本方案描述了如何从猪肾和小鼠肝脏中提取含延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白1（FAHD1）。所列出的方法可针对其他感兴趣的蛋白质进行调整，并可根据其他组织类型进行修改。
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本文内容
摘要
摘要
富马酰乙酰乙酸水解酶结构域包含蛋白1（FAHD1）是真核生物中FAH超家族首个被鉴定的成员，在线粒体中发挥草酰乙酸脱羧酶的功能。本文介绍了一系列从猪肾和小鼠肝脏中提取与纯化FAHD1的方法，包括快速蛋白液相色谱（FPLC）离子交换层析、FPLC制备型与分析型凝胶过滤层析，以及蛋白质组学方法。在完成总蛋白提取后，依次采用硫酸铵沉淀和离子交换层析对FAHD1进行分离提取 通过 一种利用离子交换和尺寸排阻色谱的连续策略。该代表性方法可适用于其他表达水平较高的目标蛋白，并可针对其他组织进行优化。从组织中纯化获得的蛋白可用于开发高质量的抗体，以及高效且特异的药理学抑制剂。
引言
真核生物中含FAH结构域的蛋白1（FAHD1）具有双重功能，可作为草酰乙酸（OAA）脱羧酶（ODx）1和酰基丙酮酸水解酶（ApH）2。该蛋白定位于线粒体2，属于广泛的FAH酶超家族1,2,3,4,5,6。尽管其ApH活性仅具次要意义，但FAHD1的ODx活性参与调控三羧酸循环（TCA循环）的通量1,7,8,9。草酰乙酸不仅在三羧酸循环中的关键柠檬酸合酶反应中必需，还可作为电子传递系统中琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，并作为出线粒体代谢物（cataplerotic metabolite）。在人脐静脉内皮细胞（....
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方案
所有实验均按照机构指南进行。猪肾购自当地超市，新鲜获取。肝脏组织取自维也纳大学生物医学衰老研究所（奥地利因斯布鲁克，Rennweg 10，6020 因斯布鲁克）在 Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr 监督下饲养的 C57BL6 野生型小鼠，该项目负责人于 2013 年获得伦理许可（BMWF-66.008/0007-II/3b/2013）。小鼠的饲养及本项目中的使用均受奥地利教育、科学与研究部（BMBWF）于 2020 年 5 月 5 日签发的伦理许可编号 2020-0.242.978 的监管。
1. 准备工作
注意：在开始实验方案之前，需要准备若干材料，包括蛋白裂解缓冲液、粗组织样品和特异性抗体，以及常规化学品和耗材。
- 每 100 克组织净重配制 250 mL 蛋白裂解缓冲液：将 50 mM NaF、1 mM PMSF、2 µg/mL 抑肽酶和 1 mM 活化正钒酸盐加入 250 mL 1× PBS 中（见表 1）。使用 0.22 µm 注射器滤器对溶液进行过滤。
注意：正钒酸盐在使用前需进行活化，以转化为更有效的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂18。活化正钒酸盐可从商业供应商处获得，也可按以下方法自行制备。- 在 ddH
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结果
FAHD1 蛋白采用本方案从猪肾和小鼠肝脏中提取。对于小鼠组织，需要多个器官以获得数毫克的蛋白 µg 在最终纯化步骤之后。因此，本文重点介绍从猪肾脏中提取FAHD1的方法，这是一个更具代表性的实验。从小鼠肝脏中提取FAHD1的操作旨在展示本方案可能遇到的困难与潜在问题。通常建议使用目标蛋白表达水平较高的组织器官进行纯化。人类蛋白质图谱22 可能有助于在模型系统中估算表达水平，或者可以使用不同的粗组织裂解液进行初步的蛋白质印迹实验以评估这些表达水平。所有蛋白质印迹分析中使用的阳性对照均为一种带标签的重组蛋白，其分子量略高。
作为首次实验，展示了从猪肾脏中提取FAHD1的过程。组织匀浆（步骤1）和总蛋白提取（步骤2）的过程见补充图1（各步骤的说明见图注）。后续实验使用了总裂解液的十分之一 aliquot。
对该裂解液进行了一次硫酸铵沉淀实验，通过将硫酸铵以不同浓度加入裂解液中（步骤4）（图2
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讨论
实验方案中的关键步骤
必须遵循蛋白质操作的通用准则，例如在冰上操作，并保持适中的 pH 和盐浓度条件。使用蛋白酶抑制剂有助于该方法的实施，而强烈建议使用蛋白酶体抑制剂。反复冻融样品可能导致蛋白质沉淀（至少部分沉淀），因此初始蛋白裂解液（步骤 2）的任何解冻分装样品都应连续处理，不得中断。通常建议在解冻后进行离心和过滤，以去除微小沉淀物。
从组织中获得的初始蛋白裂解液仍含有大量非蛋白质成分。可使用离子交换层析柱对裂解液进行澄清。即使目标提取蛋白不与离子交换柱结合，流出液通常也比上样溶液更澄清，便于后续步骤处理。这一点在从小鼠肾脏中提取FAHD1的过程中得到了验证（见图5A）。
方法的局限性与改进
本方案描述了一种从组织中提取FAHD1的实验方法。基于该策略，可衍生出从其他组织中提取FAHD蛋白（FAHD1、FAHD2）的通用方法，但个别情况可能需要进行特定调整。该方法的内在限制在.......
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
作者非常感谢艾丝·厄兹图尔克（Ayse Öztürk）和伊娃·阿尔贝蒂尼（Eva Albertini）提供的技术协助。用于生成肝组织的小鼠由奥地利因斯布鲁克大学生物医学衰老研究所（地址：奥地利因斯布鲁克市伦韦格10号，邮编6020）的皮德·詹森-杜尔大学副教授兼博士（Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr）负责监管饲养。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 滤器单元 | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP，0.22 µm，PES 33 mm，非无菌 |
| 0.45 µm 滤器单元 | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP，0.45 µm，PES 33 mm，非无菌 |
| 15 mL Falcon 管 | VWR | 734-0451 | 离心管 |
| 50 mL Falcon 管 | VWR | 734-0448 | 离心管 |
| 96 孔紫外微孔板 | Thermo-Fischer | 8404 | 紫外/可见光透明平底 96 孔板 |
| 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（40%，29:1 比例） | BIO-RAD | #1610147 | 用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，29:1（3.3% 交联剂） |
| ÄKTA FPLC 系统 | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | - | 使用 GE Healthcare 的 FPLC 系统；存在多种定制版本；本研究使用的是 "ÄKTA pure" 系统 |
| Amicon Ultra-15，PLGC Ultracel-PL 膜，10 kDa | MERCK | UFC901024 | 用于蛋白质富集的离心过滤器；10 kDa 分子量截留值；15 mL |
| Amicon Ultra-4，PLGC Ultracel-PL 膜，10 kDa | MERCK | UFC801024 | 用于蛋白质富集的离心过滤器；10 kDa 分子量截留值；4 mL |
| 硫酸铵粉末 | MERCK | A4418 | 分子生物学级硫酸铵，≥99.0% |
| 过硫酸铵，试剂级，98% | MERCK | 215589 | 丙烯酰胺凝胶聚合的催化剂 |
| 考马斯亮蓝 R 250 | MERCK | 1125530025 | 用于电泳的考马斯亮蓝 R 250（C.I. 42660），Imperial Chemical Industries PLC 商标，CAS 6104-59-2，pH 6.2（10 g/L，H2O，25 °C） |
| 透析管纤维素膜 | MERCK | D9277 | 用于通过透析交换缓冲液的纤维素膜 |
| Eppendorf 管 1.5 mL | VWR | 525-1042 | 微量离心管；已高压灭菌 |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg 预装柱适用于重组蛋白的高分辨率凝胶过滤层析 |
| Immun-Blot PVDF 膜 | BIO-RAD | #1620177 | PVDF 膜是为荧光及多重荧光应用优化的蛋白质印迹膜 |
| Mini Trans-Blot 电泳转移装置 | BIO-RAD | #1703930 | 使用 Mini Trans-Blot 装置可快速转印 Mini-PROTEAN 预制胶和手工灌胶 |
| Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（用于 Mini 预制胶） | BIO-RAD | #1658004 | 四块胶的垂直电泳系统，包含电极组件、配套运行模块、电泳槽、带电源线的盖子以及微型电泳槽缓冲液挡板 |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q 柱为强阴离子交换层析柱，用于蛋白质分析或小规模高分辨率纯化 |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S 柱为强阳离子交换层析柱，用于蛋白质分析或小规模高分辨率纯化 |
| PageRuler 预染蛋白 Marker，10 至 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | 由 10 种蓝色、橙色和绿色染色的蛋白质（10 至 180 kDa）组成的混合物，用作蛋白质电泳（SDS-PAGE）和 Western 印迹中的分子量标准 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo-Fischer | 23225 | 一种双组分、高精度、兼容去垢剂的蛋白定量检测方法，用于测定蛋白质浓度 |
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参考文献
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al.
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