润的合适时间点。为确定小鼠经 AAV-hαSyn 处理后小胶质细胞活化的峰值，于立体定位手术后第 2 至 15 周每周评估纹状体中高表达 Iba1 的细胞范围。结果显示，在 AAV-hαSyn 处理后 15 周，与对侧相比，同侧小胶质细胞活化程度显著升高（图 7）。此外，通过免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察，评估了不同时间点调节性 T 细胞（Treg，CD4+ Foxp3+）浸润黑质致密部（SNpc）的数量。结果表明，Treg 细胞浸润 SNpc 的峰值出现在术后第 11 周，而在术后第 8 周或第 13 周，该脑区 Treg 浸润程度较低（图 8）。未检测到 CD4+ T 细胞浸润纹状体（数据未显示）。综上所述，使用 1 × 1010 vg/小鼠剂量的 AAV-hαSyn 时，分析神经炎症的最佳时间点为立体定位手术后第 15 周，而分析 T 细胞浸润 CNS 的合适时间点则为 AAV-hαSyn 处理后第 11 周。

小胶质细胞随时间激活的组织学图像和柱状图；对侧与同侧分析。
图7：接种AAV-hαSyn小鼠中小胶质细胞激活时间进程的分析。 小鼠接种AAV-hαSyn（1 × 1010 vg/小鼠），并在手术后不同时间点通过纹状体中Iba1的免疫组织化学分析评估小胶质细胞的激活情况。(A) 显示接种AAV-hαSyn后5周、10周或15周处死小鼠的Iba1免疫组织化学分析代表性概览图像。比例尺：110 µm。(B) 激活的小胶质细胞密度被量化为每单位面积内高表达Iba1且呈阿米巴形态的细胞数量。数据以均值±标准误表示。每组n = 3只小鼠。采用双尾配对Student’s t检验确定各组内同侧与对侧Iba1之间的统计学差异。*p < 0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

免疫荧光 CD4 Foxp3 细胞密度显微镜图像、TH 染色、术后周数 T 细胞图示。
图 8：接种 AAV-hαSyn 小鼠黑质中 CD4+ T 细胞浸润的时间过程分析。 Foxp3gfp 报告基因小鼠接种 AAV-hαSyn（1 × 1010 vg/小鼠）。通过免疫荧光法在不同时间点（术后第 8 周、第 11 周和第 13 周）分析小鼠黑质中表达 Foxp3 的 CD4+ T 细胞以及 TH+ 神经元的存在情况。(A) 显示单标记免疫染色或合并图像的代表性图片。比例尺，100 µm。(B) 对黑质区域每单位面积 CD4+ Foxp3+ T 细胞数量进行定量。数据表示为每组 3 只小鼠的平均值 ± 标准误（SEM）。*p < 0.05，通过双尾 Student’s t 检验比较同侧与对侧 CD4+ Foxp3+ T 细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：评估不同剂量AAV载体对α-突触核蛋白病理、神经退行性变及运动功能障碍影响的实验设计。 将野生型雄性C57BL/6小鼠麻醉后，通过立体定位注射将不同剂量（每只小鼠1 × 1010 vg、1 × 109 vg 或 1 × 108 vg）的AAV载体注入右侧黑质（SN），这些AAV载体在CBA启动子控制下编码人源α-突触核蛋白（AAV-hαSyn）或eGFP（AAV-GFP）。12周后，通过免疫荧光（IF）检测SN和纹状体（Str）中GFP和hαSyn的表达，通过免疫组化（IHC）定量分析SN中酪氨酸羟化酶阳性（TH+）神经元数量，并通过横杆实验评估运动功能。各实验组小鼠数量以括号标示。* 表示在分析前有1只小鼠死亡的组别。每项分析后的括号内标明了正文中展示相应结果的图编号。请点击此处下载该文件。

补充图2：确定T细胞浸润、神经炎症和人源α-突触核蛋白（hαSyn）表达动力学的实验设计。 使用异氟烷麻醉Foxp3gfp报告基因小鼠，并通过立体定位注射将携带人源α-突触核蛋白基因（AAV-hαSyn）的腺相关病毒（AAV，1 × 1010 vg/只）在CBA启动子控制下注入右侧黑质（SN），或仅注射PBS作为假手术对照。在不同时间点处死小鼠，通过免疫荧光（IF）检测黑质和纹状体中hαSyn的表达水平；在黑质中通过免疫荧光定量GFP（Foxp3）、CD4和酪氨酸羟化酶阳性（TH+）细胞；在纹状体（Str）中通过免疫组织化学（IHC）分析Iba1的表达。各实验组小鼠数量已标明。每项分析所包含的时间点范围也已注明。每项分析后的括号内标明了论文正文中展示相应结果的图编号。请点击此处下载该文件。

讨论

本文分析的神经退行性疾病小鼠模型可能有助于研究帕金森病病理生理学中涉及的多个关键方面，包括α-突触核蛋白（αSyn）病理和小胶质细胞活化的机制、外周免疫系统在神经炎症调控中的作用，以及神经退行性变的机制。在αSyn病理所涉及的机制中，包括在黑质多巴胺能神经元中αSyn负荷过重的情况下，与线粒体、溶酶体或蛋白酶体功能障碍相关的亚细胞机制2。需要注意的是，除了由AAV介导转导诱导的人源αSyn（hαSyn）表达外，内源性小鼠αSyn也共同构成了总αSyn表达的负荷。过表达小鼠αSyn的转基因小鼠会发展出与过表达hαSyn的小鼠模型相似的突触核蛋白病理、神经病理学改变及运动功能障碍32。关于小胶质细胞的活化，当前的小鼠模型可用于研究细胞因子、神经递质、星形胶质细胞、神经元、血脑屏障以及T细胞等不同分子和细胞成分如何调控小胶质细胞获得促炎性或抗炎性功能表型8,10,11。该模型也是研究外周免疫系统（不仅包括T细胞，还包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞）在黑质神经元神经炎症和神经退行性变过程中作用的重要工具11,33,34。最后，该小鼠模型还为在体内研究神经退行性变的细胞与分子机制提供了有价值的系统，这些机制既包括由细胞内过程（如氧化应激、能量缺乏和受损细胞器）所引发的机制2，也包括由小胶质细胞、星形胶质细胞和细胞毒性T细胞产生的神经毒性因子等外部因素所介导的机制8,28,29,35。

该小鼠模型的一个局限性在于，无法研究α突触核蛋白（αSyn）在脑外部位的病理性聚集是否构成了帕金森病发展的初始阶段36。在这方面，越来越多的证据表明，在黑质神经元变性及运动功能障碍出现之前，αSyn病理变化首先起始于肠黏膜和嗅上皮36，而αSyn特异性的T细胞反应可能也在此阶段启动12。随后，αSyn聚集体可能通过迷走神经迁移至脑干，引发多巴胺能神经元的神经炎症和神经变性12。尽管AAV-hαSyn模型可重现帕金森病的大多数特征，但该模型中并未明显表现出αSyn在脑外部位的病理性聚集。一种可用于研究帕金森病这些特征的替代模型是，在Thy1启动子调控下过表达人源αSyn的转基因小鼠模型（Thy1-SNCA模型）37，该模型的疾病发展依赖于肠道微生物群，并表现出明显的胃肠道功能障碍38。

尽管该小鼠模型有助于研究帕金森病病理生理学相关的多种过程，但其实验过程中包含若干关键步骤，需仔细核查，包括将病毒载体准确递送至相应空间坐标、在神经元中特异性表达人源α-突触核蛋白（hαSyn）（这取决于腺相关病毒血清型及载体构建）、以及在分析帕金森病表型前确保腺相关病毒（AAV）的适当剂量和作用时间。有必要对黑质（SN）区域病毒载体的正确递送进行分析，因为即使采用正确的黑质空间坐标，若注射针头并非完全笔直（有时肉眼难以察觉），仍可能导致递送偏差。此外，AAV载体的扩散还取决于所用AAV血清型39。因此，必须定期进行质量控制，通过观察包含黑质区域的脑切片中绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，来验证注射的AAV-GFP载体是否实现正确递送与有效扩散。

关于hαSyn在神经元中的特异性表达，原则上，可以通过使用对神经元具有选择性的启动子，甚至更精确地使用对多巴胺能神经元具有选择性的启动子（例如在AAV载体中使用TH启动子）来实现hαSyn的表达调控，从而诱导基因在多巴胺能神经元中的特异性表达40。然而，当目标是目的基因的过表达时，该策略并不适用。因此，在当前模型中，必须使用强启动子（即能够诱导下游基因高水平表达的启动子）以及具有神经元趋向性的AAV血清型。本研究中采用CBA启动子作为强启动子以诱导hαSyn的过表达，并选用AAV5血清型作为病毒载体。此前已有研究使用该血清型转导小鼠和大鼠的神经元41,42。本研究结果显示，在将AAV5-GFP注射至小鼠黑质（SN）后12周，绿色荧光仅在同侧的黑质和纹状体中特异性出现（图1），表明黑质-纹状体通路中的神经元被高效转导。

帕金森病小鼠模型的另一个关键方面是术后分析特定过程所需的时间点。在这方面，本研究展示了与病理相关的不同过程的动力学分析。由于关键时间点会随着每只小鼠接种的病毒基因组剂量、所用AAV血清型，甚至所用AAV批次的不同而变化，因此首先进行了AAV-αSyn剂量效应分析，以确定诱导TH+神经元显著丢失及运动功能障碍所需的病毒量。既往研究表明，在小鼠中注射AAV-αSyn 12周后，当剂量范围为6 x 108–3 × 1010 每只小鼠的病毒基因组16,17,30,31因此，用于在黑质纹状体通路中诱导hαSyn表达以及TH损失的AAV-hαSyn剂量，+ 神经元及小鼠的运动功能障碍程度范围为 1 x 108–1 × 1010 每只小鼠的病毒基因组。此外，为控制TH的丢失+ 神经元及运动功能障碍是由在黑质（SN）中过表达hαSyn所引起，而非由AAV对黑质神经元的感染所致。因此，实验设置了对照组，即在小鼠单侧黑质注射编码报告基因的AAV（AAV-eGFP），并检测其神经退行性病变和运动功能障碍。结果显示，在立体定位手术后12周，1 × 1010 每只小鼠的病毒基因组数量是 AAV5-hαSyn 的适当剂量，接受此病毒载量的小鼠在黑质纹状体通路中表现出显著的 hαSyn 表达（图2 和 图3），TH+ 神经元的丢失（图4），以及运动功能障碍（图5）。相比之下，较低剂量的 AAV5-hαSyn（1 x 108 每只小鼠的病毒基因组数和 1 x 109 每只小鼠的病毒基因组数量）不足以使所有这些参数同时发生显著变化（图2–4值得注意的是，在 1 x 1010 每只小鼠的病毒基因组诱导出较低（约20%）但显著程度的TH丢失+ 黑质多巴胺能神经元图4A，B）。该结果与此前使用此模型的观察结果一致41 并且可能是由于在黑质（SN）内给予AAV载体诱导的低水平神经炎症所致。然而，TH丢失的程度+ 接受AAV5-hαSyn的小鼠中神经元的数量显著高于接受相同剂量AAV-GFP的小鼠（图 4C值得注意的是，hαSyn 表达的动力学不仅取决于转导效率，还取决于 AAV 的扩散程度。39由于AAV的扩散依赖于AAV血清型，因此在使用与AAV5不同的其他AAV血清型时，该动物模型中的确切关键时间点可能会有所不同。

随后，使用每只小鼠 1 x 1010 个病毒基因组进行动力学分析，以确定该小鼠模型中的关键时间点。由于现有证据表明，在运动功能障碍出现之前已存在一些早期症状，这为帕金森病的早期诊断提供了可能43,44，因此本实验旨在寻找人源α-突触核蛋白（hαSyn）表达已明显但尚未出现运动功能障碍的时间点。结果显示，在立体定位注射 AAV-hαSyn 后 5 周，黑质（SN）中开始出现 hαSyn 表达（图 6）。该时间点是启动针对性治疗以阻断神经炎症和神经退行性过程的一个理想时间窗口。本研究确定的其他关键时间点包括与神经炎症过程相关的两个重要事件的峰值时间：小胶质细胞达到最大激活程度的时间，以及 T 细胞浸润黑质达到峰值的时间。结果表明，小胶质细胞激活的动力学曲线呈现两个波峰趋势，第一个波峰出现在术后 10 周，第二个波峰出现在术后 15 周（图 7）。T 细胞浸润的动力学分析显示，调节性 T 细胞（Treg）浸润黑质的峰值时间为立体定位手术后 11 周（图 8）。令人意外的是，在术后 8 至 13 周的时间范围内，未检测到效应 T 细胞（CD4+ Foxp3-）浸润黑质。综上所述，这些结果提示，在该临床前模型中，启动旨在抑制神经炎症进程并减轻 T 细胞浸润黑质的治疗，其合适的时间窗口为术后第 5 周（hαSyn 过表达起始）至术后第 10 周（神经炎症和 T 细胞浸润的第一波高峰）之间（图 9）。

AAV-hαSyn 递送时间线，包含小胶质细胞激活和抗炎治疗阶段。
图9：该动物模型中关键时间点的总结。 请点击此处查看该图的放大版本。

披露

作者声明，本研究是在不存在任何财务或非财务竞争利益的情况下进行的。

致谢

我们感谢塞巴斯蒂安·巴伦苏埃拉博士和米卡埃拉·里卡博士在动物实验设施中提供的宝贵兽医协助。本工作由以下机构资助 "ANID卓越科学与技术中心基础资助" 科学中心 & Vida, FB210008（资助机构：Fundación Ciencia & Vida）以及衰老科学脑健康与代谢中心（FONDAP-15150012）提供资助。本研究还获得了智利国家科学技术发展基金（FONDECYT-1210013，授予 R.P.）和（FONDECYT-1150766，授予 F.C.）的资助。 "智利国家研究与开发署（ANID）" 帕金森病研究迈克尔·J·福克斯基金会资助项目 MJFF-10332.01（授予 R.P.）和 MJFF-17303（授予 F.C.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物与动物饲料
Foxp3-GFP C57BL/6 小鼠杰克逊实验室（美国缅因州巴港）货号： 023800
实验动物饲料LabDiet啮齿类动物饲料 5001标准啮齿类动物饲料
野生型 C57BL/6 小鼠杰克逊实验室（美国缅因州巴港）货号：000664
病毒载体
AAV5-CBA-αSyn爱荷华大学病毒载体核心设施N/A储存浓度为 10E13 vg/mL
AAV5-CBA-eGFP爱荷华大学病毒载体核心设施N/A储存浓度为 9.5 × 10E12 vg/mL
麻醉剂与镇痛剂
异氟烷Baxter218082立体定位手术使用浓度为 1%
氯胺酮Drag PharmaCHE30立体定位手术剂量为 70 mg/kg 
七氟烷BaxterVE2L9117用于心脏灌流前麻醉
曲马多Drag PharmaDPH134每 24 小时给药 30 mg/kg
赛拉嗪CentrovetEHL40立体定位手术剂量为 9 mg/kg
仪器设备
横梁测试装置自制N/A水平横梁长 25 cm，宽 3 cm，表面覆盖金属网格（1 cm2）
冷冻切片机LeicaCM1520
数码相机NikonS2800 Coolpix用于记录横梁测试表现
显微镜OlympusBX51用于免疫组化分析（第 4.4 节）
显微镜OlympusIX71用于免疫荧光分析（第 5.3 节）
显微镜LeicaDMI8用于免疫荧光分析（第 5.7 节）
新型标准立体定位仪（小鼠用）Stoelting, Wood Dale, IL, USA51500手术用立体定位框架
蠕动泵MasterflexC-flex L/S16
电源装置OlympusU-RFL-T用于免疫荧光分析（第 5.3 节）
外科缝合线Sylkam®, B BraunC0760171
100 U 注射器BD324918用于心脏灌流前麻醉，配 29G 针头
5 μL 无针头注射器HamiltonHA-7641-01用于病毒载体接种
缓冲液与试剂
链霉亲和素-过氧化物酶偶联物Merck, Darmstadt, Germany189728
牛血清白蛋白Merck, Darmstadt, Germany9048-46-8
冷冻保护液自制N/A含 20% 甘油和 2% DMSO 的 PBS 溶液
DAPIAbcamab228549
二氨基联苯胺Merck, Darmstadt, GermanyD8001
Fluoromount-G TElectron Microscopy Science17984-25
明胶Merck, Darmstadt, Germany104078
正常山羊血清Jackson ImmunoResearch Laboratory5000121
多聚甲醛Merck, Darmstadt, Germany104005
PBS自制N/A0.125 M，pH 7.4
过氧化物酶失活缓冲液自制N/A含 0.03% H2O2 的甲醇溶液
吐温 X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Merck, Darmstadt, Germany1185-53-1
吐温 20Sigma-Aldrich822184
抗体
生物素-SP（长间隔）AffiniPure 山羊抗兔 IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch Laboratory111065003
山羊抗兔 IgG（H+L）  Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA11010
山羊抗兔 IgG（H+L）  Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA21244
山羊抗大鼠 IgG（H+L）  Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA11081
兔单克隆抗 α-突触核蛋白抗体Abcamab138501
兔单克隆抗 Iba-1 抗体AbcamEPR16588
兔多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体MilliporeAB152
大鼠单克隆抗 CD4 抗体Biolegend100402
软件
GraphPadPrism6.0用于 Fos 统计分析
ImageJ美国国立卫生研究院N/A用于图像分析
LAS XLeicaN/A用于 Leica 显微镜图像采集
ProgRes Capture ProJenoptikN/A用于 Olympus 显微镜图像采集
VLC 媒体播放器VideoLAN 组织N/A用于行为学测试分析

参考文献

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分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型
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