利用钙成像技术可视化神经元-胶质细胞环路中的动态变化

摘要

细胞钙成像是一种多功能方法，可用于研究培养物中混合细胞群体甚至清醒动物个体细胞的动态信号传导，该方法基于钙通透性通道/受体的表达，从而产生独特的功能特征。

摘要

本文报道了基于胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）和/或外周组织（背根神经节）及中枢组织（皮层、脑室下区、类器官）来源的神经元的体外选择性环路模型，这些模型通过钙离子动态变化进行动态研究。为展示研究结果，我们选用视网膜作为模型，视网膜是一种结构简单但具有复杂细胞相互作用的组织。钙离子是参与大多数重要细胞功能的通用信使。我们以逐步操作方案的形式，详细说明如何制备和评估培养中的视网膜神经元-胶质细胞，并观察其钙离子变化。在该模型中，我们依据细胞对KCl和ATP的选择性反应，区分神经元与胶质细胞。钙离子通透性受体和通道在不同细胞区室中选择性表达。为分析钙离子反应，我们采用比率型荧光染料如Fura-2。该探针通过检测Ca²⁺游离态与Ca²⁺结合态在两种不同波长下的荧光强度，形成两个不同的吸收峰，从而定量细胞内游离Ca²⁺浓度。

引言

由于钙离子作为第二信使具有普遍的特性，该离子参与了大量信号传导活动：基因转录、细胞生死、增殖、迁移与分化、突触传递以及可塑性。因此，一种能够准确且灵敏地追踪钙离子活化动态的方法，将有助于观察独特的时空响应。这种方法即细胞钙成像技术，它根据细胞特有的响应模式，将钙离子变化的功能数据与特定的细胞表型相关联。

Ca²⁺ 探针最早于20世纪80年代开发，后续的改进使其可用于活细胞检测¹。作为一种化学指示剂，Fura-2 被认为是定量测定细胞内[Ca²⁺]_i的金标准。该指示剂的乙酰氧基甲酯形式（即 Fura-2 AM）可轻易穿透细胞膜，达到比孵育稀释浓度高20倍的细胞内浓度（例如，[5 µM]_o/[100 µM]_i）。Fura-2 的另一个优势是具有良好的抗光漂白性能；因此，长时间成像不会显著影响其荧光能力。最后，Fura-2 对较宽范围的钙浓度具有敏感性，从约100 nM到约100 µM，其解离常数K_d约为145 nM，与静息状态下的[Ca²⁺]_i²_相当。随后，随着更先进的荧光显微镜、计算方法以及不受染料加载影响的比率型探针的发展，细胞钙成像技术得以进一步提升。

方案

所有涉及动物的实验均经里约热内卢联邦大学机构动物护理与使用委员会批准，并遵循该委员会的指导方针进行 "实验室动物护理原则" （美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院）；受精白来航鸡卵的许可编号为IBCCF-035。

1. 溶液的配制

1. 配制 Krebs 溶液：（132 mM NaCl、4 mM KCl、1.4 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂、6 mM 葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.4，373 mOsm）。
2. 配制盐水缓冲液（无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 溶液，CMF）：76.55 g/L NaCl、3.05 g/L KCl、1.65 g/L Na₂HPO₄、0.610 g/L KH₂PO₄、21.95 g/L 葡萄糖和 7.90 g/L NaHCO₃。
3. 配制孵育溶液（含 Fura-2 的 Krebs 溶液）：5 µM Fura-2-乙酰氧基甲酯（Fura-2）、0.1% 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）和 0.02% Poloxamer 407。
4. 对于混合细胞群体或胶质细胞培养，使用含 10% 胎牛血清（FCS）和 40 mg/L ....

结果

本研究采用孵化第8天的鸡胚视网膜细胞培养物，以研究神经元和胶质细胞在钙离子动态变化方面的信号传导机制。细胞培养方法基本如文献所述^15,19，制备成混合的神经元-胶质细胞培养物（密度 ≥ 1 × 10⁶ 个细胞/皿），体外培养7天后进行实验（图1A）。另外，还制备了低密度（5 × 10⁵ 个细胞/皿）的富集神经元细胞，接种于经多聚-L-赖氨酸（10 µg/mL）处理的盖玻片上，体外培养3天后使用（图1B）。此外，在去除神经元后，纯化的穆勒胶质细胞（Müller glia）在含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中维持培养10天。为定量评估神经元和胶质细胞的功能性反应，使用50 mM KCl或1 mM ATP对细胞进行刺激。如图所示（图1A），在302个细胞中，50%对KCl产生反应，53%对ATP产.......

讨论

我们利用视网膜组织证明，由KCl或ATP介导的钙反应分别明确地定位于神经元和胶质细胞中（图1）。尽管文献中一些数据表明P2X7受体在神经元中表达，并可调节神经元活性和突触神经递质释放²⁰，但其他研究者对神经元中是否存在P2X7受体提出质疑。事实上，目前的研究结果支持这一观点：在病理组织中，当细胞外ATP浓度显著升高时，主要由胶质细胞上的P2X7受体介导对神经元的影响²¹。

我们先前已将视网膜细胞的功能分化与其表型表现相关联，具体表现为：由KCl或AMPA（一种谷氨酸激动剂）激活的[Ca²⁺]i变化可表达微管相关蛋白（MAP-2），即成熟神经元的标志物¹。相反，由ATP激活的细胞则表达谷氨酰胺合成酶，这是典型的Müller胶质细胞标志物。

我们已使用多种类型的细胞培养，如图所示（混合培养、富集神经元或纯化的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mm 盖玻片	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	细胞支持
510 nm 长通滤光片	卡尔·蔡司
ATP	Sigma	A1852
B-27 补充剂	Gibco	17504044	补充剂
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP 数字相机	Roper Scientific，新泽西州特伦顿
D-(+)-葡萄糖	霓虹	1466
DMEM/F-12	Gibco	12400-24	细胞培养基
Excel 软件	微软
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F9665	补充剂
荧光显微镜	Axiovert 200；Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	分子探针	F1221	比率法钙成像2+ 指示剂
硫酸庆大霉素	Calbiochem	1405-41-0	抗生素
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4装置	Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州	DG-4PLUS/OF30
层粘连蛋白	Gibco	23017-015	促进细胞黏附
Metafluor 软件	Universal Imaging Corp.，美国宾夕法尼亚州西切斯特
MgCl₂2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	异佛尔	310
NaHCO₃3	Vetec	306
PH3 平台	Warner Instruments，康涅狄格州哈姆登	64-0286
Pluronic F-127	分子探针	P6866	非离子型表面活性剂
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P8920	促进细胞黏附
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056	解离酶