本研究描述了制备可用于直接检测T. cruzi DNA的qPCR试剂的步骤，该试剂可预先加入反应容器中，并在冰箱中保存数月。
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摘要
摘要
实时聚合酶链式反应（qPCR）是一种极为灵敏且精确的技术 ，可用于从大量样本中扩增 极微量的核酸靶标。该技术已被广泛应用于众多研究领域，并在人类疾病诊断和转基因生物（GMO）作物性状筛选等工业领域实现了应用。然而，qPCR并非完全无误差的技术。将所有试剂混合成单一主混合液，再分装至标准qPCR板的96个孔中，这一过程可能导致操作人员出现试剂混合错误或加样不准确等失误。本文介绍一种称为“凝胶化”的技术，该技术通过在真空条件下形成溶胶-凝胶混合物的试剂，替代主混合液中的大部分水分。结果表明，qPCR试剂可在室温下有效保存数周，或在2–8 oC条件下保存数月。本文展示了每种溶液的制备细节，以及用于检测 T. cruzi卫星DNA（satDNA）的凝胶化反应的预期形态。类似的方法也可用于检测其他生物体。启动一次凝胶化的qPCR运行极为简便：只需将qPCR板从冰箱中取出，向各孔加入待测样本，然后开始运行程序，从而将整板反应的准备时间缩短至仅需完成样本加样所需的时间。此外，凝胶化PCR反应可批量生产并进行质量控制，有助于节省时间，并在常规PCR实验中避免常见的操作失误。
引言
恰加斯病于20世纪初被发现th 19世纪巴西农村地区，贫困现象普遍存在1,2即使在今天，该疾病在美洲仍与健康的社会和经济决定因素密切相关。恰加斯病具有双相病程，包括急性期和慢性期。该病由克氏锥虫感染引起。 克氏锥虫 寄生虫，通过昆虫媒介传播，或经输血、先天性途径，或摄入被污染的食物而传播3,4.
恰加斯病的诊断可通过临床症状（尤其是罗曼尼亚征）观察、血涂片显微镜检查、血清学检测以及分子检测（如实时PCR（qPCR）或等温扩增）进行4,5,6,7,8,9。临床症状和血涂片显微镜检查适用于疑似急性感染病例，而抗体检测则用于无症状患者的筛查。由于qPCR具有较高的灵敏度和特异性，已被建议作为慢性患者的监测工具、用于治疗中急性患者血液中寄生虫负荷的测定，并可作为治疗失败的替代指标6,8,10,11,12。尽管qPCR比目前可用的检测方法更灵敏和特异，但由于其在运输和储存过程中需要低温冷冻条件，导致其在全球资源匮乏地区的推广应用受到实质性限制13,14,15。
为克服这一障碍，研究人员已探索了冻干和凝胶化等保存技术16,17。冻干技术虽可实现长达数年的保存，但要求使用不含甘油的特殊试剂，而甘油通常被用于酶的稳定与保存18。相比之下，凝胶化技术虽仅能实现数月的保存，但允许使用常规试剂19。凝胶化溶液包含四种组分，每种组分在过程中具有特定作用：海藻糖和松三糖通过减少溶液中的游离水分子，在干燥过程中保护生物分子；糖原形成更广泛的保护性基质；氨基酸赖氨酸则作为自由基清除剂，抑制生物分子的羧基、氨基和磷酸基团之间的氧化反应。这些组分共同构成一种溶胶-凝胶混合物，可在干燥过程中防止生物分子三级或四级结构的丧失，从而有助于在重新水化后维持其活性19。反应体系在反应管内稳定后，可在2–8 °C下保存数月，或在21–23 °C下保存数周，而无需常规的-20 °C保存条件。该方法已被应用于多种疾病诊断检测中，例如恰加斯病、疟疾、利什曼病、结核病和环孢子虫病的检测13,14,15,20。
本研究介绍了制备凝胶化qPCR所需溶液的全部步骤、操作过程中的注意事项，以及八联管中可直接使用的凝胶化qPCR产物的预期最终形态。该方案同样可适用于单管或96孔板。最后，将展示克氏锥虫（T. cruzi）DNA的检测结果作为对照实验。
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方案
1. 储备液和凝胶化混合物的制备
注意：将配制四种储备溶液（400 mg/mL 棉子三糖、400 mg/mL 海藻糖、0.75 mg/mL 赖氨酸和 200 mg/mL 糖原），并按照表1所示比例混合，以制备凝胶化混合液。尽管本方案描述的是制备10 mL储备溶液，但可根据需要调整为更小或更大的体积。
- 棉子三糖溶液
- 称取4 g棉子三糖于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
注意：可添加更多水以促进溶解，但需注意不要超过最终体积（见下文）。 - 用无核酸酶水定容至10 mL。贴标签，于2-8 °C保存，有效期最长6个月。
- 称取4 g棉子三糖于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
- 海藻糖溶液
- 称取4 g海藻糖于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
注意：可添加更多水以促进溶解，但需注意不要超过最终体积（见下文）。 - 用无核酸酶水定容至10 mL，并通过0.2 µm滤膜过滤溶液。贴标签，于2-8 °C保存，有效期最长6个月。
- 称取4 g海藻糖于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
- 糖原溶液
- 称取2 g糖原于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
注意：可添加更多水以促进溶解，但需注意不要超过最终体积（见下文）。 - 将溶液在2-8 °C静置8-12小时，因为糖原溶解过程中会产生大量气泡（图1）。用无核酸酶水定容至10 mL。贴标签，于2-8 °C保存，有效期最长6个月。
- 称取2 g糖原于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
- 赖氨酸溶液
- 称取7.5 mg赖氨酸于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
注意：可添加更多水以促进溶解，但需注意不要超过最终体积（见下文）。 - 用无核酸酶水定容至10 mL，并通过0.2 µm滤膜过滤溶液。将溶液转移至棕色瓶中或避光保存。贴标签，于2-8 °C保存，有效期最长6个月。
- 称取7.5 mg赖氨酸于15 mL塑料管中，加入6 mL无核酸酶水，涡旋振荡至粉末完全溶解，振荡速度为仪器最大速度。
- 凝胶化混合液（GM）
- 在50 mL塑料管中，根据表1混合各储备液的体积。
- 通过将管子头尾颠倒10次以混匀试剂。
注意：若此步骤在层流安全柜中进行，则无需过滤。若非在洁净环境中操作，则在转移至棕色瓶前需通过0.2 µm滤膜过滤溶液。 - 将溶液转移至棕色瓶中或避光保存。贴标签，于2-8 °C保存，有效期最长3个月。
注意：作为凝胶化混合液制备的质量控制步骤，应确保测得的pH值、电导率和密度在以下范围内：pH 5.55-6.66；电导率0.630-0.757 mS/cm；密度1.08-1.11 g/cm3。所有测量均应在25 °C下进行。
2. 凝胶化 qPCR 预混液的制备
注意：此步骤中制备用于凝胶化的qPCR预混液。因此，混合物中不添加水，而是加入凝胶化混合液（表2）。
- 在冷藏容器中解冻试剂。按照 表2 将试剂加入1.5 mL离心管中进行混合。此处展示一个终体积为25 µL、包含5 µL DNA样品的反应示例。
注意：此步骤中不将DNA样品加入混合液；此处仅用于计算qPCR预混液中各试剂的最终体积。DNA样品应在开始运行前立即加入（见下文步骤4）。
3. 反应容器中试剂的凝胶化
- 根据 表2 中所示体积，按比例放大以制备八联管或96孔板。
- 将 表2 中所示的凝胶化主混合液各18.5 µL加入每个反应孔中。
注意：该体积代表一个反应所需的寡核苷酸混合液、PCR缓冲液和凝胶化混合液的总体积（依据 表2），具体体积会因试剂浓度及单个反应所需体积而有所不同。由于未添加水，凝胶化主混合液的最终体积与常规主混合液不同。 - 将管子/板放入真空烘箱内的导热支撑材料（例如铝块）上。
注意：导热支撑材料为可选。操作者必须确保管底与真空烘箱搁板接触，以实现快速热平衡。 - 每两块96孔板放置一个膨润土干燥袋。
注意：膨润土干燥袋用于吸收在真空差压作用下从凝胶化主混合液中去除的水分。当使用少于两块96孔板时，发现无需使用膨润土干燥袋。 - 将含有凝胶化主混合液的管子/板置于受控温度（30 °C ± 1 °C）条件下，进行三次真空循环（30 ± 5 mBar），每次持续30分钟，并交替释放真空至恢复大气压（900–930 mBar）（图2）。
注意：仪器通过软件控制参数，循环示例见 图2。用户必须创建运行程序，设定所选参数。 - 循环完成后，通过观察液体体积是否明显减少（图3）以及轻敲管壁或板时液体是否不晃动，检查管子/板中试剂是否已正确凝胶化。
注意：若未发生凝胶化，轻敲管子时液体会飞溅至管壁（图3）。 - 密封后于2–8 °C保存8–12小时，再投入使用。
4. 使用凝胶化 qPCR
- 从冰箱中取出管条或板，在样本操作工作台中打开。向每个反应管中加入 15 µL 无核酸酶水。
注意：凝胶状试剂的体积约为 5 µL。因此，加上 DNA 样本体积（见下文），最终反应体系为 25 µL。 - 加入 5 µL DNA 样本。
注意：可使用任何符合 qPCR 要求的 DNA 模板。本研究中，DNA 提取自 108 个 T. cruzi 无鞭毛体（Dm28c 菌株），并使用 TE 缓冲液按 1:10 比例进行系列稀释。 - 密封管或板，转移至选定设备。运行实验并进行常规数据分析。
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结果
形成凝胶混合物的三种试剂在剧烈涡旋振荡后可轻松溶解。然而，糖原需要仔细涡旋振荡以确保粉末完全溶解。遗憾的是，剧烈涡旋会产生大量气泡，从而难以准确判断溶液的实际体积图1A-B）。因此，必须将糖原溶液在冰箱中静置，直至气泡内截留的大部分溶液沉降至主体溶液中。考虑到制备流程和实验室常规操作，凝胶化平板通常在冰箱中放置过夜（或约8–12小时），以使大部分气泡沉降，从而更易于准确判断溶液体积并调整至所需终体积（图1C）。注意糖原管之间气泡体积的差异 图1B-C分别在溶解后立即以及过夜静置后。
将凝胶化混合物加入qPCR预混液中以替代水（表2）后，即可将管条或板放入真空烘箱中。真空烘箱的搁板内置帕尔贴加热元件，可确保与之接触的任何管子保持相同温度。在本实验方案中，腔体内部温度恒定维持...
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讨论
近年来，人们愈发认识到需要寻找更为灵敏和特异的技术，以帮助诊断热带病及被忽视的疾病。尽管寄生虫学检测（光学显微镜）和血清学检测在流行病学防控中具有重要意义，但其在灵敏度和现场即时检测适用性方面存在局限性。诸如PCR、等温扩增及其相应变体等DNA扩增技术已在实验室环境中长期使用，但技术障碍限制了其在野外现场的应用。其中一个主要障碍是试剂在运输和储存过程中需要-20 °C的低温环境。为解决这一问题，已采用冻干和凝胶化等技术，使PCR反应体系可在非冷冻条件下保存16,18,19。
本研究展示了在反应管、管条、微流控芯片或板中固化 qPCR 反应以检测 T. cruzi DNA 所需的全部步骤。Rosado 等人.19报道的使用 RT-LAMP 反应的初步研究表明，该固化技术也可用于保护和屏蔽其他核酸扩增与修饰酶。尽管整体...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Aline Burda Farias 在真空烘箱技术操作方面的协助，同时感谢巴西巴拉那州分子生物学研究所（IBMP，库里蒂巴，巴西）管理部门允许使用该设备。本研究部分由基金项目 CNPq 445954/2020-5 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活性膨润土黏土袋 | Embamat 全球包装解决方案公司（西班牙巴塞罗那） | 026157/STD | 切勿与硅胶干燥剂混淆 |
| 糖原 | Amersham Bioscience | 货号 US16445 | |
| 赖氨酸 | Acros Organic | 货号# 365650250 | |
| 蜜二糖 | Sigma-Aldrich | 货号 63620 | |
| 无核酸酶水 | 首选供应商 | ||
| 寡核苷酸 | 首选供应商 | ||
| PCR预混液 | 首选供应商或巴拉那分子生物学研究所á （IBMP，巴西库里蒂巴） | 查加斯病NAT试剂盒 | |
| PCR扩增仪 | 首选供应商 | ||
| 真空烘箱软件 | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| 海藻糖 | Sigma-Aldrich | 货号 T9531 | |
| 克氏锥虫DNA | 来自实验室自培的寄生虫，或从ATCC等认证供应商处购买 | ||
| 真空烘箱 | Memmert Gmbh | VO-400 |
参考文献
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