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方法文章

利用钙成像技术可视化神经元-胶质细胞环路中的动态变化

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DOI：

10.3791/63338

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2022年4月8日

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1Laboratory of Neurochemistry, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Laboratory of Neuroenergetics and Inborn Errors of Metabolism, Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Laboratory of Neurochemistry and Cell Biology, Institute of Life Sciences, Universidade Federal da Bahia

本文内容

摘要

细胞钙成像是一种多功能方法，可用于研究培养物中混合细胞群体甚至清醒动物个体细胞的动态信号传导，该方法基于钙通透性通道/受体的表达，从而产生独特的功能特征。

摘要

本文报道了基于胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）和/或外周组织（背根神经节）及中枢组织（皮层、脑室下区、类器官）来源的神经元的体外选择性环路模型，这些模型通过钙离子动态变化进行动态研究。为展示研究结果，我们选用视网膜作为模型，视网膜是一种结构简单但具有复杂细胞相互作用的组织。钙离子是参与大多数重要细胞功能的通用信使。我们以逐步操作方案的形式，详细说明如何制备和评估培养中的视网膜神经元-胶质细胞，并观察其钙离子变化。在该模型中，我们依据细胞对KCl和ATP的选择性反应，区分神经元与胶质细胞。钙离子通透性受体和通道在不同细胞区室中选择性表达。为分析钙离子反应，我们采用比率型荧光染料如Fura-2。该探针通过检测Ca2+游离态与Ca2+结合态在两种不同波长下的荧光强度，形成两个不同的吸收峰，从而定量细胞内游离Ca2+浓度。

引言

由于钙离子作为第二信使具有普遍的特性，该离子参与了大量信号传导活动：基因转录、细胞生死、增殖、迁移与分化、突触传递以及可塑性。因此，一种能够准确且灵敏地追踪钙离子活化动态的方法，将有助于观察独特的时空响应。这种方法即细胞钙成像技术，它根据细胞特有的响应模式，将钙离子变化的功能数据与特定的细胞表型相关联。

Ca2+ 探针最早于20世纪80年代开发，后续的改进使其可用于活细胞检测1。作为一种化学指示剂，Fura-2 被认为是定量测定细胞内[Ca2+]i的金标准。该指示剂的乙酰氧基甲酯形式（即 Fura-2 AM）可轻易穿透细胞膜，达到比孵育稀释浓度高20倍的细胞内浓度（例如，[5 µM]o/[100 µM]i）。Fura-2 的另一个优势是具有良好的抗光漂白性能；因此，长时间成像不会显著影响其荧光能力。最后，Fura-2 对较宽范围的钙浓度具有敏感性，从约100 nM到约100 µM，其解离常数Kd约为145 nM，与静息状态下的[Ca2+]i2相当。随后，随着更先进的荧光显微镜、计算方法以及不受染料加载影响的比率型探针的发展，细胞钙成像技术得以进一步提升。

每种细胞都表达不同的钙信号装置（泵、转运蛋白、受体和通道），这些装置共同作用，形成具有特征性的最终反应。关键在于发现不同类型细胞的特异性反应，并将其与细胞的表型表达相关联。因此，至少存在两类通过钙离子转移发挥作用的受体：一类是快速通透 Ca2+ 的离子型受体；另一类是代谢型受体，其通过信号通路和细胞内钙库发挥作用，由第二信使（如三磷酸肌醇和环腺苷二磷酸核糖）激活释放 Ca2+3。

例如，前体细胞在未成熟视网膜中表达巢蛋白（nestin），并表现出由γ-氨基丁酸（GABA）或蝇蕈醇（muscimol）引起去极化的GABAA受体4。这是由于细胞内氯离子（Cl-）浓度较高，形成特定的Cl−电化学梯度所致；随着组织发育，KCC2转运蛋白的作用使GABA对前体细胞的兴奋性效应转变为对成熟GABA能神经元的抑制性效应5。另一方面，在出生后啮齿类动物未成熟的脑室下区（SVZ）表达sox-2的干细胞也具有代谢型H1受体，组胺可激活该受体并缓慢升高细胞内Ca2+浓度6。另一种属于蛋白酶激活受体-1（PAR-1）家族的代谢型受体，可被凝血酶激活，并通过G(q/11)和磷脂酶C（PLC）通路介导，引起源自多能性SVZ神经干细胞的少突胶质细胞（表达O4和PLP）产生缓慢的Ca2+变化7。

通常，神经元表达电压依赖性钙通道以及对 Ca2+ 通透的主要神经递质受体，如谷氨酸能受体（AMPA、NMDA、红藻氨酸）以及外周和中枢的烟碱型受体。氯化钾通常用作去极化剂，以激活外周神经元（如背根神经节神经元8）或中枢神经元（如来自脑室下区9或视网膜10的神经元）。另一方面，ATP 被公认为主要的胶质递质（除 D-丝氨酸外），可激活对 Ca2+ 通透的特定 P2X 受体亚型，如 P2X7 和 P2X4。这两种受体产生的 Ca2+ 电流相当，类似于被公认为由递质激活的最大 Ca2+ 电流的 NMDA 受体11。P2X7 受体在小胶质细胞中高表达，而在星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达水平较低，并参与促炎性细胞因子的释放12。P2X7 受体也在施万细胞13以及视网膜中的 Müller 胶质细胞上表达14,15。

视网膜已知几乎表现出大脑中所见的所有神经递质。例如，垂直通路（光感受器、双极细胞和视网膜神经节细胞）主要为谷氨酸能性，其中OFF型双极细胞表达钙通透性AMPA或海人藻酸受体，ON型双极细胞表达mGluR6受体16。有趣的是，这三种受体也均存在于Müller胶质细胞中，而Müller胶质细胞与钙信号和三磷酸肌醇通路相偶联17,18。由水平细胞和无长突细胞构成的横向抑制通路不仅分泌GABA，还分泌多巴胺、乙酰胆碱及其他经典神经递质。无长突细胞是禽类视网膜培养物中主要的细胞类型，表现出多种钙离子调控通道，包括谷氨酸能、嘌呤能、烟碱型及电压依赖性钙通道。因此，该模型是研究神经元与胶质细胞之间钙离子动态变化不同特性的理想体系。

因此，在发育过程中，不同受体和通道与特定表型标志物的组合，以及其独特的激动剂反应模式，使得干细胞、前体细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞具有通过特定信号装置发挥作用的独特特征。

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方案

所有涉及动物的实验均经里约热内卢联邦大学机构动物护理与使用委员会批准，并遵循该委员会的指导方针进行 "实验室动物护理原则" （美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院）；受精白来航鸡卵的许可编号为IBCCF-035。

1. 溶液的配制

  1. 配制 Krebs 溶液：（132 mM NaCl、4 mM KCl、1.4 mM MgCl2、2.5 mM CaCl2、6 mM 葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.4，373 mOsm）。
  2. 配制盐水缓冲液（无 Ca2+ 和 Mg2+ 溶液，CMF）：76.55 g/L NaCl、3.05 g/L KCl、1.65 g/L Na2HPO4、0.610 g/L KH2PO4、21.95 g/L 葡萄糖和 7.90 g/L NaHCO3。
  3. 配制孵育溶液（含 Fura-2 的 Krebs 溶液）：5 µM Fura-2-乙酰氧基甲酯（Fura-2）、0.1% 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）和 0.02% Poloxamer 407。
  4. 对于混合细胞群体或胶质细胞培养，使用含 10% 胎牛血清（FCS）和 40 mg/L 庆大霉素的 DMEM/F12 作为培养基。
  5. 对于神经元富集培养，使用含 1% FCS、神经细胞培养添加剂和 40 mg/L 庆大霉素的 DMEM/F12 作为培养基。

2. 视网膜解剖与细胞培养制备

  1. 打开8日龄鸡胚（E8）的蛋，定位气室位置。
  2. 将蛋内容物移至培养皿中，使用镊子进行断头法处死胚胎。
  3. 将头部转移至洁净的培养皿中，并加入适量无钙无镁溶液（CMF）清洗。
  4. 小心摘除眼球，注意过程中不要损伤组织。
    注意：在从眼窝中取出眼球时，应尽量避免切割或撕裂眼球各层结构。
  5. 将眼球转移至另一含有CMF的洁净培养皿中。
  6. 开始眼球解剖，首先去除晶状体。
  7. 从晶状体留下的孔洞开始，在眼球上做3至4条纵向切口。操作时用镊子分别夹住巩膜相对两侧，向相反方向牵拉完成切开。
  8. 小心移除透明的玻璃体，确保视网膜未与其粘连。
  9. 将视网膜从色素上皮层上分离，并清除残留组织。
  10. 将透明的视网膜切成小块。
  11. 将视网膜转移至另一容器中，短暂离心（约1,800 × g，1分钟）以去除CMF。
  12. 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 °C条件下孵育10分钟，对视网膜进行酶解消化。
  13. 加入1 mL含10%胎牛血清（FCS）的培养基终止反应。
  14. 用培养基洗涤视网膜2至3次，每次加入培养基后通过离心（约1,800 × g，1分钟）去除上清。
  15. 每份视网膜加入2 mL完全培养基，通过轻柔吹打进行机械解离。
    注意：在此步骤中，研究者可选择所需的培养类型。若需富集神经元培养，使用DMEM-F12 + 神经元补充剂 + 1% FCS + 抗生素；若需混合细胞群体或纯化胶质细胞培养，则使用DMEM-F12 + 10% FCS + 抗生素。
  16. 计数细胞并稀释至所需密度。
    注意：理想情况下应为低密度培养，细胞数量约为2 × 106个或更少。
  17. 向每张盖玻片上加入50 µL细胞悬液。
  18. 盖玻片处理
    1. 将盖玻片在37 °C条件下，用1 mL含10–50 µg/mL多聚赖氨酸（poly-L-lysine）的无菌纯化水溶液中孵育至少1小时（理想为过夜）。
    2. 移除多聚赖氨酸溶液，并用无菌纯化水清洗盖玻片2–3次。
    3. 将盖玻片置于开启紫外灯的安全柜中晾干。此后可将其密封保存于4 °C环境中，最长可保存1个月。
    4. 可选步骤：对于神经元富集培养，可在每张盖玻片上加入50 µL含10–20 ng/mL层粘连蛋白（laminin）的PBS或培养基溶液，在37 °C孵育2小时。孵育结束后去除多余层粘连蛋白溶液，盖玻片即可使用。
  19. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育，直至其贴附于玻璃表面，通常需要1–2小时。
  20. 向每个孔中加入1 mL完全培养基，将培养板放回培养箱继续培养至实验当天。必要时，每隔2–3天更换一次培养基。

3. 使用 Fura-2 AM 负载细胞

  1. 用 50 µL DMSO 重悬一支 50 µg 的 Fura-2 AM 小瓶。
  2. 配制工作用 Fura-2 AM 溶液时，加入 3 µL 10% Poloxamer 407、7.5 µL 溶于 DMSO 的 Fura-2 AM，并用 Krebs 溶液定容至 1.5 mL。
  3. 将混合液在水浴中超声处理 7 分钟。
  4. 在将盖玻片用于 Fura-2 孵育前，用 Krebs 溶液洗涤细胞培养样本 3 次。
  5. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
  6. 孵育结束后，再次洗涤 3 次，并转移至另一含有 Krebs 溶液且避光的容器中。
    ​注意：工作用 Fura-2 AM 溶液若避光保存，可保持稳定达 24 小时。

4. 细胞钙成像

  1. 每次运行前，在盖玻片支架和腔室上添加硅胶，以防止实验过程中发生泄漏。
  2. 用蒸馏水清洗盖玻片底部，避免盐结晶沉积在显微镜物镜上。
  3. 将盖玻片放置在支架上，轻轻按压边缘。
  4. 将支架和腔室固定到显微镜上，并开始用Krebs溶液灌注细胞。
    注意：单细胞钙成像实验中的细胞灌注流速校准为0.5 mL/min，平台内溶液完全更换需要8-10秒。
  5. 观察细胞，并选择合适的视野。
  6. 根据细胞独特的形态特征手动选择细胞体。
  7. 施加任何刺激前，需等待基线稳定。每次刺激持续时间约为30秒。
    ​注意：所有溶液应在每次实验前立即配制。
  8. 通过定量分析在340 nm和380 nm交替激发（每次激发750毫秒）后于510 nm发射的荧光强度比值，评估[Ca2+]i的变化。
  9. 使用荧光分析软件处理所获得的数据。
  10. 以表格形式呈现实验结果，其中每一行代表一个单独的细胞，每一列代表一个时间点。

5. 数据处理

  1. 使用电子表格软件，分别或同时绘制单个细胞或所有细胞的 Fura-2 荧光比值变化。
  2. 为量化对特定刺激产生反应的细胞数量，将钙基线水平增加 30% 设为阈值。

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结果

本研究采用孵化第8天的鸡胚视网膜细胞培养物，以研究神经元和胶质细胞在钙离子动态变化方面的信号传导机制。细胞培养方法基本如文献所述15,19，制备成混合的神经元-胶质细胞培养物（密度 ≥ 1 × 106 个细胞/皿），体外培养7天后进行实验（图1A）。另外，还制备了低密度（5 × 105 个细胞/皿）的富集神经元细胞，接种于经多聚-L-赖氨酸（10 µg/mL）处理的盖玻片上，体外培养3天后使用（图1B）。此外，在去除神经元后，纯化的穆勒胶质细胞（Müller glia）在含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中维持培养10天。为定量评估神经元和胶质细胞的功能性反应，使用50 mM KCl或1 mM ATP对细胞进行刺激。如图所示（图1A），在302个细胞中，50%对KCl产生反应，53%对ATP产...

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讨论

我们利用视网膜组织证明，由KCl或ATP介导的钙反应分别明确地定位于神经元和胶质细胞中（图1）。尽管文献中一些数据表明P2X7受体在神经元中表达，并可调节神经元活性和突触神经递质释放20，但其他研究者对神经元中是否存在P2X7受体提出质疑。事实上，目前的研究结果支持这一观点：在病理组织中，当细胞外ATP浓度显著升高时，主要由胶质细胞上的P2X7受体介导对神经元的影响21。

我们先前已将视网膜细胞的功能分化与其表型表现相关联，具体表现为：由KCl或AMPA（一种谷氨酸激动剂）激活的[Ca2+]i变化可表达微管相关蛋白（MAP-2），即成熟神经元的标志物1。相反，由ATP激活的细胞则表达谷氨酰胺合成酶，这是典型的Müller胶质细胞标志物。

我们已使用多种类型的细胞培养，如图所示（混合培养、富集神经元或纯化的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

基金、赞助商及资助来源：MH 获得巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）博士奖学金资助。HRF 获得由巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）资助的博士后奖学金（HRF 项目编号 152071/2020-2）。RAMR 获得巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）和里约热内卢州科研资助基金会（FAPERJ）的支持（项目编号 E-26/202.668/2018、E-26/010.002215/2019、426342/2018-6 和 312157/2016-9）以及国家转化神经科学研究所（INCT-INNT）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mm 盖玻片Paul Marienfeld GmbH & Co. KG111550细胞支持
510 nm 长通滤光片卡尔·蔡司
ATPSigmaA1852
B-27 补充剂Gibco17504044补充剂
CaCl2Sigma-AldrichC8106
CoolSNAP 数字相机Roper Scientific，新泽西州特伦顿
D-(+)-葡萄糖霓虹1466
DMEM/F-12Gibco12400-24细胞培养基
Excel 软件微软
胎牛血清Sigma-AldrichF9665补充剂
荧光显微镜Axiovert 200；Carl ZeissB 40-080
Fura-2 AM分子探针F1221比率法钙成像2+ 指示剂
硫酸庆大霉素Calbiochem1405-41-0抗生素
HEPESSigmaH4034
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Lambda DG-4装置Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州DG-4PLUS/OF30
层粘连蛋白Gibco23017-015促进细胞黏附
Metafluor 软件Universal Imaging Corp.，美国宾夕法尼亚州西切斯特
MgCl₂2SigmaM4880
Na2HPO4Vetec129
NaCl异佛尔310
NaHCO₃3Vetec306
PH3 平台Warner Instruments，康涅狄格州哈姆登64-0286
Pluronic F-127分子探针P6866非离子型表面活性剂
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP8920促进细胞黏附
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056解离酶

参考文献

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