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方法文章

Callinectes sapidus 中神经肽的多维度质谱分析

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DOI：

10.3791/63322

⸱

2022年5月31日

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

神经肽的质谱表征可提供序列、定量和定位信息。该优化的工作流程不仅适用于神经肽研究，也适用于其他内源性肽类。本文提供的实验方案描述了使用液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）、基质辅助激光解吸/电离质谱点样（MALDI-MS spotting）以及基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MS imaging）进行神经肽的样品制备、质谱采集、质谱分析及数据库构建。

摘要

神经肽是调节几乎所有生理和行为过程的信号分子，例如发育、繁殖、摄食以及对外部应激源的反应。然而，神经肽的生化作用机制及其种类组成和功能角色仍远未被充分阐明。这类信号分子具有极高的多样性，阻碍了对其内源性肽的鉴定与表征。此外，神经肽在突触释放后易受酶降解，且其生物活性浓度比神经递质低100至1000倍。质谱法（MS）是一种高灵敏度的分析工具，可在无需全面预知目标分子的情况下实现对分析物的鉴定、定量和定位 先验的 知识。该方法非常适合于神经肽的全局分析，并有助于发现新的肽类物质。由于此类肽在生物体内丰度低且化学性质高度多样，研究人员已从蛋白质组学技术中借鉴并优化了多种样品制备方法、质谱采集参数以及数据分析策略，以实现对神经肽的最佳表征。本文描述了从复杂生物组织中分离神经肽的方法，结合液相色谱-质谱（LC-MS）和基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS），用于神经肽的序列鉴定、定量分析和定位研究。同时提供了一种从蓝蟹构建神经肽数据库的实验方案，美洲蓝蟹一种缺乏完整基因组信息的生物体也被纳入其中。这些工作流程可根据不同物种内源性肽的种类，结合多种仪器进行调整和应用。

引言

神经系统十分复杂，需要由神经元构成的网络来在生物体内传递信号。神经系统负责协调感觉信息和生物学反应。信号传递过程中涉及复杂且错综的相互作用，需要多种不同的信号分子，如神经递质、类固醇和神经肽。由于神经肽是最多样化且效力最强的信号分子，在激活对压力及其他刺激的生理反应中发挥关键作用，因此明确其在这些生理过程中的具体功能具有重要意义。神经肽的功能与其氨基酸结构密切相关，该结构决定了其迁移性、受体相互作用及亲和力1。研究人员已采用组织化学技术（该技术尤为重要，因为神经肽可在组织的不同区域合成、储存和释放）以及电生理学方法来研究神经肽的结构与功能2,3,4，但这些方法在通量和特异性方面存在局限，难以解析神经肽庞大的序列多样性。

质谱分析法（MS）能够对神经肽的结构和丰度进行高通量分析。该分析可通过不同的质谱技术实现，最常用的是液相色谱-电喷雾电离质谱法（LC-ESI-MS）5 基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）6利用高精度质谱测量和串联质谱碎裂技术，质谱法能够在不依赖复杂混合物中其他组分的情况下，确定神经肽的氨基酸序列及其翻译后修饰（PTM）状态。 先验的 知识，以帮助确定其功能7,8除了定性信息外，质谱技术还能通过非标记定量（LFQ）或基于标记的方法（如同位素标记或等重标记）实现神经肽的定量分析。9LFQ 的主要优势包括操作简单、分析成本低以及样品制备步骤减少，从而可最大限度降低样品损失。然而，LFQ 的缺点在于仪器使用时间成本增加，因其需要进行多次技术重复以应对运行间变异所引起的定量误差，这也导致其对微小变化的准确量化能力下降。基于标签的方法由于可利用多种稳定同位素对多个样品进行差异标记，随后将样品混合为单一分析物并同时通过质谱分析，因而系统性变异较小。该方法还可提高通量，但同位素标签的合成或购买通常耗时且成本较高。随着多重检测水平的提高，全扫描质谱（MS1）的谱图复杂性也随之增加，导致能够被碎裂并被鉴定的独特神经肽数量减少。相反，同重元素标记在 MS1 水平不会增加谱图复杂性，但对神经肽等低丰度分析物会带来挑战。由于同重元素定量是在碎片离子质谱（MS2）水平进行的，低丰度神经肽可能无法被定量，因为更丰富的基质成分可能优先被选中进行碎裂，而被选中的离子本身丰度也可能不足以实现准确定量。而在同位素标记方法中，每一个被鉴定出的肽段均可进行定量分析。

除了鉴定和定量之外，还可通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）10获得分子定位信息。通过在样品表面逐点扫描激光，可将质谱数据按每个 m/z 值整合生成热图图像。在不同条件下绘制神经肽信号强度在各脑区的分布图，可为功能判定提供重要信息11。神经肽的定位尤为重要，因为其功能可能随分布位置的不同而发生变化12。

神经肽的丰度较低 体内 比其他信号分子（如神经递质）更敏感，因此需要采用高灵敏度的方法进行检测13这可以通过去除丰度较高的基质成分（如脂质）来实现11,14与常见的蛋白质组学工作流程相比，在进行神经肽分析时需要额外考虑一些因素，主要原因在于大多数神经肽组学分析省略了酶解步骤。由于多数数据分析软件的算法基于蛋白质组学数据，并依赖于通过肽段检测来推断蛋白质匹配，因此这一限制影响了可用于神经肽数据分析的软件选择。然而，诸如 PEAKS 等多种软件15 更适用于神经肽分析，因为它们 从头合成 测序能力。从提取方法到质谱数据分析，多个因素需要在神经肽分析过程中加以考虑。

本文所述方案包括样品制备和二甲基同位素标记、数据采集以及利用液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）、基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）对神经肽进行数据分析的方法。通过多个实验的代表性结果，展示了这些方法在鉴定、定量和定位蓝蟹（Callinectes sapidus）神经肽方面的有效性与能力。为了更好地理解神经系统，通常会使用模式系统。许多生物体尚无完整的测序基因组，这限制了在肽段水平上全面发现神经肽。为应对这一挑战，本文还包括一种用于鉴定新神经肽并结合转录组挖掘以构建缺乏完整基因组信息生物体数据库的方案。此处提供的所有方案均可针对任何物种的神经肽样品进行优化，并适用于任何内源性肽段的分析。

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方案

所有所述组织取样均按照威斯康星大学麦迪逊分校的指南进行。

1. 神经肽的液相色谱-电喷雾电离质谱分析

  1. 神经肽的提取与脱盐
    1. 在获取组织之前，按如下方法制备酸化甲醇（acMeOH）（甲醇:水:乙酸 = 90:9:1）16.
    2. 从甲壳类动物中采集脑组织17 并用镊子立即将每份组织各放入一个含有 20 µL acMeOH 的 0.6 mL 管中。
      注意：不同动物和不同组织类型的组织解剖方案差异很大。读者可参考相关方案17 有关如何从甲壳类动物中解剖脑组织及其他多种组织类型的详细说明，请参见相关文献。样品可保存在 -80 °C 直至使用（最好在6个月内使用）。所述体积适用于单个脑组织 Callinectes sapidus体积应根据组织大小进行调整。组织可在不使用溶剂的情况下立即进行速冻，但不推荐此方法，因为内源性蛋白水解酶不会被抑制，仍保持活性，尽管在低温下活性较慢。
    3. 向样品中加入150 µL的acMeOH。将超声波匀浆仪的总超声时间设为24 s，脉冲时间8 s，间歇时间15 s，振幅50%，在冰上对样品进行匀浆处理。
      注意：存在多种不同的匀浆系统。请根据样本类型和设备调整设置和条件。
    4. 在 4 °C 下以 20,000 x g 离心样品 g 20分钟。用移液器将上清液转移至离心管中，并在真空浓缩仪中干燥（266 × g，1 × 10-4 Torr），温度约为 35 °C。
      注意：干燥后的样品可于 -80 °C 保存至使用（最好在6个月内）。使用真空浓缩仪加热时必须谨慎。虽然加热可缩短干燥时间，但一旦液体完全蒸发，必须立即取出样品，以尽量减少肽段降解。为避免此问题，可在本步骤及后续所有步骤中省略加热。
    5. 为进行脱盐，将提取的组织样品用 20 µL 的 0.1% 甲酸（FA）重新溶解，充分涡旋混匀，并在室温下于水浴中超声处理 1 分钟。
      注意：可选用不同的脱盐材料。根据树脂种类和神经肽的量调整溶液和体积。总肽量可使用商用肽定量检测试剂盒进行估算（参见 材料表) .
    6. 将 0.5 µL 样品滴加到 pH 试纸上，以确认 pH < 4. 如果pH值较高，逐次加入1 µL的10% FA，直至pH < 4.
    7. 遵循生产商的脱盐操作说明18配制润湿溶液，含100 µL 50%乙腈（ACN）；平衡溶液，含100 µL 0.1%甲酸（FA）；洗涤溶液，含100 µL 0.1%甲酸（FA）；洗脱溶液，分别含20 µL 25%乙腈/0.1%甲酸、20 µL 50%乙腈/0.1%甲酸和20 µL 75%乙腈/0.1%甲酸。
    8. 获取一个带有 C18 树脂的 10 μL 脱盐吸头（参见 材料表).
    9. 将脱盐柱尖端安装到设定为15 μL的20 μL移液器上。脱盐柱润湿后，当移液器离开溶液时应保持按钮按下状态，防止空气通过，直至弃置。
    10. 用润洗液吸取尖端3次 用平衡溶液洗涤3次。将样品吸取10次 随后用洗涤液洗涤3次，每次均弃去洗涤液。按照乙腈（ACN）浓度递增的顺序，分别在各洗脱液中抽吸10次进行洗脱。
      注意：洗脱组分可单独保存，也可混合后用于后续分析。
    11. 弃去用过的脱盐柱尖端，并在真空浓缩仪中干燥洗脱的神经肽（266 × g，1 × 10-4 Torr，温度约为 35 °C。
      注意：可于 -80 °C 保存至使用前（最好在6个月内）。
  2. 组织提取物中神经肽的同位素标记
    注意：此步骤为可选，仅在需要进行定量分析时使用。
    1. 制备2重反应体系 在通风橱中配制同位素二甲基标记溶液：1% CH2OH2 （将13.5 µL 37% 质量分数（wt.%）水溶液加入486.5 µL 水中），1% CH2光密度2 （25 µL 的 20 wt. % 储备液） 475 µL 水中的溶液）和 0.03 M 噻吩硼烷吡啶（996.25 µL 水中含 3.75 µL 8 M 储备液）。
      警告：甲醛具有毒性，所有操作应在通风橱中进行。操作时需佩戴手套、实验服、护目镜及防渗透鞋具。使用该物质时不应佩戴隐形眼镜。
      注意：存在多种同位素试剂，应根据样本类型及所需的标记通道数量选择合适的试剂。
    2. 将粗神经肽提取物溶解于10 µL水中，超声处理10分钟。
    3. 加入10 µL不同的同位素标记甲醛溶液（即, CH2OH2, CH2光密度2，等等）分配至需进行定量测量的不同实验条件下。涡旋混匀，并在2,000 x g.
    4. 向每个样品管中加入 10 µL 0.03 M 毕啶硼烷。涡旋混匀，然后在 2,000 x g.
    5. 将样品在37 °C水浴中孵育15分钟。
    6. 从水浴中取出样品，加入10 µL 100 mM碳酸氢铵。涡旋混匀后，将每个样品在2,000 x g下短暂离心 g.
    7. 将标记的样品合并为一个2-plex样品，并在真空浓缩仪中干燥神经肽（266 × g，1 × 10-4 Torr），温度约为 35 °C。
    8. 通过重复步骤 1.1.5 - 1.1.10 对标记的神经肽进行脱盐，并将其保存至准备进行数据采集时使用。
  3. 数据采集
    1. 将干燥去盐的神经肽用 12 µL 的 3% ACN/0.1% FA 溶液重悬，充分涡旋，于 37 °C 水浴中超声 1 分钟，然后在 2,000 x g将每个样品转移至自动进样瓶中。
      ​注意：根据神经肽的含量调整样品体积，使肽浓度约为每微升1 µg。可使用商用肽定量检测试剂盒估算总肽量（参见 材料表) .
    2. 使用自动进样器将1 µL样品注入高分辨率纳米液相色谱-串联质谱仪（参见 材料表).
    3. 使用一根长约15 cm的反相C18色谱柱（见 材料表使用含0.1%甲酸的水溶液作为流动相A，含0.1%甲酸的乙腈溶液作为流动相B进行样品分析。以300 nL/min的流速，运行3%–95% B的梯度程序，持续11分钟以上。
    4. 对于此处使用的质谱仪，采用常见的质谱条件：喷雾电压为2.00 kV，毛细管温度为275 °C。
    5. 在 200 - 2,000 范围内采集质谱（MS）谱图 m/z 分辨率为60,000，自动增益控制（AGC）目标值为1 × 106，最大离子注入时间（IT）为150 ms。
    6. 选择强度最高的15个离子（最低强度为3.2 x 10）4) 采用归一化碰撞能量30、隔离窗口2.0，进行高能碰撞解离（HCD）碎裂 m/z，分辨率为15,000，AGC目标值为2 x 105，最大IT为250 ms。
    7. 设置30秒的动态排除窗口。排除电荷数为1或≥8的离子以及电荷状态未识别的离子。
  4. 神经肽的鉴定与定量
    注意：有许多用于数据库搜索和肽段定量的软件（包括开源和商业软件）可供使用。此处使用 PEAKS Studio（蛋白质组学软件）15 将被使用。
    1. 使用 1.4.2 至 1.4.6 步骤中所述方法进行数据库搜索。
    2. 创建一个新项目并选择添加LC-MS数据 无 对于该酶， Orbitrap 对于该仪器， HCD 用于片段，以及数据依赖性采集（DDA用于采集。
      注意：根据数据采集参数选择适当的参数。
    3. 选择 鉴定 并选择 正确的前体 [DDA] 和 仅质量.
    4. 选择 数据库检索 并设定误差容限为 20.0 ppm 使用单一同位素质量作为前体离子质量 0.02 Da 用于碎片离子质荷比 无 酶的类型 非特异性 用于消化模式， 100 最大漏切位点数，以及以下可变翻译后修饰，每条肽段允许的最大可变翻译后修饰数为 3: 酰胺化，氧化（M）, E来源的焦谷氨酸，以及 焦谷氨酸来自Q.
    5. 选择 神经肽数据库，使用诱饵融合法估计错误发现率（FDR）。
      注意：质量容差误差应根据所采集的数据进行调整。根据样本类型选择合适的数据库。当未选择酶时，最大漏切位点参数不会影响搜索结果。但如果软件不具备相应功能，则需要设置较多的漏切位点。 未指定 消化模式作为可选选项。
    6. 如果需要进行无标记定量，请选择 定量分析，选择 无标记 并设置误差容限为 20.0 ppm 保留时间容差 1.0 分钟.
    7. 如果已执行步骤1.2中的同位素标记，则进行前体离子定量。
      1. 选择 定量分析，选择 前体离子定量，使用保留时间范围 1.0 分钟，并使用 FDR 阈值 1%.
      2. 从预设或自定义的定量方法中进行选择 选择方法 下拉菜单
      3. 要创建新的自定义方法，请单击 窗口 > 配置 > Label Q 方法 > 新命名新方法并选择 前体离子定量 方法类型。选择 添加行 从 PTM 选项列表中选择修饰。
      4. 添加LC-MS数据并选择 对照条件 对照实验条件下神经肽的修饰情况
    8. 按照步骤 1.4.9 - 1.4.11 所述，评估检索结果。
    9. 通过摘要标签页筛选肽段和蛋白质的结果，条件为 -10lgP ≥ 20，选择 ≥ 1 独特肽段，以及标有“选择”的复选框 含显著肽段.
    10. 评估数据库搜索结果，其中 Protein.csv 代表神经肽的鉴定结果，Peptide.csv 代表神经肽片段的鉴定结果。
    11. 检查数据库搜索结果中的蛋白质和肽段得分、质量精度以及序列覆盖率。
      ​注意：每种数据库搜索软件均采用独特的评分算法，可能需要相应地进行评估。可通过手动检查已鉴定肽段的实测谱图（包含完整的碎片离子系列）来评估鉴定结果。

2. 神经肽的基质辅助激光解吸电离质谱点样分析

  1. 样品制备
    1. 如果需要定量，请执行步骤 1.1 或步骤 1.1–1.2，但排除步骤 1.2.8（同位素标记后无需在 MALDI-MS 分析前进行脱盐）。
    2. 将干燥并脱盐后的神经肽用 5 µL 的 0.1% 甲酸（FA）重悬，充分涡旋，于 37 °C 水浴中超声 1 分钟，并在 2,000 × g 条件下短暂离心。
    3. 对于甲壳类组织中神经肽的点样，配制 150 mg/mL 的 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液，溶剂为 50% 甲醇（MeOH）/0.1% FA（v/v），作为基质。
    4. 用移液器吸取 3 µL 样品滴加至疏水膜上（见材料表），再直接向样品液滴中加入 3 µL 基质溶液，反复吹打混匀。
    5. 取 1 µL 的 1:1 样品:基质混合液加入 MALDI 不锈钢靶板的样品孔中。用移液器枪头将混合液均匀铺展至样品孔边缘。样品必须接触样品孔刻蚀的边缘，以促进均匀分布（图 4A）。
    6. 在靠近样品的靶孔中点加 1 µL 的 1:1 校准物:基质混合液（商用或自配校准混合物、聚合物材料（例如，溶于甲醇的红磷）或常见基质簇离子）12。
      ​注意：红磷在点样前无需与基质混合。
  2. 数据采集
    1. 将含有干燥样品点的靶板插入 MALDI 串联飞行时间（TOF/TOF）质谱仪中（见材料表）。
    2. 对于 DHB 基质，将激光功率设为95%，选择自动最优检测器增益，并选择Smart - Complete Sample样品载体移动模式。在 200–3200 m/z 范围内采集 MS 谱图，并将来自每个样品点的多个谱图叠加，以提高神经肽的信噪比。
      注意：优化激光功率百分比、检测器增益，并选择合适的样品载体移动模式，确保每次采集大致覆盖整个样品点，且后续采集不重复之前的位置。 
    3. 校准仪器。 
      ​注意：调整质量范围，使其涵盖目标神经肽的质量范围。
  3. 数据分析
    1. 在数据分析软件中打开 MALDI-MS 文件（见材料表），并点击本软件中的基线扣除功能。
    2. 点击寻找质谱峰列表进行峰提取。若峰数量过少，可通过选择编辑质谱峰列表手动编辑峰列表，并在谱图中点击峰以将其添加至质谱峰列表。
    3. 通过将质谱峰列表与包含 [M+H]+ m/z 值（± 200 ppm 误差）的神经肽数据库进行比对，实现精确质量匹配。
      注意：常见的盐加合物，如 [M+K]+、[M+Na]+ 和 [M+NH4]+，也应包含在精确质量匹配的目标列表中。
    4. 为验证已鉴定的峰，生成感兴趣的 m/z 列表并进行 MS/MS 实验。

3. 神经肽的基质辅助激光解吸电离质谱成像分析

  1. 样品制备
    注意：对于过薄而无法切片的组织，无需进行包埋和切片步骤。
    1. 将明胶（37 °C，100 mg/mL，溶于去离子水）注入半杯冷冻切片机用杯中，室温下静置使其凝固。剩余的液态明胶置于37 °C水浴中保温。
    2. 从动物体内采集所需的神经组织，用镊子立即将组织浸入含有去离子水的0.6 mL离心管中1秒。
      注意：神经组织解剖步骤参见第1.1.2步的注意部分。
    3. 将组织置于固体明胶上方，用液体明胶填充冷冻切片机模具的其余部分。使用镊子调整组织位置。
    4. 将冷冻切片机样本杯置于平坦表面，并用干冰冷冻。
      注意：将样本储存于 -80 °C，直至使用（最好在6个月内）。
    5. 在切片制备过程中，通过切割去除包埋胶的冷冻切片模具，将明胶包埋的样品从冷冻切片机模具中分离出来。
    6. 将包埋的组织置于冷冻切片机样品头时，先用移液器吸取1 mL去离子水滴加到样品头上，随即立即将包埋的组织按压到水滴上。
    7. 冷冻后，用移液器在组织周围加入更多去离子水，以进一步将其固定在样品头上。在冷冻切片机箱内执行这些步骤（参见 材料表设定为 -20 °C。
    8. 将组织切成约一个细胞厚度（根据样本类型不同，厚度约为8-20 µm），然后将切片一侧靠近涂有氧化铟锡（ITO）的玻璃载玻片，用手指按住载玻片另一侧，缓慢加热玻璃表面，使切片自然贴附于载玻片上。
      注意：组织切片也可通过镊子（冷却至 -20 °C）夹住明胶的一侧边缘，将其转移至ITO涂层玻璃载玻片上，并用手指按压载玻片另一侧，缓慢加热玻璃，使切片黏附于载玻片上。
    9. 使用疏水笔在组织切片附近画一个小圆圈，将用作校准物的样品（校准物选项参见步骤2.1.6）点样至圆圈内。
    10. 用修正液笔在载玻片的每个角上标记一个带有尖锐边缘的小形状即，x）用作教学点。
    11. 将玻片放入 MALDI 载样板适配器中，并使用扫描仪获取高分辨率（≥2400 DPI）的光学图像。
    12. 使用自动喷雾器将基质喷洒到组织切片上（参见 材料表 有关喷雾器的详细信息和使用说明）。
    13. 对于甲壳类组织中神经肽的质谱成像，使用40 mg/mL DHB溶于50%甲醇/0.1% FA（v/v）作为基质，设置自动喷涂仪的喷嘴温度为80 °C，喷涂速度为1,250 mm/min，流速为0.1 mL/min，喷涂次数为12次，每次喷涂间隔30 s。
  2. 数据采集
    1. 插入已喷洒基质并含有解冻贴附组织切片的完全干燥的目标板。
    2. 设置质谱成像采集文件参数，使激光直径小于光栅步长。
    3. 加载扫描的光学图像，并使用x个教学点校准样品板。将待测量的感兴趣组织区域定义得略大于实际组织切片，以同时包含仅含有基质的区域。
    4. 校准仪器，并在200 - 3200范围内采集光谱 m/z 调整质荷比范围以涵盖目标神经肽的质荷比区间。
  3. 数据分析
    1. 要处理数据，需将质谱成像数据集导入所需软件，选择基线扣除算法，并使用以下方法对数据进行归一化： 总离子计数.
      注意：可选择不同的归一化算法，例如中位数、均方根（RMS）值或参考信号的强度 m/z 值，可能会改变许多物质的空间分布 m/z 数值。选择最适合目标分析物的归一化算法。
    2. 为每张生成图像 m/z 从理论峰列表中获取数值，上传一个包含神经肽 [M+H] 的逗号分隔值（CSV）文件+，[M+Na]+，[M+NH4]+等。获取 m/z 通过点击数值 文件 > 导入 > 峰列表命名峰列表。
    3. 为估算合适的 ppm 误差阈值，首先在质谱图中手动识别一个神经肽峰，并将其与神经肽的理论质量进行比较。计算 ppm 误差，然后单击 文件 > 文件属性 > 区间宽度 并输入 ppm 误差。
    4. 从下拉菜单中选择峰列表并点击 创建 m/z 峰值列表中每个区间的图像.
    5. 保存每一个 m/z 点击图片 保存每张截图 m/z 图像.
      ​注意：可通过鉴定潜在的神经肽来实现其假定性鉴定 m/z 分析物信号仅定位于组织内而不存在于周围基质中的图像。
    6. 为验证峰的身份，生成一份列表 m/z 感兴趣的目标并进行串联质谱（MS/MS）实验。

4. 利用假定新神经肽的发现 从头合成 测序

  1. 执行步骤 1.4.2 - 1.4.5。
  2. 从 PEAKS 软件导出 de novo 只有肽段的.csv文件 局部置信度平均值（ALC）评分 ≥ 75.
    注意：有许多软件可用于执行 从头合成 测序，每种方法都有其独特的评分算法，应据此进行评估。
  3. 在肽序列列表中搜索已知的序列基序，以识别属于特定神经肽家族的神经肽19.
    ​注意：尽管基序在不同物种间通常高度保守，但所搜索的基序应根据样本生物进行选择。

5. 预测神经肽序列的转录组挖掘

注意：此步骤为可选步骤，仅用于向现有的神经肽数据库中添加内容或构建新的神经肽数据库。

  1. 选择一个已知的前体激素氨基酸序列，并使用 tBLASTn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome）将该前体激素查询序列与包括 nr/nt、Refseq_genomes、EST 和 TSA 在内的数据库进行比对。
    注意：若要将查询序列与蛋白质数据库进行比对，请使用 BLASTp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn）。
    1. 选择目标生物体（分类编号），并将期望值阈值算法参数更改为1000，以包含低分比对结果。
    2. 运行BLAST程序，然后检查查询序列与目标序列之间具有高同源性得分的显著比对结果。保存包含核苷酸序列的 FASTA 文件。
      注意：如果多个目标序列具有相似的同源性得分，可进行 MAFFT 比对以缩小候选序列范围20,21。
  2. 使用Expasy Translate工具（https://web.expasy.org/translate/）将前体激素核苷酸序列翻译为前体激素肽序列。对于 C. sapidus，选择无脊椎动物线粒体遗传密码。
  3. 使用SignalP（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）检查肽序列中的信号肽序列和前体激素切割位点。 
    注意：也可利用与已知前体激素加工模式的同源性来识别前体激素切割位点。如有需要，可预测信号肽可能发生的翻译后修饰。可使用 Sulfinator（https://web.expasy.org/sulfinator/）预测酪氨酸残基的硫酸化状态，使用 DiANNA（http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/）预测二硫键连接方式。

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结果

样品制备和质谱分析的工作流程如图1所示。在分离神经组织后，进行匀浆、提取和脱盐以纯化神经肽样品。如果需要基于同位素标记的定量分析，则对样品进行标记并再次脱盐。最终得到的样品通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行神经肽的鉴定与定量分析。

通过蛋白质组学软件鉴定的神经肽应具有良好的肽段碎片序列覆盖率，但目前这一标准尚未在全球范围内明确定义或标准化。对于绝对鉴定，每个氨基酸都应产生一个能够提供明确鉴定和定位信息的碎片离子。此外，还必须与合成肽段进行比对，以确认各个碎片离子的强度。由于对每一个假定的鉴定结果均进行此类验证的成本过高而不可行，因此通常根据置信度来描述鉴定结果，即观测到的碎片离子越多，肽段鉴定的置信度越高。尽管图2A、B所示的两个神经肽均具有100%的序列覆盖率，并且质量误差低于设定的0.02 Da最大限值，但仅基于三个碎片离子所获得的较差碎片覆盖率（仅见于图2B

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讨论

准确鉴定、定量和定位神经系统中发现的神经肽和内源性肽对于理解其功能至关重要23,24。质谱技术是一种强大的分析方法，即使在基因组尚未完全测序的生物体中，也能实现上述目标。本方案展示了通过LC-ESI-和MALDI-MS联用，对从C. sapidus组织中采集的样本进行神经肽的检测、定量和定位的能力。

在进行 LC-ESI-MS 分析的样品制备过程中，必须考虑若干因素。尽管质谱（MS）是一种灵敏的技术，但神经组织中肽的浓度极低（可低至飞摩尔级别25），这构成了严重限制。必须谨慎进行样品制备，不仅要去除更丰富且具有干扰性的基质成分（如蛋白质和脂质），还需在每一步骤中尽量减少神经肽的损失26,27。例如，可通过使用抗肽吸附的微量离心管来减少样品损失。根据目标组织的组成，可采用不同的溶剂（用于...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国国家科学基金会（CHE-1710140 和 CHE-2108223）以及美国国立卫生研究院（NIH）R01DK071801 项目资助。A.P. 部分受 NIH 化学-生物学交叉领域培训项目（T32 GM008505）支持。N.V.Q. 部分受美国国立卫生研究院资助，该资助为国家心肺血液研究所向威斯康星大学麦迪逊分校心血管研究中心颁发的露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖（T32 HL007936）。L.L. 感谢 NIH 提供的 R56 MH110215、S10RR029531 和 S10OD025084 项目资助，同时也感谢威斯康星校友研究基金会和威斯康星大学麦迪逊分校药学院提供的资金支持，包括维拉斯杰出成就教授职位和查尔斯·墨尔本·约翰逊教授职位。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学品、试剂和耗材
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质Supelco39319
乙酸Fisher ChemicalA38S-500
乙腈 Optima LC/MS 级Fisher ChemicalA955-500
碳酸氢铵Sigma-Aldrich9830
硼烷吡啶Sigma-Aldrich179752
Bruker 肽段校准混合物布鲁克道尔顿NC9846988
毛细管Polymicro1068150019制作纳流色谱柱（75 µm 内径 × 360 µm 外径）
冷冻切片机杯Sigma-AldrichE6032任何杯子或模具均可使用
 微量离心管Eppendorf30108434
甲醛Sigma-Aldrich252549
甲醛 - D2Sigma-Aldrich492620
甲酸 Optima LC/MS 级Fisher ChemicalA117-50
明胶Difco214340置于37 °C 水浴以融化
疏水屏障笔Vector Labs15553953
氧化铟锡（ITO）涂层玻片Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm × 75 mm × 0.8 mm（宽 × 长 × 厚）
LC-MS 小瓶赛默飞世尔科技TFMSCERT5000-30LVW
甲醇 Optima LC/MS 级Fisher ChemicalA456-500
ParafilmSigma-AldrichP7793疏水膜
pH 指示试纸Supelco109450
红磷团簇Sigma-Aldrich343242
反相C18材料Waters186002350手动填充至纳流色谱柱
修正液笔BIC150810
ZipTipMilliporeZ720070
仪器与工具
自动基质喷雾系统 - M5HTX Technologies, LLC
离心机 - 5424 REppendorf05-401-205
冷冻切片机- HM 550赛默飞世尔科技956564A
干燥剂Drierite2088701
镊子WPI501764
MALDI 不锈钢靶板布鲁克道尔顿8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391200 µL
Q Exactive Plus 混合四极杆-轨道阱赛默飞世尔科技IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF布鲁克道尔顿
SpeedVac - SVC100SavantSVC-100D
超声波清洗器Bransonic2510R-MTH用于超声处理
超声波均质器Fisher ScientificFB120110FB120 超声波破碎仪配 CL-18 探头
真空泵 - Alcatel 2008 A理想真空产品P10976极限压力 = 1 × 10-4 托尔
涡旋混合器康宁6775
水浴锅（37°C）— Isotemp 110Fisher Scientific15-460-10
数据分析软件
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis布鲁克道尔顿
FlexControl布鲁克道尔顿
FlexImaging布鲁克道尔顿
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Labhttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&&BLAST_
程序=tblastn&PAGE_
类型=序列比对搜索&和
默认=开启&LINK_LOC
=blasthome

参考文献

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292(2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60(2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207(2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697(2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948(2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734(2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333(2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

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神经肽表征质谱分析内源性肽基质辅助激光解吸电离质谱液相色谱质谱肽定量组织提取生物标志物发现从头测序
Callinectes sapidus 中神经肽的多维度质谱分析
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